DH10B菌株感受态制备,电击转化及转化效率检测
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。
通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。
实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。
引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。
然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。
本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。
材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。
2. 培养基：LB培养基。
3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。
4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。
5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。
结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。
通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。
然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。
转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。
最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。
为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。
将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。
实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。
通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。
本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。
农杆菌电击感受态的制备_转化及验证
农杆菌电击感受态的制备，转化及验证1.制备农杆菌电转感受态(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。
(2)将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C, 220rpm震荡3-4小时，至OD600=0.8左右。
(3) 5000rpm离心5分钟，去上清。
(4) 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min.(5) 4'C, 5000rpm离心5分钟，去上清。
(6 加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C, 5000rpm离心5分钟，(7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/管)备用。
2 农杆菌感受态的电转化〔I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。
(2)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。
(3)马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28'C, 150rpm轻摇4-6小时。
(4)收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培养基平板上，28℃培养2-3天。
其实和大肠杆菌电转化差不多，只不过培养温度是28度，摇的时间长一些，还有就是链霉素和利福平两种抗生素要加上，目的是防止根癌脓杆菌自带质粒的丢失，不过具体要加哪些抗生素还得看你是那种根癌脓杆菌非常感谢我用的不是电转化是把茎和叶浸在农杆菌液里30秒..想知道为什么不是把菌液直接滴在土里?可以采用注射法导入农杆菌还有就是把植株取出放入侵染液中用真空渗透法导入感受态制备及转化方案二1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
DH10B大肠杆菌克隆菌株使用说明
DNA 的提取。 φ80dlacZ∆M15 marker 的存在使 DH10B 可用于蓝白斑筛选，
rpsL 赋予其链霉素抗性。对 DH10B 使用 LB，在 37℃有氧的环境下培养，
然后使用 30%的甘油保藏菌种，42℃热激处理可将质粒成功转入 DH10B
中 。
操作说明：
注 意 事 项 ： 1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放 置会导致菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行； 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能 正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来 电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧 状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-‐10%CO2 促 进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保 藏 条 件 ： -‐20℃保存（复溶液于 2-‐8℃保存） 保 藏 时 间 ： 2-‐10 年，应根据菌种状况及时转接
genomic DNA , both prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently
in DH10B）。recA1 和 endA1 的突变有利于插入 DNA 的稳定和高纯度质粒
DH10B 大肠杆菌克隆菌株
编号
名称
北京华越洋生物 NRR01180 DH10B 大肠杆菌克隆菌株
基 本 信 息 ：
电转化细胞制作及电转步骤
质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤实验原理：利用瞬间高压造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，有利于DNA 等大分子进入。
因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
109〜1010转化子M g DNA。
,-电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1.前夜接种受体菌（DH5a或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37 C 摇床培养过夜；2.取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37 C摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6 （约2.5-3 小时）；3.将菌液迅速置于冰上。
以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5m l离心管中，在冰上冷却10分钟；5.4C下3000g冷冻离心5分钟；6.弃去上清，加入1500^ l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7.4C下3000g冷冻离心5分钟8.弃去上清，加入750^ l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9.4C下3000g冷冻离心5分钟10.加入20^ l冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11 .立即使用或迅速置于-70 C超低温保存。
-质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤1.制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中加入250^ l Amp （100mg/ml） , 250 诉l X-gal （20mg/ml）, 25 l IPTG （200mg/ml）,混匀后倒入灭菌培养皿中；2.取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3.每管感受态细胞加入1^ l连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；4.电转化仪选择1800V作为输出电压；5.将要转化的混合物加入预冷的 1 mm的电转化杯中，立即按下按纽电击；6.立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞；7.将细胞转入合适的培养管中37C培养1小时；8.吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板；9.37C培养过夜，观察结果。
细菌转化的实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌转化的基本原理和方法。
2. 熟悉电击法和热激法两种转化方法。
3. 学习如何筛选和鉴定转化子。
二、实验原理细菌转化是指将外源DNA分子导入细菌细胞内，使其获得新的遗传性状的过程。
转化过程包括：感受态细胞的制备、DNA分子的转化、转化子的筛选和鉴定。
三、实验材料1. 菌株：大肠杆菌DH5α感受态细胞。
2. 质粒载体：pUC19质粒。
3. 试剂：氯化钙（CaCl2）、无菌水、DNA分子量标准、琼脂糖、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA marker、LB培养基、抗生素（如氨苄青霉素）等。
4. 仪器：电击仪、电击杯、离心机、PCR仪、凝胶成像系统、培养箱等。
四、实验方法1. 感受态细胞的制备（1）将大肠杆菌DH5α感受态细胞接种于LB培养基，37℃培养过夜。
（2）取过夜培养的细菌，按1:100的比例加入无菌水，轻轻吹打混匀。
（3）将混匀的细菌溶液在冰浴中放置30分钟。
（4）4℃下以4000 r/min离心5分钟，弃上清。
（5）向沉淀中加入500 μL无菌水，轻轻吹打混匀。
（6）4℃下保存备用。
2. 电击转化（1）将pUC19质粒和感受态细胞按照1:1的比例混合，轻轻吹打混匀。
（2）将混合液转移到电击杯中。
（3）在电击仪上设置电压为2.5 kV，电容为25 μF，电阻为200 Ω。
（4）进行电击转化，时间约为5秒。
（5）将电击后的混合液立即加入到2 mL LB培养基中，混匀。
（6）37℃培养1小时。
3. 转化子筛选（1）将培养好的转化子涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上。
（2）37℃培养过夜。
（3）观察并记录菌落生长情况。
4. 转化子鉴定（1）取转化子菌落，提取质粒DNA。
（2）进行PCR扩增，检测质粒载体上的目的基因。
（3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
五、实验结果与分析1. 转化子筛选经过培养，观察到平板上出现了白色菌落，表明转化成功。
2. 转化子鉴定通过PCR扩增，观察到目的基因条带，说明转化子中含有目的基因。
感受态细胞的制备的实验步骤
CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。
以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。
附注：影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。
DH10B 电击感受态细胞使用说明
DH10B 电击感受态细胞DH10B Electroporation Competent CellDH10B 电击感受态细胞基因型F- mcr A ∆(mr r-hsd RMS-mcr BC) φ80lac Z∆M15 ∆lac X74 rec A1 end A1 ara D139 ∆(ara, leu)7697 gal E15 gal K λ- rps L nup GDH10B 电击感受态细胞说明DH10B菌株来源于MC1061菌株，mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10B菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA (无论真核生物还是原核生物的基因组DNA都能被高效的转入DH10B中)。
recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。
φ80dlacZ∆M15标记的存在使DH10B可用于蓝白斑筛选，rpsL赋予其链霉素抗性。
High5TM系列DH10B感受态细胞适用于大质粒的构建或者各种文库构建。
High5TM系列DH10B感受态细胞经特殊工艺制作，经pUC19质粒检测，转化效率>1010cfu/μg。
注意：DH10B 电击感受态细胞只能用于电击转化而不能用于热激转化。
DH10B 电击感受态细胞操作方法1. 0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的High5TM 系列DH10B感受态细胞放入冰浴中融化，加入1 μl目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒pUC19；B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA后适量TE缓冲液(10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。
DH10Bac感受态细胞制备方法
DH10Bac感受态细胞制备方法前言：DH10Bac感受态细胞本身含有卡那霉素和四环素抗性。
在制作感受态细胞的时候，需要加入这两种抗生素，以防止DH10Bac中的质粒父本杆粒bMON14272（卡那霉素抗性）和辅助质粒pMON7124（四环素抗性）在细胞扩增过程中丢失，提高质粒转化后的基因转座效率。
实验步骤：1. 在含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的LB平板或无抗平板上，使用DH10Bac菌液划线，37o C培养箱过夜，培养12~20小时。
2. 从平板上挑取一个单菌落，接种到一个含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的100 ml LB液体培养基中，于37℃，250rpm培养3-6小时，至OD600值为0.4左右。
或者从平板上挑取一个单菌落，接种到一个含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的5 ml LB液体培养基中，于37℃，250rpm培养12小时，然后再将菌液按照1:100的比列接种于含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的100 ml LB液体培养基中，于37o C，250rpm培养3小时，至OD600值为0.4左右。
3. 将DH10Bac细菌培养烧瓶在冰上孵育10 min，使培养物冷却至0℃，转入无菌的预先用冰预冷的50 ml离心管中，然后于4℃下5000 rpm离心8 分钟收集细胞。
4. 倒出培养液，尽量使上清弃尽。
每50 ml初始培养物加入30 ml预先用冰预冷的0.1 M CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟。
5. 于4℃，5000 rpm离心8 分钟收集细胞，弃尽上清。
加入4 ml预先用冰遇冷的0.1 M CaCl2。
轻轻吹打悬浮细胞，加入1 ml灭菌的预先用冰遇冷的80%甘油，吹打混匀。
6.将DH10Bac感受态细胞按照毎管100 ul分装。
可以直接使用新鲜制备的DH10 BAc感受态细胞进行质粒转化，也可以放在-80 ℃冰箱保存备用。
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大肠杆菌DH10B（Streptomycin resistant）电转化感受态制备
1．从保存的甘油管中取出200 μL菌液到100 mL的LB液体中，37o C，200 rpm 培养约13~16小时后（对数期），按2%接种到SOB培养基中；
2．37o C，约2~2.5小时后，OD600约0.5左右，取出，冰上缓慢摇育30 min。
3．预先4o C降温的冷冻离心机离心收集菌体，用预冷的离心管，并时刻保持在冰上，5000 rpm离心5 min；
4．用50~60 mL的冰预冷灭菌超纯水洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时刻保持在冰上，第二次洗时可以将2管的菌体并到一管，水洗过程离心的转速要高一些，约6000 rpm离心5 min，因为离心得不是很实，离心完后要立即倒掉上清，以免菌体重新悬浮造成损失；
5．用50 mL的冰预冷灭菌10%甘油洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时刻保持在冰上，离心后立即倒掉上清；
6．最后一次甘油洗涤后立即倒掉上清，视菌体量加入0~x μL的10%冰预冷甘油重新悬浮细胞，75~200 μL/管,分装到预冷的离心管中，电转化或立即放入-80o C冰箱保存，该感受态可以在-80o C保存半年。
SOB培养基（1L）：
20 g Tryptone；5 g Y east Extract；0.6 g NaCl；0.19 g KCl，8磅灭菌20 min。
注意事项：
种子一定要新鲜，最好是从甘油管中直接液体活化的。
OD600控制在0.5左右，建库用的话千万不要过！过了0.6感受态效率不会太高，做一般克隆和质粒转化的要求可以适当放低。
菌体时刻保持冰上（4 o C以下）！尽量减少离开冰的时间。
最后分装的菌体浓度要浓。
对待菌体要尽量轻柔。
收集菌体用的管和枪头要灭菌，并在超净台操作。
电击转化
1.75 μL的感受态细胞加入TE溶解的质粒和连接产物最好不要超过0.6 μL，不然容易击穿，如果质粒是用纯水溶解的可以适当提高，冰上放置10~30 min；
2.洗干净并烘干的电转杯冰上预冷，快速将上述感受态细胞转到电转杯里，感受态细胞要位于杯子底部；
3.此步骤动作要快：将杯子外壁擦干，2 mm的杯子用电转化程序Ec2，1 mm 杯子用电转化程序Ec1，电击后立即加入900~1000 μL37o C预热的SOC（见分子克隆），轻柔吸打，转到2 mL的离心管中，37o C摇床，150 rpm，45~60 min后取适量涂平板。
感受态细胞转化效率检测
1．取已知浓度的pUC19质粒（例如0.1 ng/μL）0.2 μL到制备好的75 μL感受态细胞中，按上述方法转化；
2．转化后取1 μL涂氨苄LB平板，37o C过夜；
3．数平板上的菌落数，转化效率为每微克DNA（即质粒）转化所长出的单菌落数，即cfu/μg。
举例说明：平板上长出750个单菌落，则转化效率=750 cfu ÷[(0.2 μL×0.1 ng/μL)÷1000]=3.75×1010 cfu/μg
建库用的感受态效率要大于108 cfu/μg DNA。