枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究李瑞芳;薛雯雯;黄亮;熊前程;王彬【摘要】为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进.用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DBl342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5kb质粒pSBPTQ进行转化,并研究RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响.结果表明,该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化,营养缺陷型突变株DBl342的转化率为750 CFU/μg/DNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为1 070 CFU/xg DNA,野生型菌株BS501a转化率为270 CFU/μg/DNA.根据影响转化效率的因素,推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下,细胞壁和细胞膜形成缺陷,使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)005【总页数】4页(P227-230)【关键词】枯草芽孢杆菌;感受态细胞;质粒转化方法【作者】李瑞芳;薛雯雯;黄亮;熊前程;王彬【作者单位】河南工业大学生物工程学院,郑州450001;河南工业大学生物工程学院,郑州450001;河南工业大学生物工程学院,郑州450001;河南工业大学生物工程学院,郑州450001;河南工业大学生物工程学院,郑州450001【正文语种】中文枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中具有应用价值的菌种之一。
建立简便、有效的DNA 转化方法,对枯草芽孢杆菌的基因改造、提高其生产性能具有重要意义。
枯草芽孢杆菌质粒转化方法主要有原生质体转化[1]、电击转化[2]和CaCl2转化[3]。
与电击转化方法相比,原生质体转化条件温和,不需相应的转化设备,但转化效率低;CaCl2转化耗时长,转化效率也不高。
植物病理学高级实验技术指导
管平躺，30℃ 60rpm 2-3h。 酶解过程中应吸取菌液镜检，检查原生质体是否释放；酶液需现配现用，PH 值很
关键，需用低浓度（0.1M）的 NaOH 调 PH 至 5.8。 * 以下步骤于 4℃下完成，0.7M NaCl 溶液,1ⅹSTC 先放于 4℃预冷。 6、取出酶解液，加少许 0.7M NaCl 溶液，轻轻摇晃，倒于三层擦镜纸过滤，用 0.7M
CaCl2
4、TB3
Autoclave
3g
Yeast Extract
3g
Casamina Acids
20%
Sucrose
Add ddH2O to 1L for solid media add agar to 0.65-0.75% Autoclave 5、PTC
60% （w/v）
PEG4000 in 1ⅹSTC
第一部分 真菌学实验技术
实验一 稻瘟病菌转化（Transformation of Magnaporthe grisea）
一．原生质体的制备（Protoplasting） 1、活化菌株，接种菌丝块(2mm×2mm)于 CM 平板上生长 6d 左右，菌落直径约 3cm，
菌株不宜太老，最好不要超过 12 d。 2、切取直径约 3cm 的菌落，尽量切碎，置于约 100ml CM/5ⅹYEG 的液体培养基
Add ddH2O to 100ml Store in a dark glass bottle at 4℃
2、5ⅹ YEG
5g
Yeast Extract
10g
D-Glucose
3、1ⅹ STC
芽孢杆菌感受态制作方法
目 录声明： (1)大肠杆菌感受态细胞的制备 (2)一、CaCl2感受态细胞的制备 (3)二、电转感受态细胞的制备 (4)枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化 (14)农杆菌感受态细胞的制备及转化 (17)酵母感受态细胞的制备及转化 (18)关于载体连接的讨论 (23)声明：本文所涉及的技术要点主要来源于相关文献、网络和书籍，此外，一些操作中的技巧及经验等来自于本人及同学、朋友的总结，仅供大家参考，同时也请下载者不要传播尤其是以商业为目的的复制、传播等等；如有转载、传播请注明来源于“螺旋网”。
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大肠杆菌感受态细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。
野生型E.coli 并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。
为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出不同的方法处理细菌，经过多年的努力，科学家们发现了可以增加细胞吸收外源DNA 效率的方法，那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。
这种经过理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，该细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。
这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。
细菌的转化有两种类型：一种是自然转化（natural transformation），在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化；另一种是工程转化（engineered transformation），在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入并转化外源DNA。
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化法进行，详述如下：采用改进的Spizizen ，试剂A SPI-A Salts Solution：132 ）SO0.4% 硫酸铵（NH 4 4 2228 2.8% KHPO·3HO 2421361.2% KHPO 42210水）即二水合柠檬酸三钠0.2% Trisodium Citrate Dihydrate（柠檬酸三钠-2- 20min灭菌（每次用完要灭菌）121°SPI-B Salts Solution：0.04%MgSO7HO 12024*121°20min灭菌（每次用完要灭菌）100×CAYE solution : 2% Casamino acid（酪蛋白水解物）10% Yeast Extract121°20min灭菌（灭菌一次，每次在超净台取样）B 感受态细胞的制备和转化1.前一天晚上挑取宿主菌（单菌落）接种于一支5mlLB液体摇瓶，37°摇床过夜2. 第二天早上取100ul过夜培养的菌液，接种于50ml离心管配好的5ml SPI Medium中，37°摇床培养，3h后开始测OD600（一般不用测），当培养物声场到对数末期时，快速取200ul接种到2ml SPII Medium中，37°100rpm 1.5h3. 加20ul100×EGTA溶液，37°100rpm 10min，用1.5ml离心管分装成500ul每管4. 向管中加入适当的质粒，5-10ul，轻轻混匀与37°100rpm 30min5. 将离心管转移到250rpm，37°，1.5h6. 以4000rpm离心收集菌体。
弃部分上清，留100ul重悬菌体，涂布于响应的抗性平板。
37°过夜。
离心管选用10ml或者50ml带螺帽的底部尖的离心管。
感受态细胞不能保存，因此，需要现做现用大肠的抗性（Amp），枯草的（Kan）枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化℃过夜培养LB培养基中，371）挑取枯草芽孢杆菌168单菌落与3mL液体（5 ml SPI培养基中，37℃，200rpm（2）取100ul过夜培养物，接种于震荡培养，当培养至对数期末期，快速取200ul接种于2ml的spII培养基，37℃，100rpm 震荡培养，培养1.5h（3）加入20ul100×EGTA溶液，37℃，100r/min震荡10min（分500ul/管）（4）向管中加入适量质粒1-5ul，混匀，37℃，100r/min，震荡30min。
感受细胞的制备与电转化
一、B.subtilis感受态细胞的制备与电击转化1、培养基GM：40 mL（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，3.6 g山梨醇pH=7.2；ETM：200mL电转缓冲液(0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%甘油)：18g山梨醇,18.5g甘露醇,甘油；RM：10mL（LB+0.5 M山梨醇+0.38 M甘露醇）：0.9 g山梨醇，0.7 g甘露醇，LB液体培养基。
2个50ml离心管，灭菌。
2、枯草芽孢杆菌WB600感受态的制备1)在新鲜平板上挑取单菌落（小一点为好）接种于5mL的LB液体培养基中，过夜培养(12小时)；2)测量摇管内菌液的吸光值，控制好接种量，使接种完毕后培养基的吸光值在0.19~0.2 左右，培养基为5mLGM。
37℃，180r/min 培养至OD600=1.0(3-4h)左右；3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000r/min，8min，4℃离心收集菌体；4)用40mL预冷的电转缓冲液(0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%葡萄糖)洗涤离心后的菌体，5000r/min，8min，4℃离心倾去上清，如此反复漂洗3次；5)将洗涤后的菌体重悬于500µl电转缓冲液中，每管分装60µl，即为制备好的枯草芽孢杆菌感受态细胞，放于-70℃冰箱中保存。
3、枯草芽孢杆菌WB600电击转化1)向预先制备好的60µl枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中加入6µl重组质粒，冰水浴保温5min，然后加入到预冷的电转杯(1mm)中，电击一次，电转仪设置：2.0KV，25µF，200 Ω，电击一次(持续时间4.5-5ms)；2)电击完毕后立即加入1mL复苏培养基RM（LB+0.5 M山梨醇+0.38 M甘露醇），反复吸打几次，将溶液吸出转移到1.5 mL的离心管中，37℃，180r/min，振荡培养复苏3-5h后。
大肠杆菌,枯草杆菌,地衣芽孢杆菌以及酵母的感受态制备及转化
地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化条件探索及优化见文献。
接种新鲜Bacillus licheniformis2709单菌落至10mL芽孢杆菌基本培养基中，3 7℃剧烈振荡培养16~18 h，250 r/min，培养至OD600为1.0时，取1.5 mL该培养液加入到10 mL 37℃水浴预热的40 mL新鲜芽孢杆菌基本培养基中。
3 7℃剧烈振荡培养4 h，250 r/min。
加入10 mL芽孢杆菌饥饿培养基，37℃剧烈振荡培养4 h，250 r/min。
将细菌在冰水浴冷却15 min，分装于0.5 mL Eppen dorf 管中，于4℃10000 r/min 离心10 min ，沉淀用预冷的水轻轻溶解悬浮，可直接进行实验，也可于-70℃冻存。
将新鲜制备的转化前细胞0.5 mL在4℃10000r/min下离心10 min，弃上清，加入0.5 mL 冰水悬浮，如此反复洗涤细胞三次，轻柔操作，冰浴10 min分别加入不同浓度的质粒DNA，混匀，将溶液转移到预冷的无菌电转化池中，吸干池表面的水分，将电转化池放入电转仪的样品槽中，在电场强度为25μF、不同的电压下电击转化。
迅速取出电转化池，加入1 mL BY液体培养基稀释细胞，37 ℃水浴摇床培养1.5 h，取200 μl涂布于LB固体卡那霉素抗性平板上，37℃培养。
阳性转化子的筛选将阳性转化子点种于酪素固体卡那霉素抗性平板上筛选，观察透明圈。
以地衣芽孢杆菌为宿主进行电转化研究转化首先要考虑宿主细胞的感受态的形成能力，对于大肠杆菌为宿主细胞，经过CaCl2处理以后可以使大肠得到较好的感受态性能，可使每微克质粒转化得到107个转化子，而对于革兰氏阳性菌如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌要使其经过特殊处理得到较好的感受态性能并非易事，因为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌在感受态细胞形成和DNA转化的机制上有很大的不同，目前有关机理还知道得很少，所以使用于处理革兰氏阴性菌的方法并不适用于革兰氏阳性菌[7]。
一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法
一种枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法一、背景介绍干草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于土壤中的革兰氏阳性细菌，具有高度的代谢途径多样性和生物合成能力。
在工业上，它被广泛应用于酶制剂、食品添加剂、抗生素等领域。
同时，作为模式微生物之一，干草芽孢杆菌也被广泛用于基因工程研究。
二、感受态细胞的定义及意义感受态细胞是指处于特定环境下对外界信号做出反应并发生转化的状态。
在干草芽孢杆菌中，感受态细胞可以通过群体行为来调节基因表达，并且参与到许多重要的生理过程中。
三、制备方法1. 建立单克隆株：从天然环境或已知来源分离得到单个干草芽孢杆菌株。
2. 生长条件优化：将单克隆株接种至含有适当营养元素和温度条件下进行培养。
3. 感受态诱导：使用人造小分子化合物如AI-2或激活蛋白质如ComX来诱导产生感受态细胞。
4. 维持稳定状态：将产生了感受态细胞的培养液经过连续传代以保证其稳定性。
四、转化方法1. DNA提取：从目标DNA源（例如其他微生物）中提取所需DNA片段。
2. PCR扩增：利用PCR技术扩增所需DNA片段，并加入限制酶切位点以便后期操作。
3. 酶切连接载体：将PCR扩增得到的DNA片段与载体进行酶切连接，并进行转化操作使其进入目标宿主微生物内部。
4. 筛选正常转化子: 通过筛选可选择抵抗某些抑制剂或者带有特殊标记等方式筛选出正常转换子。
五、总结本文介绍了一种针对干草芽孢杆菌感受态细胞制备及转换方法。
该方法可以有效地促进基因工程研究，在相关领域具有重要意义。
感受态细胞的制备及转化
感受态细胞的制备一、实验原理受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。
本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。
二、材料及准备工作一）材料准备二)试剂配制1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）蛋白胨 2.0g酵母提取物 1.0g氯化钠（NaCl） 2.0g2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）蛋白胨2×1.0g酵母提取物2×0.5g氯化钠（NaCl）2×1.0g琼脂粉2×1.5g温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。
4℃保存备用。
3、TSS液（100ml）（有效期2周）聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10%DMSO 5ml 终浓度5%MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/LLB 85ml 终浓度85%去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用注：聚乙二醇分子量可以为3000-80004、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用）KCl（2mol/L） 2.5mlCaCl2(1mol/L) 1.5mlMgCl2(1mol/L) 2.5ml水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒）5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml）取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃保存备用三）仪器设备1、低温大容量离心机2、恒温水浴锅3、超净台4、高压锅5、37℃孵育箱6、恒温摇床7、制冰机8、分光光度计9、微量移液枪10、低温冰箱三、步骤及注意事项一）感受态制备（TSS法）1、取菌种，划LB平皿板（无氨苄）；2、挑取分离良好的独立克隆，接种到5ml LB 中，220rpm ，37℃恒温摇床孵育过夜；3、取1 ml摇好的菌液，接种到100 ml LB 中（500ml锥形烧瓶），220rpm ，37℃孵育2.5-3.0h，菌液OD600达到0.2-0.5（0.36效果较好，不要超过0.6）；4、取出菌液，冰浴20min；然后4℃，3000 rpm离心5 min ，收集细菌；5、用10 ml 冰浴预冷的TSS液重悬细菌，然后4℃，3000 rpm离心5 min；再用冰浴预冷的TSS液重悬细菌，即成感受态；6、用1.5 ml离心管按150μl分装；-80℃长时间保存。
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枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化
采用改进的Spizizen法进行，详述如下：
A，试剂
SPI-A Salts Solution：
% 硫酸铵（NH4）2SO4 132
% K2HPO4·3H2O 228
% KH2PO4 136
% Trisodium Citrate Dihydrate（柠檬酸三钠-2-水）即二水合柠檬酸三钠 210
121° 20min灭菌（每次用完要灭菌）
SPI-B Salts Solution：%MgSO4*7H2O 120
121° 20min灭菌（每次用完要灭菌）
100×CAYE solution : 2% Casamino acid（酪蛋白水解物）
10% Yeast Extract
121° 20min灭菌（灭菌一次，每次在超净台取样）
100×EGTA solution：10mMol/L EGTA (NaOH调pH 至
B 感受态细胞的制备和转化
1.前一天晚上挑取宿主菌（单菌落）接种于一支5mlLB液体摇瓶，37°摇床过夜
2. 第二天早上取100ul过夜培养的菌液，接种于50ml离心管配好的5ml SPI Medium中，37°摇床培养，3h后开始测OD600（一般不用测），当培养物声场到对数末期时，快速取200ul接种到2ml SPII Medium中， 37°100rpm
3. 加20ul100×EGTA溶液，37°100rpm 10min，用离心管分装成500ul每管
4. 向管中加入适当的质粒，5-10ul，轻轻混匀与37°100rpm 30min
5. 将离心管转移到250rpm，37°，
6. 以4000rpm离心收集菌体。
弃部分上清，留100ul重悬菌体，涂布于响应的抗性平板。
37°过夜。
离心管选用10ml或者50ml带螺帽的底部尖的离心管。
感受态细胞不能保存，因此，需要现做现用
大肠的抗性（Amp），枯草的（Kan）
枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化
（1）挑取枯草芽孢杆菌168单菌落与3mL液体LB培养基中，37℃过夜培养
（2）取100ul过夜培养物，接种于5 ml SPI培养基中，37℃，200rpm 震荡培养，当培养至对数期末期，快速取200ul接种于2ml的spII 培养基， 37℃，100rpm震荡培养，培养
（3）加入20ul100×EGTA溶液，37℃，100r/min震荡10min（分500ul/管）
（4）向管中加入适量质粒1-5ul，混匀，37℃，100r/min，震荡30min。
（5）调整摇床转速，250r/min继续培养1-2h
（6）取适量体积的细胞，涂布在含有相应抗生素的LB平板上，过夜培养
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备（可保存的）
1.LB平板上，37℃过夜培养
2.挑单菌落，接种于5 ml GM Ⅰ溶液，30℃ 125rpm，
摇床过夜培养
3.次日，取2ml转接到18ml GM Ⅰ中，37℃， 250rpm，
4.再取10mL上一步骤的培养液转接到90mL GM Ⅱ中，
37℃，125rpm，， 5000rpm 10min
5.用10mL原培养液上清液轻轻旋复浮菌体，即为感受
态细胞
6.加30% 的灭菌甘油至终浓度10%（500ul/管）
10×最低盐溶液（100mL）
K2HPO4 14g
KH2PO4 6g
（NH4）2SO4 2g
Na3C6H5O7·2H2O 1g（二水合柠檬酸三钠）
MgSO4·7H2O
氨基酸溶液 2mg/ml，贮存于棕色瓶内，113℃灭菌30min，用黑纸包裹
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法
1. 挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37°过夜培养；接种量1%至growth medium（LB含有山梨醇），37°培养至OD600nm为；
2.冰上预冷10min后，转至预冷的50ml离心管，4℃，5000rpm 离心5min；用冰冷的EM（electroporation medium, 山梨醇；甘露醇；10%甘油），洗四次，将培养液中的成分全部去除；
3.将沉淀悬于1/40体积冰冷的EM中，使细胞终浓度为×1010cfu/ul，即得到感受态细胞（无需液氮处理，可直接存储于-70℃）
4.将80ul感受态细胞与1ul整合质粒（浓度1-5ug/ul），以不加质粒的感受态细胞作为阴性对照。
5.转至预冷的电转杯中，冰上放置5min
6. 1mm电转化杯，采用2000v/mm，电击；2mm电转杯，采用2500V/mm，电击一次
7.立即加入500ul Recovery medium(LB含有山梨醇，甘露醇)
8.转移至无菌的离心管中，37℃，100rpm，预培养3h
9.将培养液涂布在含相应抗性抗生素的LB平板上，正面放2h后，带转化液被培养基完全吸收后，倒置培养。
挑单菌落，提质粒验证。
加溶菌酶。