农杆菌感受态细胞制备
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期：2010-04-28 发布人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889一、目的及要求了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
二、实验原理在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。
三、实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/ml0.15 N NaCl，高压灭菌。
20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；3. 5000rpm, 离心5min；4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。
农杆菌的培养与感受态制备
农杆菌的培养与感受态制备农杆菌感受态的制备与转化实验室根癌农杆菌感受态的制备：1.取保存于-70°LBA4404菌株在YEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或平板活化，挑取单菌落接种于5mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或YEP(含50mg/l利福平)液体培养基中，28°C、200rpm培养24-28h。
2.取2ml菌液接种至50mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或利福平)中，28°C、200rpm培养至OD600≈0.5左右。
3.菌液冰浴30min后，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。
4.弃上清，用10ml0.15mol/lNacl重悬菌体，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。
5.弃上清，用2ml20mmol/lCacl2重悬菌体，加入1ml60%无菌甘油(使其终浓度为20%），每管100μl分装，液氮冻存，-70°C保存。
重组质粒电转入农杆菌中：1.从大肠杆菌中提取重组质粒，将5μl重组质粒加入农杆菌感受态中，至于冰上30min。
2.将混合物加入电击杯中，选择“Agr”模式（电压2.2kv，时间4.9m）电击，加入800μlYEB培养基，28°C、200rpm振荡培养3-5h，8000rpm离心30S（实际操作中不离心，吸取菌液50、100、150ul等多做几个梯度，用无菌水稀释至180ul），弃上清，涂布于YEB平板（含农杆菌和质粒所带抗生素，如Kan和利福平）。
3.28°C恒温箱中倒置培养48h（24h以上）。
4.从农杆菌中提取质粒，双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测；扩目的片段并测序验证。
5.转化烟草等实验材料。
YEB培养基：1.0.5%（w/v）蔗糖，0.1%（w/v）细菌用酵母提取物，1%（w/v）细菌用胰蛋白胨，0.05%（w/v）MgSO4·7H2O，调节pH7.0，121°C灭菌15min。
农杆菌感受态细胞的制备
农杆菌感受态制备和转化方法(一)普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。
5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。
6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。
7. 液氮中冷冻1分钟。
8. 37℃水浴溶化细胞。
9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。
10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。
11. 涂板，28℃培养2-3天。
(二)电转农杆菌感受态细胞制备与转化1．挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。
（如用5mlYEP，需培养36h）2．将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。
3．转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
4．用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。
5．4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
6．重复4、5步骤2~3次。
7．用2ml冰浴的10%甘油重悬。
8．每管100µl分装于1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。
1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH 调pH至7.0，灭菌后待用。
注：HEPES需现用现配。
电击法转化农杆菌感受态细胞1．取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。
2．加2µl质粒DNA于100µl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。
农杆菌感受态的制备及电击转化
农杆菌感受态的制备及电击转化（1）将农杆菌EHA105菌株在含有50 mg/l 利福平的LB固体培养基上划线，28℃培养36~48 h；（2）挑取单克隆，于10 ml 含50 mg/l 利福平的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；（3）当OD600达到0.5~0.7时，6 000 r/min 4℃离心10 min收集菌体；（4）用预冷的10%无菌甘油洗菌体3次后用2 ml预冷的10%无菌甘油重悬沉淀，分装后于-70℃保存备用；（5）取重组质粒（pROK2-LbDREB）1 μl，加入100 μl EHA105感受态细胞，混匀后冰上放置；（6）将混合液放入预冷的电击杯中，1 800 V电击；（7）电击完成后迅速取出，加入500 μl LB液体培养基，迅速吸打混匀，尽可能多的将混合液移入无菌的离心管中，28℃摇菌1 h复苏；（8）取适量菌液涂布于含50 mg/l 卡那、50 mg/l 利福平的LB固体培养基上，28℃培养36~48 h；①农杆菌感受态细胞制备a. 在新活化的农杆菌EHA105/GV3101平板上，挑取单克隆于LB液体培养基（含利福平50mg/l）中，28℃，220r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.7；b. 取1.5ml无菌离心管，每管分装1ml菌液，6000r/min离心10min；c. 去除上清，用1ml 10%无菌甘油重悬菌体，6000r/min离心10min，重复此过程3次，充分洗涤菌体以去除残留的培养基；d. 向洗好的菌体用100μl 20%无菌甘油重悬，-70℃保存备用。
②根癌农杆菌的电击转化a. 取-70℃保存的农杆菌感受态细胞，加入100ng重组质粒（pCAM-EG），吸打混匀后移入预冷的电击杯中；b. 1800V电压电击后迅速取出电击杯，加入500μl LB液体培养基，迅速吸打混匀；c. 尽可能多的吸出电击杯中的培养基，移入到无菌1.5ml无菌离心管中，28℃，振荡培养1h；d. 取转化的菌液200μl涂布于LB固体培养基（含利福平50mg/l和卡那霉素50mg/l）平板，28℃倒置培养24-48h。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条 件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发 状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到 植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农 杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
农杆菌的转化加入1mlyep培养基加入1mlyep培养基28慢摇培养24h28慢摇培养24h液氮中速冻1min迅速置于37水浴中5min取100?l农杆菌感受态加入约051?g质粒dna混匀后冰浴30min均匀涂布在含rif和kan的yep平板上28c温育48h至菌落出现离心去上清将细胞重悬于200?lyep培养基中载体分子带有抗生素抗性基因kan感受态受体细胞本身不具有抗生素的抗性没有导入载体的细胞在抗生素培养基上便不能生长
农杆菌感受态的制备
A • 挑取农杆菌单菌落于液体培养基中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜活化
B
• 菌液按1:50的比例转接于50ml新鲜培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6；
C
• 菌液转移至10 ml的离心管中，冰浴30 min
D
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体
DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然
后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 特点：操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
农杆菌感受态
感受态细胞（competent cell)是细菌细胞具有的能够接受外源DNA
的一种特殊生理状态. 重组DNA要导入宿主细胞，其生理状态很重要，需要将细胞进行特 殊处理，使细胞膜透性发生暂时性改变，成为容易接受外源DNA分 子的状态，即成为感受态细胞。 电击法， CaCl2法。 不同的转化方法需制备不同的感受态。 CaCl2法制备感受态：正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶 液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞 呈现出感受态.
农杆菌感受态的制备方法
农杆菌感受态细胞制备第一天晚至第三天晚： 1）取-80℃保存的GV3101于含50μg/ml 利福平的LB （千分之一的利福平）平板划线，28℃培养（一般要两天）。
注意：划线的时候要少沾一点原菌株，不必等到菌株融化就可轻轻沾一点，一定要少量，然后轻轻地划在板上。
挑得太多不容易长出单菌落，如果太用力也容易伤到菌株。
第三天下午或晚： 2) 挑取单菌落接种于灭菌的50ml 新管子加10ml 50μg/ml （千分之一）利福平的LB 液体培养基中，200rpm 28℃振荡培养12-16 hr （过夜可以）。
注意：管子最好用灭菌过的报纸包一下，摇菌时。
第四天早： 3) 取1-2ml （按1:50或者1:100的比例）菌液转接于含有50μg/ml （千分之一）利福平的100ml LB 液体培养基中（用500 ml 的三角瓶来摇菌28℃，200rpm 振荡培养至OD 600=0.5）。
注意：摇菌的过程可能需要3-4小时，要随时监控菌的浓度，可以平行的摇两瓶，其中一瓶用来测浓度，避免污染；并且为了保证检测菌液与未检测菌液的一致性，平行的两瓶菌液，最好来源于同一个50 ml 管子的菌液。
摇菌的过程中可以预先把NaCl 置于冰上预冷。
4) 转移菌液到新的灭过菌的50 ml 离心管中，冰上30min ； 5) 4℃，5000rpm 离心5min 。
6) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干，可以用预冷的NaCl 快速冲洗一遍。
7) 加入10ml 预冷的0.15M 的NaCl 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min 。
注意：要用5ml 枪调到3ml 挡，轻轻抽打。
8) 4℃，5000rpm 离心5min 。
9) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干。
10）加入2 ml 预冷的含15%甘油的20mM 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。
注意：要用1ml 枪轻轻抽打。
11）按200ul 的量分装到1.5 ml 无菌Eppendorf tube 中，液氮速冻，-80℃保存，一般不要存放超过2-3个月。
农杆菌感受态制备
版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70 C保存的EHA105于含50用/ml链霉素平板划线，28 C培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM液体培养基中，220rpm 28 C振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM 液体培养基中，28 C 220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCI2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min °4C 5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendof管中，每管200 M冻存于-70 C。
1.2.双元载体转化农杆菌 EHA105取1⑷左右的质粒 DNA加入到200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴30min , -70 C放置10min。
再在37 C水浴5min或42 C水浴1min，接着冰浴 2min，加入800mlYM 液体培养基 28 C, 175rpm 摇培3hr后涂在含50旧/ml Kanamycin 的YM平板上。
28 C培养到形成单菌落。
其中 YM 可以用LB代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCI2 0.01Tris-HCI （7.0）0.01 DTT ）替代。
版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml ）中28 C过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于 50ml YEP培养基中28 C生长至 OD600约等于0.5左右（4hr ）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCI 中悬浮细胞。
5. 5 krpm 离心5分钟，悬浮细胞于 20ml冰预冷的CaCI2。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
若在350毫微米以下，必需使用石英比色杯。
农杆菌的转化
取100µ L农杆菌感受态，加入约0.5-1µ g质粒DNA,混匀后冰浴30 min
液氮中速冻1 min,迅速置于37℃水浴中5 min
加入1 mLYEP培养基，28℃慢摇培养2-4 h
离心去上清，将细胞重悬于200µ L YEP培养基中
均匀涂布在含Rif和Kan的YEP平板上，28 ° C温育48 h至菌落出现
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条 件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发 状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到 植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农 杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
植物基因工程实验技术
实验三、农杆菌感受态细胞制备 及转化
王欢欢 二零一二.十
OD值与细菌生长曲线
I.调整期（lag phase） II.对数期( logarithmic phase)
III.稳定期（stationary phase）
IV.衰亡期（decline phase）
在对数生长期，OD值可以代表菌体密度，细菌悬液浓度与光密度成正 比，可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液浓度。但当生长 到一定时间后，OD值不会再增加.
所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。
整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化效率将会
降低。 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行， 所有的试剂都要灭菌