感受态细胞的制备及重组质粒的转化
感受态制备与转化
DNA分子导入受体细胞。
• CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简
便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)。
实验原理（转化）
CaCl2转化原理：细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，
细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNase的
离心30秒。 （每个班对照管需作1管，涂1块平板即可） 2、弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸上，每管加入0.5ml 冰冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌，置冰浴30min。
3、10000rpm离心1min，弃上清。
4、每管加60μl冰冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌。
质粒向大肠杆菌细胞的转化
1、实验管加5μl重组质粒DNA，对照管加5μl水，混匀，置
冰浴30min。 2、42℃水浴放置70秒，迅速放回冰浴，冷却2分钟。 3、加入1ml LB液体培养基，37℃振荡培养1h。 4、取50μl菌液均匀涂布在LB琼脂平板上（含50μg/ml氨苄
青霉素）。
5、倒置平板于37 ℃培养12－16个小时，观察结果。
• 有些质粒还有其他控制系统，如有分配功能的par系统和确保
质粒稳定遗传的ccd系统。
• 一旦质粒上与调控有关的基因或位点突变，可使拷贝数明显
增加或减少。
实验原理（转化）
• 质粒不相容性：同种（亲缘关系相近，利用同一复制
系统）的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内。
影响转化效率的因素
• 细胞生长状态和密度：细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，
dd H2O
0
合计20
2. 台式离心机离心10秒以混合均匀，16℃连接4小时至过 夜，连接产物存放于4℃或直接转化细菌。
感受态细胞的制备和质粒的转化实验
生物工程大实验学院：生命科学学院专业： 10级生物工程班级：三班姓名：林冬学号：指导教师：肖露老师感受态细胞的制备和质粒的转化实验一．实验目的：1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
二．实验原理：细菌吸收外源DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态，如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
三．材料：设备与试剂四．实验方法：①取100mlDH5ɑ培养物置于冰浴中10min，同时将0.1mCacl2和灭菌的50ml离心管4℃中放置10min.②在无菌条件下将培养物移入50ml离心管中（不能超过2/3体积约30ml）平衡后对称放入离心机，在4℃，6000转/min,离心5min,停止离心后，弃上清液（在超净工作上无菌条件下操作）③加入5ml预冷的0.1molCacl2溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使DH5ɑ细胞重新悬浮，置于冰水浴中旋转20min后，在4℃6000转/min离心5min,弃上清。
④细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用4mlCacl2悬浮，加灭菌甘油至浓度15％左右，混匀后分装于1.5mlEP管中，200ul/管，于80℃冰箱中冻存备用。
转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→取出100ul涂板。
单菌落扩大培养用接种环挑单菌落接入含150ml液体LB培养基锥形瓶中。
37℃，120rpm摇瓶培养，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出形状但不能辨认。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。
5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。
7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。
8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。
10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。
其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
25 生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。
2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。
【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。
未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。
本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli. DH-5α细胞 , 使E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。
2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。
进一步将转化菌涂布在含IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)
感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
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生变化，成为能允许含有外源DNA的载体分子
通过的细胞，即感受态细胞(competent cell) 。
experiments of molecular biology
转化（transformation）
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞
获得新的遗传性状的一种手段。
转化是微生物遗 传、分子遗传、基因 工程等研究的基本实 验技术。
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转化的方法
化学的方法(CaCl2法、热休克法)：使用化学试 剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克 处理将载体DNA分子导入受体细胞。 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受 态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子 导入受体细胞。
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抗Amp
宿主细菌
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含Amp培养基
实验仪器、材料
1 ．超净工作台
2 ．高速离心机
3 ．恒温摇床 4 ．恒温培养箱 5 ．恒温水浴锅 6 ．制冰机
7 ．移液枪
experiments of molecular biology
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二、感受态细胞的制备
1、取1mL菌液于1只1.5mL离心管中，臵冰浴5min，10000rpm离心
1min （每班需做对照管至少1管）（从这一步开始，所有操作均 在冰上进行，速度尽量快而稳） ；
2、弃上清，将离心管倒臵于干净吸水纸上，每管加入 0.5mL冰预冷 3、4000rpm离心10min，弃上清； 即为感受态细胞。 的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌，臵冰浴10min；
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实验原理
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，并用CaCl2处理使其处于 感受态，然后与pMD19-T-X重组质粒共保温，实现转化。由于重 组质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转 化子。
如受体细胞没有转入pMD19-T-X重组质粒，则在含Amp的培养基 上不能生长。 能在含Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了重组质粒。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积
15-30％的无菌甘油于-70℃保存(半年)。
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影响转化效率的因素
杂菌和其它外源 DNA 的污染
受体细胞
试剂的纯度和 器皿的洁净度
影响 因素
细胞生长状态和密度
转化操作
载体DNA及重组DNA
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重组DNA技术的基本工具
限制性核 酸内切酶
DNA 连接酶
基因进入 受体细胞 的载体
“分子 手术 刀”
“分子 缝合针”
“分子 分子 “ 运输车” 运输车”
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感受态细胞(competent cell)
经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发
生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。
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转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的 变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。 CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易 行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。
率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速（所有操作 均应在冰上进行）。 为减少对细胞的机械损伤，操作时动作一定要轻柔。 菌液涂布操作时应避免反复来回涂布，过多的机械挤压
涂布容易使感受态细菌细胞破裂，影响转化率。
操作过程中注意防止杂菌和杂DNA的污染。 注 意
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转化原理（CaCl2法）
将处于对数生长期的细菌臵入0℃的CaCl2低渗溶液中，
使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使 得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域； -磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；
此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基
思考题
1、影响CaCl2法转化率的因素有哪些？如何提 高转化率？ 2、如何利用抗性筛选出重组克隆？
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对照组： 以同体积的灭菌双蒸水代替重组质粒，其它操
作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素（Amp）
的LB琼脂平板上应没有菌落出现。 本次实验组预期结果：
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注意事项
感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化
感受态细胞的制备及 重组质粒的转化
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重组DNA技术
分：分离外源基因 目的基因。 切、接：利用酶学 方法，将外源基因 与载体连接，形成 复制子。 转：转化宿主细胞， 使复制子可以扩增 复制。 筛：筛选含有目的 基因的细胞(转化子) 并扩增以获得目的 基因克隆。
实验安排
1
实验 安排
受体菌的培养
2 3
感受态细胞的制备
质粒向感受态大肠杆 菌细胞的转化
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一、受体菌的培养
1. 从新活化的 E.coli JM109 平板上挑取一单菌落，接种于 3ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生 长期。（已做） 2. 将该菌悬液以 1:50 转接于 50ml LB 液体培养基中， 37℃ 250rpm 振 荡 扩 大 培 养 约 1-2h ， 当 OD600nm 值 为 0.3 ～ 0.5时，取出臵冰浴。
实验材料、试剂
1．大肠杆菌JM109菌株
2．重组质粒 3．1.5mL 离心管，Tip头 4．试管、培养皿 1． LB液体培养基 2．含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50µ g／mL） 3．氨苄青霉素贮存液（浓度50mg／mL）
4．0.1mol/L CaCl2溶液
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4、每管加入50μL冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌，冰上放臵，
experiments of mole、实验管加5μL重组质粒DNA，对照管加5μL灭菌水，轻轻 混匀，臵冰浴20min； 2、42℃水浴热应激90s（精确计时），迅速放回冰浴，冷却 5min后加入1mL LB液体培养基（不含Amp），37℃ 250rpm振荡培养约1h； 3、取50μL菌液均匀涂布在LB琼脂平板上（含50μg/mL Amp， 事先做好），37℃培养过夜（12-16h）后观察结果。 切记：玻璃棒经 酒精灯烧过后稍 微凉一下再用， 不要过烫！