感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)
个人总结 DH5α感受态的制备和转化
1.感受态的制备（1）挑取E.coli DH5α受体菌单菌落于50 ml 2×YT培养基的250ml锥形瓶中，250rpm，37℃震荡培养2.5小时左右（测其OD600在0.5-0.6最好）；（2）倒入，灭菌冰上预冷的50ml离心管中，盖严；（3）冰浴20-30分钟，使菌液冷却到0℃（要是有事，此步可暂停，冰浴久一点）；（4）4℃，4000rpm（3500rpm最好，4000会使离心管变形，而且菌体离的过紧）离心10min 收集菌体；（5）弃上清，倒置1min；（6）加10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2悬浮菌体（先加2ml悬浮，再加8ml。
直接加够10ml不容易吹散悬浮）；（7）冰浴25分钟；（8）4℃，4000rpm离心10min；（9）弃上清，加入1.5ml预冷的0.1mol/L的CaCl2小心悬浮；（10）分装（EP在预冷前先做好标记）100 μL或者200μL一管。
可以-70℃保存备用，也可以放置于冰上后在冰箱4℃保存一两天再用，转化效果不会有大的影响。
注意：加入CaCl2后细胞比较脆弱，操作一定要轻柔，不能弹不能摔。
整个操作都要在冰上，手不要直接接触管底。
2.转化可用新做的感受态进行转化，也可用-70℃保存的进行转化（1）分装的100或者200μL感受态细胞+重组质粒，冰浴30min；（2）42℃静置90s（可用干浴器）；（3）冰浴2-3min；（4）加入800μL37℃预热的2×YT培养基，37℃，200rpm震荡培养45min（中间不要暂停，培养时45度角倾斜）；（5）3000rpm离心3-4min，倒掉上清，残余的大概100μL左右进行悬浮后涂板；（6）37℃倒置培养过夜，第二天查看板上菌落生长情况。
注意：要是转化质粒，转0.5μL或者1μL就行了，质粒的转化效率很高。
涂板的时候不用离心，直接吸取50μL涂板。
转化连接产物的时候由于连接效率不一定高，所以要离心之后弃上清剩余100μL再悬浮后全部涂板。
大肠杆菌感受态细胞制备
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、实验目的1．了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点。
2．了解和掌握质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法。
二、实验原理在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术，外源 DNA感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。
的一种特殊生理状态。
大肠杆菌的感受态可用 CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的大 肠杆菌细胞在 0℃下加入到低渗的氯化钙溶液中，便会使细菌细胞膜的透性发生改变， 此时的细胞呈现出感受态。
制备好的大肠杆菌感受细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段 时间而不会对其转化效率有太大影响。
在 0℃下外源 DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42℃，90 秒），诱导细胞吸收DNA。
转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中 37℃培养 1小时，可使质粒编码的抗生素抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的大肠杆菌细胞可 在含有相应抗生素的培养基上涂布生长。
而没有转化的细胞则无法生长。
三、实验仪器、材料和试剂1．仪器：超净工作台、冷冻高速离心机、灭菌锅、恒温摇床、冰箱、超低温冰箱(70 ℃)、50ml 离心管、1.5ml 离心管、试管、培养皿、冰浴、加样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管须在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15 分钟。
2．材料：大肠杆菌DH5a或其他菌株。
3．试剂：（1）LB 液体培养基：（见质粒DNA提取）（2）LB 固体培养基：15g/1L（琼脂粉 LB 液体培养基）（3）0.1 mol/L CaCl2（4）0.1 mol/L CaCl214%（v/v）甘油以上溶液均需灭菌后使用，灭菌条件同上。
（5）LB 固体培养基平板（LB plate）：培养基熔化后待其温度低于 50℃时加入氨苄青霉 素至终浓度为 100μg/ml，混匀后立即倒入培养皿（直径 9cm），待凝固后，于 4℃倒置保存。
感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)
感受态细胞的制备（DH5α大肠杆菌）一、准备工作1、实验器械4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，紫外通风橱（提前一天预约）；0.22μm的滤器2个，10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管30个，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml锥形瓶2个，高压灭菌的100ml 玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。
2、试剂配制① LB平板② TYM培养基：分别称取胰蛋白胨4g，NaCl 1.46g，酵母提取物1g，MgSO4 0.62g，至于250ml烧杯中，加入120mlDDW，摇晃，使其全部溶解，用浓NaOH调节PH值为7.5，最后定容至200ml，转入至500ml锥形瓶，高压灭菌，4℃保存。
③ TfBⅠ：分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml 烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
④ TfBⅡ（每次现用现配）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl2 0.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
二、实验步骤1、将DH5α甘油菌从-80℃冰箱中拿出来放在冰上，用枪头吸蘸取或取少部分菌液加到无抗生素的LB平板边缘，在火上稍微烧一下枪头，在平板侧壁上冷却枪头，同时使其顶端变圆变钝。
划线接种，倒置放入37℃恒温箱过夜。
注：①尽量在菌液融化前挑取，反复冻融对菌体有损伤。
②吸取菌液后，尽可能快把甘油菌放回-80℃冰箱。
2、次日早上，观察是否长出单个菌落，菌落大小合适时，将平板放入4℃保存。
工程菌DH5α感受态细胞的制备及质粒pUC18转化的研究论文
毕业论文题目：工程菌DH5α感受态细胞的制备及质粒pUC18转化的研究（教务处制表）工程菌DH5α感受态细胞的制备及质粒pUC18转化的研究摘要：工程菌DH5α是实验室经常用到的一种宿主菌,同时质粒pUC18也是一种常用的优良表达载体，两者常被用于基因克隆和原核表达研究的工具。
本实验采用老师保存的实验室菌种，通过质粒提取试剂盒（碱裂解法）提取质粒pUC18和氯化钙法将工程菌DH5α制备成感受态细胞，然后将质粒转化入感受态的工程菌DH5α细胞中。
结果表明：提取的质粒通过琼脂糖凝胶电泳显示为pUC18，而经pUC18转化的工程菌DH5α具有抗氨苄青霉素的能力，并由于E.coli DH5a在使用pUC18质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补，最后接种于加入氨苄青霉素、呈色底物X-gal和诱导物IPTG的LB培养基上，经蓝白斑筛选，筛选阳性克隆。
关键词：工程菌DH5α；碱裂解法；质粒pUC18；蓝白斑筛选Theresearch for the preparation of the engineering culture DH5αcells and the transformation of the plasmid pUC18Abstract:Theengineering strain DH5αis often used as one of the host bacteria in laboratory , and plasmid pUC18 is also a kind of the commonly excellent expression vector, both are often used to the study of gene cloning and prokaryotic expression as the tool.The laboratory cultures are preserved by the teacher in this study,the plasmid pUC18areextracted by plasmid extraction kit (caustic pyrolysis) and the engineering bacterium DH5αareprepared as competent cells by calcium chloride method , and then translates plasmid into the feeling state of engineering bacterium DH5α cells.The resul t s showed that the extract of plasmid is pUC18 by agarose gel electrophoresis,so that the engineering bacterium DH5α that including the plasmid pUC18 has the ability of resistance to ampicillin, and as a result,when pUC18 plasmid vector has finished the transformation,the E.coliDH5αcan realize α-complementation with the amino terminal of theβ-galactosidase that was produced by the plasmid pUC18,finally,the transformant was inoculated to the LB culture mediumthat contains ampicillin, color substrate X - gal and inducer IPTG,the transformantsarepositive clones if they can survive andbescreened out by the blue and white spot screening.Keywords: Engineering bacterium DH5α;Alkaline lysis method;Plasmid pUC18;Blue and white spot screening目录1 前言 ............................................................................................... 错误！未定义书签。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备原理：大肠杆菌自然条件下极难进行转化，其关键原因是转化因子吸收较为困难。
在转化试验中，通常先采取人工方法制备感受态细胞，代表性方法之一是Ca2+诱导法。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现多种蛋白质和酶，负责供体DNA结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接收外来DNA分子受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞转化：①在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促进细胞外膜和内膜间隙中部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能和加入DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜液晶结构发生猛烈扰动，并随之出现很多间隙，为DNA分子提供了进入细胞通道。
一、受体菌培养从LB平板上挑取新活化E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50百分比接种于100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷0.05mol/LCaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油0.05mol/LCaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl小份,贮存于-80℃可保留半年。
大肠杆菌感受态过程中注意事项：1、细菌生长状态：不要用经过数次转接或储于4℃培养菌，最好从-80℃甘油保留菌种中直接转接用于制备感受态细胞菌液。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・co li K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
超级感受态细胞DH5α的制备
制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：制备超级感受态细胞采用Inoue的方法（1990）制备大肠杆菌感受态细胞很好时甚至能达到Hanahan方法（1980）的转化效率。
但在标准的实验室条件下，达到l×108~3×108个转化克隆/ug质粒DNA的转化效率更为常见。
与Hanahan方法相比，这一方法的优点在于并不过分地讲究细节，但是重复性更好，而且更有预见性。
这一方法与其他方法有所不同的是细菌在18℃进行培养而不是通常的37℃。
否则这个方法也就没有什么特别之处，而不过是一个司空见惯的标准程序。
没有人知道为何在低温进行细菌培养会影响转化效率。
也许是18℃时合成的菌膜成分和物理性状更有利于攫取DNA，也许是低温使有利于高效转化的生长时相延长了。
在18℃进行细菌培养并非易事，大多数实验室缺乏在夏天和冬天能够准确保持18℃的摇床。
将摇床置于4℃冷室，用温控器加温至18 ℃是一个解决问题的方法。
也可使培养物的温度维持在20~23℃，这样做并不会造成转化效率降低，这一温度在很多实验室其实是室温。
在这一温度范围，细菌生长得很慢，倍增时间大约为2.5~4h。
如此缓慢的生长可能会导致培养失败，尤其是在晚间较迟的时候，这时细菌的OD600吸收值似乎永远不能达到理想的0.6。
解决这个问题的方法是晚上就进行培养，第二天一早收获细菌。
分子克隆中常用的很多大肠杆菌品系都适用于这种方法，如XL-Blue、DH1、JM103、JM108/109、DH5a 和HB101。
材料注息：标记〈！〉试剂的正确操作，请参见附录12。
缓冲液和溶液贮存液、缓冲液和试剂成分请见附录1。
使用时将贮存液稀释至适当浓度。
二甲亚砜DMSO 〈！〉二甲亚砜的氧化产物据推测为二甲硫醚，是转化的抑制物（Hanahan 1985）。
为避免上述问题，应购买高质量的DMSOInoue转化缦冲液（见步骤1)用前置于冰上预冷至0℃。
核酸和寡核苷酸质粒DNA (重组质粒〉构建方法采用本章方案17和22所提供的方法。
dh5a感受态细胞的制备
dh5a感受态细胞的制备DH5α感受态细胞的制备引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，也是生物学实验中最常用的模式生物之一。
在分子生物学和基因工程领域，大肠杆菌被广泛用于蛋白质表达、基因克隆、DNA测序等实验中。
其中，DH5α感受态细胞是最常用的一种。
本文将介绍DH5α感受态细胞的制备方法。
一、实验前准备1.1 菌种选取首先需要选择适合自己实验需求的大肠杆菌质粒转化菌株。
DH5α感受态细胞是含有F-质粒（Fertility factor）的E. coli K12株系，具有高度敏感性和高转化效率，广泛应用于基因克隆、DNA测序等领域。
1.2 质粒DNA提取在进行质粒转化前，需要提取所需质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测和纯化。
质粒DNA的提取方法有多种，如碱裂解法、酚/氯仿法等。
1.3 化学试剂准备进行DH5α感受态细胞制备的实验中，需要准备一些常用的化学试剂，如CaCl2、MgCl2、LB培养基等。
二、DH5α感受态细胞的制备方法2.1 菌株处理将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，用无菌吸管取出适量菌液接种到含有LB培养基的50mL离心管中。
在37℃恒温振荡培养器中进行预培养，转速为200rpm，时间为8小时左右。
2.2 转化体系制备将质粒DNA加入到含有CaCl2和MgCl2的转化缓冲液中，并在室温下静置15分钟。
其中转化缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl（pH 7.4）、100mM CaCl2、50mM MnCl2、100mM MgCl2。
2.3 转化处理将预培养后的DH5α感受态细胞进行离心处理，去掉上清液。
然后加入转化体系，并在室温下静置30分钟。
之后将样品加热至42℃水浴中进行热激处理，时间为45秒左右。
然后将样品放入冰水中进行冷激处理，时间为2分钟左右。
2.4 恢复处理将转化后的细胞加入到含有LB培养基的离心管中，并在37℃恒温振荡培养器中进行恢复处理，转速为200rpm，时间为1小时左右。
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感受态细胞的制备（DH5α）
一、准备工作
所有试剂、容器均需提前预冷。
1、实验器械
4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。
2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧）
① LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。
② SOB培养基（Super Optimal Broth）
③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2
0.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
（装在50ml离心管，封口4度保存）
④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl2
0.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。
配制量 1 L
配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。
（50ml离心管分装）
在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。
2.配制2 M MgCl2溶液。
（50ml离心管分装）
在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。
5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。
6.滴加NaOH小块，调节pH值至
7.0。
7.加入去离子水将培养基定容至l L。
8.高温高压灭菌后，4℃保存。
9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。
LB培养基
配制量 1 L
配制方法
3.滴加固体NaOH，调节pH值至7.0。
4.加去离子水将培养基定容至1 L。
5高温高压灭菌后，4度保存。
二、实验步骤
1、第一天：下午3点取出-80°的感受态细胞DH5a，冰浴，用枪头沾一点（就可以带出很多细菌，剩余的不要了），在500ul的LB液体培养基中吹打（轻柔），取50ul至另一个500ul 的LB中再稀释，取100ul涂板。
37度恒温箱培养过夜约16h（具体时间观察单克隆，可以顺利挑菌就行）。
2、第二天早上，观察是否长出单个菌落，菌落大小合适时，向2个无菌的摇菌管分别加入
5ml高压过的SOB培养液，标注为对照管和DH5α管。
从LB平板上挑取单个菌落加入DH5α管中，220rpm，37℃，5h，OD550达0.3，将5mlSOB倒入100mlSOB，37度，220rpm，
3.5h后，OD550达0.36（T43.7%），取出冰上放置5min；
3、将100ml菌液转入两个离心瓶中（平底），spin 3K,5’,4℃，倒净上清，倒置于
吸水纸上吸干剩余上清。
之后步骤必须冰上进行，盐处理细胞后，操作轻柔;
4、每管加入20ml TbfI 重悬，轻柔操作，冰上放置5’, spin 3K,5’,4℃。
倒去上清，
并倒置于吸水纸上;
5、每管加入2ml Tbf ll 重悬，轻柔操作，冰上放置15’;
6、每管50ul 分装。
液氮速冻，-80度储存，标明制作日期，细菌种类;
7、留出一管做鉴定，分别直接涂布阴性，含AMP，含Kana的板子；再分别转化抗AMP和抗
Kana的质粒，分别涂布含AMP，含Kana的板子，第二天验证感受态状态。
8、正常感受态在阴性板子中长，在含AMP，含Kana的板子中不长；转化抗AMP和抗Kana
的质粒后分别后分别在含AMP，含Kana的板子中生长。
（每个都需涂2个板，含AMP，含Kana的板子）。