酵母感受态细胞的制备与转化
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。
2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。
3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。
一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。
将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。
4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。
5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。
6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。
7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。
7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。
8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。
毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。
2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。
3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。
4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。
5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。
6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。
要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
酵母感受态细胞的制备
酵母感受态细胞的制备以下是酵母感受态细胞的制备流程：一、基因突变1. 细胞外DNA转化：将基因要进行突变的DNA提取出来，放到细胞外，同时加入一定量的外源DNA去促进转基因的完成；2. 高效增幅：将一定的量外源DNA通过吞噬电穿孔的方法把外源DNA效率的转入细胞内，从而加快基因突变。
二、诱导表达和突变检测1. 选择表达载体：根据要转入突变要表达的基因，选择匹配的表达载体；2. 诱导表达：通过加入不同的诱导因子或者培养条件来促使载体的表达；3. 突变检测：通过筛选、测序和碱基错配检测等方法来检测是否发生了突变。
三、表达筛选1. 抗药基因筛选：对突变的酵母细胞，加入不同程度的抗药性因子，筛选出能够生存的突变细胞；2. 免疫细胞筛选：检验突变后的酵母细胞中能够产生免疫识别和反应细胞因子的存在，因为普遍认为有可能产生免疫细胞的能力。
四、选择迁移1. 抗药性筛选：对抗药性筛选出的突变酵母细胞进行对比，以确定是否能够开花；2. 免疫细胞筛选：通过检测免疫细胞因子的存在，筛选出产生免疫细胞的能力最强的突变细胞，并将其迁移至感受细胞中保存。
五、酵母感受态细胞的制备收尾1. 养殖酵母细胞：选择最佳突变细胞，把其分段离心至细胞密度稀释到一定水平；2. 生长管理：按照不同的培养环境加以调节，保证其正常的增殖和生长；3. 继代培养：当突变酵母细胞进行繁殖增殖后，可以进行继代繁殖，以不断增加细胞数量；4. 收尾清理：当满足实验要求时，对细胞进行收尾，进行清洗和分装，并保存细胞，以便后续使用。
总结：酵母感受态细胞的制备，主要分为基因突变、诱导表达和突变检测、表达筛选、选择迁移、酵母感受态细胞的制备收尾等步骤。
通过这些步骤，可以有效的制备可用于实验的突变的酵母感受态细胞，从而为对基因的研究和开发提供了非常有价值的材料。
感受态细胞的制备和转化
四 实验结果
转化效率计算公式如下： 转化子总数 转化频率= DNA加入量 =转化子/µ g DNA 转化子总数=转化菌落数*稀释倍数*转化 反应液体积
五 思考题
1 试总结出实验成功的关键步骤。 2 用乳糖作为BL21（DE3）菌株目的的基因 表达的诱导剂的作用机制是什么？ 3 在用氨苄青霉素作为抗菌素筛选转化子是， 一般37℃培养时间不超过20小时，为什么？ 4 氯化钙转化与电转化相比有哪些优点和缺 点。
实验 三 感受态细胞的制备和转化
一 实验原理
转化作用是在一定条件下，一种特定的DNA 分子（供体或称转化因子）转入到一定的细 菌体内（受体菌），使其发生遗传形状改变 的过程。 在正常生长条件下，少数细菌可发生转化作 用，但大多数细菌并不发生转化，只有在一 定条件作用下（如用Ca++处理细菌细胞或电 刺激），细菌呈现感受状态后，外源DNA才 能转化进入受菌体内。因此，若想将外源 DNA分子转化进入一定的受菌体内，通常需 将受体菌先制备成易感受状态。
三 操作步骤
2 重组质粒pGEX-6p DNA的转化 取上述感受态细胞200µ 1，加重组质粒DNA2µ 1（约 10ngDNA），混匀后，冰上作用30分钟，然后转到 42℃水浴 进行热休克90秒，快速转移样品到冰浴， 预冷1-2分钟，加0.8mlLB液体培养基，37℃培养45 分钟后取原液各0.2ml涂布Amp平板，同时将0.2ml感 受态细胞涂布于Amp平板作为对照。倒置平板， 37℃恒温培养箱中培养12-16小时，观察对照转化的 平板，观察转化子出现的数目，计算转化效率。所 得的到的单菌落即为菌株BL21（DE3）pGEX-6p。
ecoli感受态细胞的制备和转化
实验九 e.coli感受态细胞的制备和转化[实验目的]1. 学习分子生物学的实验操作技术。
2. 掌握 e. coli感受态细胞的制备和转化的方法。
[实验原理]未经处理的受体菌细胞对受纳重组分子不敏感，难以实现转化。
当用理化方法诱导细胞，使细胞处于最适摄取和容忍外来dna的生理状态一感受态后，才有较高的转化频率，这种细胞称为感受态细胞。
将重组dna转化受体菌，技术关键是通过化学方法诱导细菌进人感受态，以利于外源dna 被导入。
这项技术始于mandel和hiag1970年的观察。
他们发现细菌经过冰冷氯化钙溶液处理及短暂热休克（hea shock）后，容易被λdna感染；随后cohen于1972年进一步证明质粒dna用同样方法也能进入细菌。
其原理是：细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。
转化混合物中的dna形成抗dna酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收dna复合物。
在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。
除化学法转化细胞外，还有电击法。
电击法不需要预先诱导细菌进人感受态，只依靠短暂的电击，促使dna进人细胞。
因其操作简单方便、转化率高，愈来愈为人们接受。
[实验用品]一、试剂1. lb（luria—bertani）培养基配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：细菌培养用胰化蛋白胨 10g细菌培养用酵母提取物 5g氯化钠 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用5 mnaoh（约0.2ml）调至ph7.0，加人去离子水至总体积为1 000ml，高压灭菌20分钟。
2. lb（20％葡萄糖）100ml lb中加人20g葡萄糖3.1m cacl2cacl2·6h2o 54g去离子水 200mi用0.22µm过滤器过滤除菌，分装成1ml，贮存于-20℃。
毕氏酵母(Pichia_pastoris)感受态细胞制备及转化
毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD 值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。
酵母感受态细胞的制备及酵母转化
小 1.5ml 0.1μg 0.1μg 0.1mg 0.1ml 0.6ml 70μl
大 50ml 20-100μg 10-50μg 2-0.5mg 20mg 8ml 60ml 7.0ml
5S(14krpm)
5min (1000×g) 1.0ml1 为自激活 对照； pGADT7- T+pGBKT7-53 阳性对照；pGADT7-T+pGBKT7- lam 阴性对照。 为了检测每一个质粒的转化效率， 100μl 水稀释 1μl 转化子， 用 铺于 SD-Leu 和 SD-Trp 平板上；为了检测共转化效率，按不同比例（1:1000，1:100，1:10）稀释转化子，取 100μl 涂于 SD-Leu-Trp 平板上； 酵母培养基： YPD medium (1L) Dific peptone（可用 OXOID 公司的胰化蛋白胨）20g/L Yeast extract Agar（for plates only） 加蒸馏水 调 pH 6.5 高压灭菌，待冷却到 55℃左右，加 40％的葡萄糖 50ml 至终浓度 2％。 40％葡萄糖：40g 葡萄糖加 60ml 左右的蒸馏水溶解，然后定容至 100ml，过滤灭菌，4℃ 存放。注意，一定不能高压灭菌，因长时间高温会使葡萄糖变黑。 YPDA medium (1L) 在上面的 YPD 培养基中每升加 0.2% 的腺嘌呤半硫酸盐（adenine hemisulfate）15ml 至 终浓度 0.003%，高压灭菌。 0.2% adenine he misulfate： 0.2g 加 100ml 蒸馏水溶解即可。 注 ： 如果需要在 YPD(YPDA) 中 加抗生素 如 kanamycin， 在上面准备 的培养基 中加 50mg/ml 的 Km0.2-0.3ml 至终浓度 10-15mg/L SD medium (1L) 无氨基酸酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids, YNB） Dific 琼脂 10×DO 蒸馏水 浓度为 2％。 注：如果使用固体 DO，1L 中加 0.64g。 下面氨基酸成分是无缺陷 DO 中所需的所有氨基酸：
感受态细胞的制备及转化
感受态细胞的制备方法（BL21）1．菌种纯化。
①在LB平板上，用接种环挑取大肠杆菌BL21，在平板上分级划线，以能够出现单菌落为宜。
②将上述划线的平板倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养。
2．菌体培养。
①取20 ml LB培养基至100 mL三角烧瓶中，塞上棉塞后高温高压灭菌，然后冷却至室温。
②在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到①中。
③ 37℃振荡（约120 rpm）培养。
④测定OD值，当OD值达到0.35～0.5时（培养约5小时）放置冰上停止培养（如果OD600值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率）。
3．感受态细胞的制备①取上述冰上菌液1 mL于1.5 mL ep管中（根据需要量确定Microtube数量）。
② 1,500×g（微型离心机约4,000 rpm）4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。
③在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution A，轻轻弹动ep使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。
④ 1,500×g 4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。
⑤在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution B，轻轻弹动ep管使沉淀悬浮，勿剧烈振荡。
⑥感受态细胞制作完成。
本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。
在-80℃保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后，不能再进行-80℃保存。
感受态细胞的DNA转化1．将-80℃保存的感受态细胞置于冰上融化10分钟。
2．向100 μl的感受态细胞中加入0.1 ng～10 ng（3 μl～10 μl，一般连接产物用10 μL，质粒用0.5 μL）的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30分钟。
3．42℃水浴中放置45秒钟后，立即于冰中放置1～2分钟。
4．加入900 μL培养基。
5．37℃ 140-160 rpm振荡培养45 min。
6. 离心6000rpm，3min，弃上清，留约100 μL，混匀后涂平板。
酵母感受态yih制备
酵母感受态YIp的制备是一个复杂的过程，涉及到细胞培养、细胞分离、基因转化等多个步骤。
下面将详细介绍酵母感受态YIp的制备过程、注意事项以及可能遇到的问题及其解决方法。
一、准备工作1. 器材和试剂：培养箱、离心机、灭菌锅、移液器、细菌培养皿、显微镜、PCR仪、氯化钙溶液、甘油、感受态细胞质提取液、酵母基因组DNA提取液等。
二、制备步骤1. 酵母细胞培养：选择酵母菌株，将菌株接种到适宜的培养基中，培养酵母细胞。
当酵母细胞生长到适当的密度时，停止培养，用移液器将酵母细胞收集到离心管中，进行离心操作。
2. 细胞分离：将离心后的酵母细胞用氯化钙溶液悬浮，并通过梯度离心法或其他分离方法，将细胞分离得到感受态细胞。
3. 基因转化：将目的基因或质粒DNA与酵母感受态细胞混合，在一定的温度下进行转化。
转化过程中，DNA分子进入酵母细胞并被复制，最终形成基因组整合。
4. 筛选鉴定：通过PCR或酶切等方法对转化细胞进行筛选鉴定，确定是否成功转化。
三、注意事项1. 培养基和环境的控制：要保证培养基的质量和适宜的温度、pH值等环境条件，以保证酵母细胞的正常生长和增殖。
2. 细胞的收集和离心：要确保收集到的酵母细胞数量和质量，以保证感受态细胞的制备效果。
3. 感受态细胞的制备：要保证细胞的活性，避免长时间离心或暴露在空气中，以保持细胞的感受态状态。
4. 转化过程的控制：要确保DNA进入酵母细胞并成功整合，需要控制转化过程中的温度、时间等因素。
5. 筛选鉴定的准确性：要确保筛选鉴定的准确性，需要建立有效的筛选方法和标准，并对筛选结果进行反复验证。
四、可能遇到的问题及其解决方法1. 酵母细胞生长不良：检查培养基的质量和配方，调整培养条件，如温度、pH值、渗透压等。
2. 感受态细胞活性不足：制备过程中要保证细胞的活性，可以尝试增加细胞的离心时间和温度等。
3. 转化效率低：可以尝试增加DNA的浓度、延长转化时间、优化转化条件等方法来提高转化效率。