感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理）感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
1、感受态细胞的概念所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。
被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
感受态细胞的制备和转化
感受态细胞的制备和转化或者：设计好实验项⽬，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）3.细菌培养液，各加⽆菌⽔⾄150µL（不超过200µL）涂LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板（此步骤的⽬的是计算转化率）；对其余各项，分别各取⼀半涂布于LB/ Amp平板上，余下的转化液置4℃冰箱保存。
倒置平板，37℃培养12-14⼩时。
⼀般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌⽐⽆活性酶的细菌⽣长慢，故过夜培养后可见到毫⽶⼤⼩的阳性⽩⾊菌落⽽阴性的兰⾊菌落只有针尖⼤⼩。
5. 将上述菌液摇匀后取100µl 涂布于含Amp的筛选平板上，正⾯向上放置半⼩时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养⽫，37℃培养16-24⼩时。
6. 计算转化率，统计每个培养⽫中的菌落数。
转化后在含抗⽣素的平板上长出的菌落即为转化⼦,根据此⽫中的菌落数可计算出转化⼦总数和转化频率,公式如下：转化⼦总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化⼦数／每mg质粒DNA）＝转化⼦总数／质粒DNA加⼊量(mg)感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化⼦总数／感受态细胞总数[注意] 本实验⽅法也适⽤于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。
但它们的转化效率并不⼀定⼀样。
有的转化效率⾼,需将转化液进⾏多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,⽽有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离⼼),才能较准确的计算转化率。
第四节注意事项与提⽰1. 倒平板时应避免培养基温度过⾼，若温度过⾼，则加⼊的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后表⾯及⽫盖会形成⼤量冷凝⽔，易于造成污染及影响单菌落的形成。
若⽤⼿掌感受培养基觉得很烫但尚可忍受时，培养基温度即为55℃左右。
制备好的LB/Amp平板可于4℃冰箱储存2个⽉，时间过长氨苄青霉素将会失效。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在探究感受态细胞的制备和转化过程，以及相关技术操作和注意事项。
二、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）取出培养皿内的细胞，用PBS洗涤3次；
（2）将洗涤后的细胞加入含有5μM Calcein-AM的PBS中，放置于37℃孵育箱内30分钟；
（3）取出孵育后的细胞，用PBS洗涤3次，即可得到感受态细胞。
2. 转化感受态细胞
（1）将制备好的感受态细胞加入含有荧光素酶底物的培养基中；
（2）放置于37℃孵育箱内15分钟左右；
（3）观察荧光素酶底物是否被转化为荧光素，并记录转化效率。
三、实验结果与分析
经过制备和转化处理后，观察到感受态细胞成功地被转化为荧光素，
并且转化效率较高。
这表明该方法可以有效地制备和转化感受态细胞，并且具有较高的可靠性和重复性。
四、实验注意事项
1. 实验过程中应注意无菌操作，避免细菌和其他杂质的污染；
2. 在制备感受态细胞时，应注意洗涤次数和荧光素酶底物的浓度，以
确保制备的感受态细胞质量和转化效率；
3. 在转化感受态细胞时，应注意荧光素酶底物的加入量和反应时间，
以确保转化效率和荧光素的稳定性。
五、实验结论
本实验通过制备和转化处理，成功地得到了荧光素转化后的感受态细
胞，并且转化效率较高。
这为进一步研究感受态细胞在生物学领域中的应用提供了可靠的技术支持。
感受态细胞的制备与连接产物转化克隆菌株
连接产物的转化效率
转化效率
指单位质量的感受态细胞转化后，能够成功克隆的重组子数量。
影响因素
转化效率受到多种因素的影响，如感受态细胞的制备方法、连接产物的质量和浓度、转化条件等。为了提高转化 效率，需要优化这些因素，并确保感受态细胞的质量和活性。
03 克隆菌株的转化与筛选
转化过程
01
02
03
准备感受态细胞
连接产物浓度
确保连接产物浓度适中，过高或过低都会影响转化效率。
连接产物纯度
去除连接产物中的杂质，如未连接的DNA片段和蛋白质等。
克隆菌株的稳定性与可重复性
克隆稳定性
克隆菌株应稳定，不易发生变异或丢失目的基 因。
可重复性
确保实验结果可重复，避免因菌株变异或其他 未知因素导致的结果不一致。
菌株筛选
对转化后的菌株进行筛选，选择阳性克隆进行后续实验。
优点
方法简单，不需要特殊试剂。
缺点
转化效率相对较低，且不同菌株的感受态制备效果不一致。
人工感受态细胞的制备
人工感受态细胞制备方法
通过化学或电穿孔法处理细菌，使其进入感受态。常用的化学试剂包括CaCl2、DMSO 等。
优点
转化效率高，适用于大多数细菌。
缺点
需要特殊试剂，操作相对复杂。
02 连接产物转化
感受态细胞的制备态细胞的制备 • 连接产物转化 • 克隆菌株的转化与筛选 • 实验注意事项与难点解析
01 感受态细胞的制备
自然感受态细胞的制备
自然感受态细胞制备方法
将细菌在冰冷的0.1M CaCl2溶液中洗涤并悬浮，然后在42℃下热 激处理，使细菌进入感受态。
将细菌培养至对数生长期， 离心收集并用冰冷的0.1M CaCl2洗涤。
感受态细胞的制备及大肠埃希菌转化图文
酶切处理
使用限制性内切酶对质粒进行酶切， 使其具有黏性末端，便于与外源 DNA连接。
纯化质粒
通过凝胶电泳和回收试剂盒对酶切 后的质粒进行纯化，去除杂质。
转化过程
制备感受态细胞
通过化学或电击法将大肠埃希菌的细 胞壁进行预处理，使其处于易于接受 外源DNA的状态。
加入质粒
离心和涂布培养
将转化后的细胞离心收集，涂布在含 有抗生素的选择性培养基上，筛选成 功转化的克隆。
实验原理
感受态细胞制备原理
通过物理或化学方法降低细菌的细胞 壁通透性，使其能够吸收外源DNA 。
大肠埃希菌转化原理
外源DNA与感受态细胞结合，通过细 胞壁的渗透作用进入细胞内，并在细 胞内进行复制和表达。
02
感受态细胞的制备
细菌培养
01
02
03
菌种选择
选择对数生长期的细菌作 为感受态细胞制备的起始 菌种，以保证较高的转化 效率。
CaCl2处理法
CaCl2处理
在细菌培养物中加入适量的CaCl2，使细菌细胞壁产生可逆性损伤，提高感受态细 胞的转化效率。
低渗溶液
将CaCl2处理后的细菌细胞洗涤在低渗溶液中，使细胞壁进一步损伤，提高感受 态细胞的转化效率。
03
大肠埃希菌的转化
准备质粒
提取质粒
从宿主菌中提取出质粒DNA，通 常使用质粒提取试剂盒进行操作。
高转化效率是实现高效基因工程操作的关键因素 之一，因此对转化效率的测定具有重要的实际意 义。
05
结果与讨论
实验结果
成功制备感受态细胞
通过电击法成功制备了感受态细胞，细胞形态无明显变化，生长 状态良好。
大肠埃希菌转化效率高
将外源DNA导入感受态细胞后，成功获得了高转化效率的大肠埃 希菌。
感受态细胞的制备及转化
感受态细胞的制备方法（BL21）1．菌种纯化。
①在LB平板上，用接种环挑取大肠杆菌BL21，在平板上分级划线，以能够出现单菌落为宜。
②将上述划线的平板倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养。
2．菌体培养。
①取20 ml LB培养基至100 mL三角烧瓶中，塞上棉塞后高温高压灭菌，然后冷却至室温。
②在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到①中。
③ 37℃振荡（约120 rpm）培养。
④测定OD值，当OD值达到0.35～0.5时（培养约5小时）放置冰上停止培养（如果OD600值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率）。
3．感受态细胞的制备①取上述冰上菌液1 mL于1.5 mL ep管中（根据需要量确定Microtube数量）。
② 1,500×g（微型离心机约4,000 rpm）4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。
③在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution A，轻轻弹动ep使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。
④ 1,500×g 4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。
⑤在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution B，轻轻弹动ep管使沉淀悬浮，勿剧烈振荡。
⑥感受态细胞制作完成。
本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。
在-80℃保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后，不能再进行-80℃保存。
感受态细胞的DNA转化1．将-80℃保存的感受态细胞置于冰上融化10分钟。
2．向100 μl的感受态细胞中加入0.1 ng～10 ng（3 μl～10 μl，一般连接产物用10 μL，质粒用0.5 μL）的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30分钟。
3．42℃水浴中放置45秒钟后，立即于冰中放置1～2分钟。
4．加入900 μL培养基。
5．37℃ 140-160 rpm振荡培养45 min。
6. 离心6000rpm，3min，弃上清，留约100 μL，混匀后涂平板。
感受态细胞的制备及转化
实验五感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。
通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。
细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。
将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。
通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。
三、试剂与仪器（一）试剂1．0.1mol/L CaCl2称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。
2．LB液体培养基（见实验一）3．LB固体培养基（见实验一）4．氨苄青霉素（100mg/ml）（二）仪器1．冷冻离心机2．平衡天平3．无菌操作台4．微量移液器5．高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。
2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。
3．取1ml菌液（接种）到50 ml LB中(37℃，预热), 扩大培养。
应准备两个培养物。
4．约2小时开始，用一个培养测OD600值（此培养只做测量OD600值用，OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。
OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。
所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。
5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。
6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。
7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。
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13、组织匀浆液 100ml / 全班 80ml水中加18.61g EDTANa.2H2O，用NaOH调PH8，约需2g， 14、酶解液 30 ml（先不加蛋白酶K,灭 后定容至100ml 菌后再加)/ 全班 2、1M Tris 母液 100ml/ 全班 15、无DNase的RNase，先配50ml 3、LB液 50ml / 全班 分装2ml/试管 4、10%SDS储液 50ml / 全班 5、1M HCL 50ml / 全班 6、5xTBE 1000ml / 全班 7、6x上样buffer 10ml / 全班 分装 8、溶液 I 50ml / 全班 分装 9、溶液III 50ml / 全班 分装 10、RTE 30ml / 全班 分装 10mM Tris-HCl,15mM NaCl(pH7.5) 溶液50ml，取出10ml配10mg/ml RNase，沸水浴15min，冷后分装成 小管，-200C 冰箱保存（全班） 16、3M NaAc pH 30ml，计算好量后加 15ml水溶解，用冰乙酸调pH，定容， 灭菌后分装成小管-200C 冰箱保存（全 班）
转化
1、取 200μl感受态细胞，加入DNA(PUC19)2 μl（50ng) 200μ 感受态细胞，加入DNA(PUC19)2
取 200μl感受态细胞，加入2μl无菌水（对照 ） 200μ 感受态细胞，加入2 对照1） 取 200 µl 0.1M的CaCl2 10ml，加入DNA(PUC19)2 μl（50ng) 0.1M的 10ml，加入DNA(PUC19)2 （对照2） 对照2 用枪头混匀，冰上放置30min 用枪头混匀，冰上放置30min 循环水浴热击90S 2、420C循环水浴热击90S 3、冰浴2分钟 冰浴2 液体培养基， 慢摇1 4、每管加800 μlLB液体培养基，370C慢摇1小时 每管加800 lLB液体培养基 已转化的感受态细胞，涂在含Amp Amp的培养皿中 5、100 μl已转化的感受态细胞，涂在含Amp的培养皿中 6、倒置培养过夜（ 370C） 倒置培养过夜（
17、TE 50ml 灭菌后分装成小管-200C 冰 箱保存（全班）
灭菌试剂物品： 灭菌试剂物品：
1、LB液体培养基 LB液体培养基
溶液I 2、溶液I，溶III 18、酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1 150ml 棕色瓶，酚为pH8.0 Tris饱和酚（全班） 3、RTE 19、氯仿:异戊醇＝24:1 100ml 从18中 取50ml加50ml异戊醇（全班） 20、蛋白酶K 10mg/ml 10ml 配好后用 一次性滤器过滤，分装， -200C 冰箱 保存 4、组织匀浆液 5、酶解液 6、TE 7、3M NaAc 1.5ml，2ml小指管 8、 1.5ml，2ml小指管 9、0.5ml小指管20/2组 0.5ml小指管20/2组 小指管20/2 10、 10、枪头 1盒 200ul 1盒/ 1ml 1盒/2组 1盒/2组 1ml 扩口 10个/组 10个 各50个/2组 50个/2组
分子生物学实验
感受态细胞的制备及转化
北京师范大学生命科学学院 生物化学及分子生物系
准备实验一： 准备实验一：感受态的制备与转化
配试剂： 配试剂：
1、0.1M的CaCl2 100ml/2组 、0.1M的 100ml/2组
4、Amp ：50mg/ml 20ml 1ml/管分装 全 、 管分装/全 管分装 班 注意：先将所需烧杯、玻棒、双蒸水、 注意：先将所需烧杯、玻棒、双蒸水、 小指管灭菌后， 小指管灭菌后，在超净台中配制后用一 次性滤器过滤分装后-200C保存 次性滤器过滤分装后 保存 5、LB固体培养基 100ml/组 、 固体培养基 组 胰蛋白胨（ 胰蛋白胨（typtone) NaCl 琼脂粉 1g 1.5g 250ml锥形瓶 锥形瓶 1g 酵母提取物（yeast extract) 0.5g 酵母提取物（
P(LAC) ORI
2686 bp
复苏
ApaLI (1121)
Ampr抗性基因编码一种周质 酶（β-内酰胺酶）可特异地 切割Amp的β-内酰胺环，从 而使其失去杀菌能力
Amp+
实验流程
1、预培养：接单菌落到2ml LB液体培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜 预培养：接单菌落到2ml LB液体培养基中 液体培养基中， 190rpm振荡培养过夜
受体菌： 受体菌：
E.Coli DH5α：R-,M-,Amps,Tcs
+
质粒DNA
外源质粒
ApaLI (178)
P(BLA) ALPHA
42ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱC热击
XmaI (413) SmaI (415)
ApaLI (2367)
EcoRI (397) AvaI (413)
APr
pUC19
BamHI (418) PstI (440) HindIII (448)
思考题 如阴性对照中长出菌， 如阴性对照中长出菌， 原因？ 原因？ 菌的密度过高或培养时 间过长时会在阳性菌的 周围长出一些小的卫星 菌落，它们是Amp 菌落，它们是Amps的， 分析原因
配下次实验试剂
1、0.5M EDTA 母液 100ml/全班
11、75%乙醇 100 ml/ 全班 12、酚：氯仿=1：1 100 ml/ 全班
下周实验前一天下午接 菌，预培养
7、无菌水 100 ml 分装/全班 、 分装 全班 8、CaCl2 、
第三周
时 间 8:00-8:30 8:30-9:30 9:30-11:00 11:00-11:30 11:30-12:00 12:00-5:00 实 验 内 容 摇菌2-3小时 超净台中接菌 摇菌 小时 讲 解 配试剂 午 饭 测OD值 值 感受态的制备与转化 第二天早8： 看结果,收灭菌的物品 第二天早 ：00 看结果 收灭菌的物品 下周实验前一天下午接菌， 下周实验前一天下午接菌，预培养
100ml/全班 2、5M NaOH 100ml/全班 胶塞 LB液体培养基 50ml/组 3、LB液体培养基 50ml/组 胰蛋白胨（ 胰蛋白胨（typtone) 0.5g 酵母提取物（yeast extract) 0.25g 酵母提取物（ NaCl 0.5g 加部分水溶解后加10 10μ 加部分水溶解后加10μl 5M NaOH 定容到50ml 定容到50ml 40ml到250ml锥形瓶 40ml到250ml锥形瓶 2ml到试管，用于预培养 2ml到试管， 到试管 其余到另一试管， 其余到另一试管，用于复苏
0.5ml菌液转移到含 菌液转移到含50ml LB液体培养基的锥形瓶中 液体培养基的锥形瓶中， 2、取 0.5ml菌液转移到含50ml LB液体培养基的锥形瓶中， 370C、250rpm 0.4振荡培养2 小时， 振荡培养2-3小时，至OD600 0.4-0.5 将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min 50ml离心管中 3、将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min 4、离心 6000rpm ，40C，10min 5、到出培养液，将管倒置使培养液流尽 到出培养液， 10ml用枪轻吹悬浮细胞 冰上30min 用枪轻吹悬浮细胞， 6、用冰预冷的0.1M的CaCl2 10ml用枪轻吹悬浮细胞，冰上30min 用冰预冷的0.1M的 0.1M 40C，10min， 7、离心 6000rpm ，40C，10min，去上清 2ml用枪轻吹悬浮细胞 用枪轻吹悬浮细胞， 8、用冰预冷的0.1M的CaCl2 2ml用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作 用冰预冷的0.1M的 0.1M 9、分装细胞，200μl /份，此为感受态细胞，可-700C冻存 分装细胞，200μ /份 此为感受态细胞，
加部分水溶解后加20µl 5M NaOH 加部分水溶解后加 定容到100ml 定容到 灭菌后冷至50 左右 左右， 灭菌后冷至 0C左右，在超净台中加 200 µl Amp(终浓度 终浓度100µg/ml) 终浓度
灭 菌
1、LB液体培养基 、 液体培养基 2、LB液体培养基 、 液体培养基 3、50ml离心管 1个/组 、 离心管 个 组 4、枪头/2组 、枪头 组 5ml 10支 支 1ml 1盒 盒 200ul 1盒 盒 5、培养皿 3套/组 、 套组 6、1.5ml，2ml小管 、 ， 小管 各50个/2组 个 组
阴性对照:去除感受态细胞、 阴性对照:去除感受态细胞、试剂中抗 Amp突变菌的污染影响 突变菌的污染影响， Amp突变菌的污染影响，也排除了 铺固体平板时培养基过热造成Amp 铺固体平板时培养基过热造成Amp 失效的因素
影响转化效率的因素 细菌的生长状态(5X10 细菌的生长状态(5X107个 /ml) 试剂的质量 外源DNA的质量与数量 外源DNA的质量与数量 DNA 器皿的洁净度 污染— 污染—尽量所有打开器皿 盖的操作都在超净台中进 行
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 基本原理 感受态（Competence)： 感受态（Competence)：细菌 处于容易吸收外源DNA的状 处于容易吸收外源DNA的状 DNA 态 转化（transformation)： 转化（transformation)：异源 DNA分子导入受体细胞的过 DNA分子导入受体细胞的过 程 致敏过程: 致敏过程:用理化方法诱导细胞 进入感受态的操作 • 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液 中,菌细胞膨胀成球形,外援 DNA形成抗DNA酶的羟基-钙 磷酸盐混合物黏附于细胞表面, 经短时间420C热击处理,促进 细胞吸收DNA复合物。将细菌 防在非选择性培养基上保温一 段时间，使抗氨苄青霉素的表 型表达后再转到含氨苄青霉素 的选择性培养基上，长出来的 菌即为转入了外源基因的菌株。 • 转化的确切机制还不清楚