禽传染性支气管炎病毒 S1 基因植物表达载体的构建
一株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因分析
一株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因分析谢蟾龙;杨傲冰;尚书文;林德锐【摘要】广西某种鸡场一株IBV,命名为GXJLZ6/150707,对其进行鸡胚发育分析,并测定S1全基因序列.结果显示,鸡胚出现蜷缩胚或发育不良等病理现象.S1基因序列分析发现,分离株GXJLZ6/150707与疫苗株4/91等793/B型毒株为相同的基因来源,与腺胃型毒株LX4型毒株亲缘性较近,氨基酸相似性为94.8％;与经典肾型疫苗毒株D274、Gray、澳大利亚T株和Mass型经典呼吸型疫苗毒株H52、H120和W93株等亲缘性较远,氨基酸相似性为65.7～85.6％.考虑到该种鸡场长期使用活疫苗ND+H120+4/91的情况,因此推测,分离毒株GXJLZ6/150707可能是一种嵌合病毒,即H120等Mass型疫苗毒株与4/91疫苗毒发生重组后形成的新型病毒.本研究结果可为IBV的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据.【期刊名称】《广东畜牧兽医科技》【年(卷),期】2018(043)003【总页数】5页(P29-33)【关键词】传染性支气管炎;分离;鉴定;S1基因分析【作者】谢蟾龙;杨傲冰;尚书文;林德锐【作者单位】广东永顺生物制药股份有限公司,广东广州 511356;广东永顺生物制药股份有限公司,广东广州 511356;广东永顺生物制药股份有限公司,广东广州511356;广东永顺生物制药股份有限公司,广东广州 511356【正文语种】中文【中图分类】S852.65+7鸡传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的高度接触性、急性传染病，以气管啰音、咳嗽和打喷嚏为特征。
可引起料肉比降低、肉鸡品质受损、产蛋量下降和蛋的品质下降等，给养殖业造成严重的经济损失［1，2］。
IBV也能在输卵管复制。
成年鸡感染后产蛋量会下降10～50%或更多，同时畸形蛋数量增多，蛋壳色泽发生改变。
感染鸡群的产蛋率一般不能再恢复到正常水平。
鸡传染性支气管炎病毒合肥分离株S1基因序列及致病性分析
Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报收稿日期：2021-06-16基金项目：国家蛋鸡产业技术体系（CARS-40-K13）；安徽农科院平台项目（2021YL065）；安徽省现代农业产业技术体系六安综合试验站（AHCYJSTX-06-21）作者简介：胡晓苗，男，助理研究员，主要从事家禽传染病研究通信作者：2021,29(6): 22-27·研究论文·摘 要：从安徽合肥一养殖户送检的临床样品中分离到一株鸡传染性支气管炎病毒，命名为HF200702。
分离株在鸡胚盲传3代过程中可引起典型的侏儒胚现象；基于分离株S1基因序列对毒株进行分型结果显示，分离株属于目前流行的QX 型，与H120、M41、4/91、QX 等疫苗株的同源性分别为76.1%、75.6%、78.3%、95.0%；用分离株第10代鸡胚尿囊液感染1日龄SPF 雏鸡，对雏鸡的致死率为41.6%，感染鸡出现精神沉郁、张口呼吸、气管啰音等临床症状以及气管纤毛摆动停滞、肾脏肿大、尿酸盐沉积等病理变化。
感染鸡从感染后第2 d 开始持续向外界排毒直至感染后28 d 。
该研究数据表明，从安徽合肥某养鸡场疑似发生传染性支气管炎的鸡群中分离到QX 型的IBV ，该毒株对雏鸡有较强的致病作用，研究结果为了解该地区IBV 的流行情况提供了参考数据。
关键词：鸡传染性支气管炎病毒；合肥分离株；S1基因序列分析；致病性中图分类号：S852.659.6文献标志码：A文章编号：1674-6422（2021）06-0022-06鸡传染性支气管炎病毒合肥分离株S1基因序列及致病性分析胡晓苗1，盛 豪2，郑忠毅2，卞希一2，张丹俊1，周继勇2，廖 敏2，潘孝成1（1.安徽省农科院畜牧兽医研究所 安徽省畜禽疫病研究中心 畜禽产品安全工程安徽省重点实验室，合肥230031；2.浙江大学 农业农村部动物病毒学重点实验室，杭州310058）Abstract: An Avian infectious bronchitis virus (IBV) strain HF202007 was isolated from clinical samples collected from a farm in Hefei, Anhui province. This isolate caused typical dwarf embryos during 3 blind passages. The genotyping of S1 gene of this isolate showed that it belonged to QX-like type, which was a dominant genotype in China. The allantoic fl uid of chick embryos infected the 10th passage virus was used to infect one day old SPF chickens. The mortality of infected chickens was 41.6%. All the infected chickens showed respiratory signs such as coughing, sneezing and tracheal vocalization. The kidneys of dead birds were swollen, pale and exhibited severe urate deposition. The virus-shedding from infected chickens started 2 dpi until 28 dpi. In summary, QX-like IBV strain HF202007 was isolated from Hefei, Anhui province and pathogenic to young chickens. This study provided a reference for understanding the epidemic situation of IBV in this area.Key words: Avian infectious bronchitis virus; S1gene; sequencing; pathogenicityAnalysis of S1 Gene Sequence and Pathogenicity of an Avian Infectious BronchitisVirus Isolate from Hefei, ChinaHU Xiaomiao 1, SHENG Hao 2, ZHENG Zhongyi 2, BIAN Xiyi 2, ZHANG Danjun 1, ZHOU Jiyong 2,LIAO Min 2, PAN Xiaocheng 1(1. Anhui Province Key Laboratory of Livestock and Poultry Product Safety Engineering, Livestock and Poultry Epidemic Diseases Research Center of Anhui Province, Institute of Animal Husbandry and V eterinary Medicine, Anhui Academy of Agricultural Sciences , Hefei 230031, China; 2 KeyLaboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)· 23 ·第29卷第6期胡晓苗等：鸡传染性支气管炎病毒合肥分离株S1基因序列及致病性分析鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）是一种γ属冠状病毒，引起鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）在全世界范围广泛流行，严重危害家禽的健康养殖。
鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析的开题报告
鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析的开题报告一、研究背景及意义鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，简称IB）是一种由禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的高度传染性呼吸道疾病，其主要临床表现为呼吸困难、鸡冠、眼睛和面部水肿、排泄物增多或减少等，对鸡的健康和养殖业的经济效益造成了很大的损失。
目前，虽然IBV可以通过疫苗预防和控制，但疫苗种类较多，不同毒株的疫苗保护效果不同，到目前为止，还没有一种完全有效的IBV疫苗，为了更好地预防和控制IBV感染，必须进一步深入研究IBV，对其分子特性和病理机理进行深入探究。
二、研究内容及目标本研究旨在通过分离IBV病毒，对其进行鉴定，并分析其S1基因序列，以期更深入地了解IBV的分子特性和病理机理，进而为研究和控制IBV感染提供科学依据和理论支持。
具体研究内容包括以下三个方面：1. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定：本研究将从感染鸡的上呼吸道样本中提取IBV病毒，并通过细胞培养等方法进行纯化和鉴定，确定其毒株类型。
2. S1基因的PCR扩增和测序：本研究将采用PCR技术扩增IBV病毒S1基因序列，并进行测序，获取其S1基因序列。
3. S1基因序列分析：通过对IBV病毒S1基因序列进行分析，包括启动子、终止密码子、保守位点和可变位点等，在比较其与其他IBV序列差异的基础上，研究IBV病毒的分子特性和病理机理。
三、研究方法1. 实验材料：IBV感染鸡的上呼吸道样本、细胞培养液等。
2. 实验方法：（1）IBV病毒分离鉴定：将感染鸡的上呼吸道样本进行稀释后，接种于鸡胚蛋并进行细胞培养，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）和逆转录PCR等方法对样本中IBV病毒进行鉴定。
（2）S1基因PCR扩增和测序：采用PCR技术，合成适合的引物，对IBV病毒中的S1基因进行扩增，经过聚合酶扩增反应、纯化等步骤后，得到S1基因的PCR产物，将其进行测序。
鸡传支气管炎病毒分离及S1基因特性研究
种 急 性 、高 度 接 触 性 传 染 病 。 该 病 一 年 四季 均 可发 生 ，可
感染所有 １ ３龄鸡 只 ，多 发 于 寒 冷 潮 湿 冬 春 季 节 ，雏 鸡 最 为 易
重 。给 控 制 、预 防 本 病 带 来 严 峻 考 验 。本 研 究 应 用 常 规 实 验
按 照 Ｒ Ａ提 取 试 剂 盒 说 明 书 提 取 Ｉ Ｖ Ｒ Ａ。 在 ２ ． Ｎ Ｂ Ｎ ４４ Ｌ
室方法分离广东地 区疑似 Ｉ Ｂ病 原 ．对 Ｓ 基 因 进 行 克 隆 与 特 １
性 鉴 定 ，从 分 子 水 平 解 释 免 疫 鸡 群 发 病 原 因 ，进 一 步 探 讨
（Ｂ ：５’一 ＡＧＧＣ Ｔ ＡＧＧＴ Ｔ ＧＩ Ｃ ３’ ＢＶ２ Ｉ Ｖ１ Ｃ ＣＧ ＣＡ Ｃ Ｔ ｒ 一 ：Ｉ ：５’一
Ａ Ｃ ＧＣ Ｃ Ｇ Ｔ Ｔ Ｃ Ｃ １ｒ ３ ） Ｃ Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ一 ’ ，跨 度 １ ０ ｂ 。 引物 由 上 ６ ０ｐ
海英 骏公 司合 成 ，引物 使用 终浓 度 为 ２ｎ ｏｅ ｍ ，－ ０ ０ ｍ ｌｓ Ｌ ２ ℃保 存 。 ／
管 、支 气 管 、肺 、肾 等 组 织 样 品 ，样 品 １ 、 ３为 区 域 一 不 、２ 同鸡群样 品，样品 ４ 、５为 区 域 二 不 同 鸡 群 样 品 ，样 品 ６为 区域 三 不 同鸡 群 样 品 。
１１２ 材 料 ．．
培 养 １ ４ ．进 行 蓝 ／ ８２ｈ Ａ斑 筛 选 。 挑 取 生 长 良好 白 色 菌 落 接 种于 Ｌ Ｂ培 养 基 中 （ Ａ ５ ｍ ／） 含 ＭＰ Ｏ ｇ ，扩 增 培 养 。按 碱 裂解 法 Ｌ 提 取 质粒 ，以备 进 行 酶切 鉴 定 和 Ｐ Ｒ鉴 定 。 Ｃ
2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析的开题报告
2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析的开题报告【题目】2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析【研究背景】传染性支气管炎是一种由传染性支气管炎病毒引起的家禽呼吸道疾病，能够导致家禽呼吸道炎症和肺部病变。
该疾病对家禽养殖业造成了重大威胁，尤其是在冬季和春季高发期间，其致死率和感染率较高，给养殖业造成了较大的经济损失。
为了更好地控制和管理传染性支气管炎，对2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒进行分离鉴定和S1基因序列分析是非常必要的。
【研究目的】本研究旨在对2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒进行分离鉴定，并通过S1基因序列分析，探究病毒的分布情况、遗传特征等方面的内容，为传染性支气管炎的防治和管理提供基础资料。
【研究内容】本研究将采用细胞培养和RT-PCR技术对2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒进行分离鉴定，同时对其S1基因进行PCR扩增、克隆测序和分析，了解病毒的遗传特征、分布情况等方面的内容。
【研究方法】采用点滴法进行鸡传染性支气管炎病毒的分离培养，并通过RT-PCR技术对病毒进行鉴定。
使用PCR扩增技术对病毒S1基因进行扩增，克隆到载体上，然后进行测序。
通过序列比对和系统进化分析，探究鸡传染性支气管炎病毒的分布情况、遗传特征等方面的内容。
【预期结果】本研究将对2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒进行分离鉴定和S1基因序列分析，明确病毒的分布情况和遗传特征，为传染性支气管炎的防治和管理提供基础数据和理论支持。
【研究意义】随着我国畜禽养殖技术的进步和养殖规模的扩大，传染性支气管炎对家禽养殖业的危害越来越大。
本研究将为传染性支气管炎的防治和管理提供基础资料和理论支持，探究病毒的分布、遗传特征等方面的内容，为科学防控这一疾病提供借鉴。
禽传染性支气管炎病毒 S1 基因植物表达载体的构建
浙江大学学报(农业与生命科学版) 27(3):293～296,2001Journa l of Zheji a ng Un i versity (A gric.&L ife Sci .) 收稿日期:2000212215基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070570)作者简介:吴建祥(1968-),男,浙江诸暨人,硕士,讲师,主要从事免疫学和分子生物学研究Λ文章编号:100829209(2001)0320293204禽传染性支气管炎病毒S 1基因植物表达载体的构建吴建祥,周继勇,程丽琴,沈行燕,丁红梅(浙江大学动物预防医学研究所,浙江杭州310029)摘 要:以含传染性支气管炎病毒(ZJ 971毒株)S 1基因的质粒PBS 为模板,根据其序列设计引物进行PCR 扩增,得到1.7kb 左右的S 1基因产物;用XbalI 和BamH I 酶切纯化,并在T 4DNA 连接酶的作用下,定向克隆到植物表达载体PB I 121中,PCR 及酶切鉴定表明,质粒经三亲交配已导入根癌农杆菌中Λ关 键 词:禽传染性支气管炎病毒;S 1基因;植物表达载体中图分类号:S 858.3;Q 782 文献标识码:AW U J ian 2x iang ,ZHOU J i 2yong ,CH EN G L i 2qin ,SH EN X ing 2yan ,D I N G Hong 2m ei (Institu te of P reven 2tive V eterinary M ed icine ,Z hej iang U niversity ,H ang zhou 310029,Ch ina )The con structi on of plan t expressi on vector of S 1gene of av i a n i n fecti ous branch itis v i rus .Journal of Zhejiang U n iversity (A gric.&L ife Sci .),2001,27(3):293～296Abstract :T he S 1gene of avian infecti ous bronch itis virus (ZJ 971strain )w as amp lified by po lym erase chain reacti on w ith s pecial p ri m ers con tain ing XbalI and BamH I .T he purified PCR p roduct w as digested by the restricted enzym e XbalI and BamH I.T he digested and purified S 1gene of infecti ous bronch itis virus w as cl oned in to p lan t exp ressi on vecto r pB I 121.T he result show s that pB I 121w ith S 1gene w as success 2fully tran sferred in to A g robacterium tum e f aciens (A otum ef aciens )w ith m ethods of PCR and restricted en 2zym es.Key words :avian infecti ous bronch itis virus ;S 1gene ;p lan t exp ressi on vecto r 禽传染性支气管炎病毒(A vian Infecti ousB ranch itis V irus ,I B V )属冠状病毒科冠状病毒属,因I B V 抗原性的漂变可引起呼吸型、肾型、腺胃型、肌肉型等不同病变类型的鸡传染性支气管炎,对养禽业危害极大,是最重要的传染病之一[1]Λ该病毒属单股正链RNA 病毒,具有S 、M 和N 三种结构蛋白ΛS 蛋白是由S 1和S 2组成的寡聚蛋白,S 1和S 2均为糖蛋白多肽,其分子量分别为90kD 和84kD ,用酶去除寡糖后S 1和S 2的分子量分别为64kD 和61kD [2,3]ΛCavanagh[4]确证S 1蛋白是宿主的主要保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体,继而使机体得到保护,在免疫学方面起着重要作用的S 1基因一直是世界各国研究该病毒的热点Λ自20世纪90年代以来,国内外对I B V 的研究取得了长足进展,已有关于I B V S 1基因在昆虫杆状病毒、痘苗病毒等载体中进行表达的报道[5,6],但尚无在植物中表达的报道Λ为探讨植物表达家禽病毒基因的可能性,我们利用已获得的禽传染性支气管炎病毒S1基因成功地构建了植物表达载体系统Λ1 材料与方法1.1 菌种及质粒 大肠杆菌DH5Α,根癌农杆菌EHA105,植物表达载体PB I121,含辅助质粒PBK2013的HB101和含I B V S1基因的PBS质粒取自本所[7]Λ1.2 酶及试剂 所有酶均购自P rom ega公司,PCR纯化K it和割胶回收K it均为德国Q I A GEN公司产品,所有抗生素均为国产分析纯试剂Λ1.3 PCR引物设计与合成 参照已发表的I B V2ZJ971株基因组序列设计[7],并作适当改进:为了便于与PB I121质粒的多克隆位点相连接,在引物5’端引入XbalI酶切位点,在引物3’引入Ba mH I酶切位点ΛPCR引物由上海生物工程公司合成Λ引物的具体序列如下: 5’端引物为52GCTCTA GAA T2 GT T GGTAA CA CCTCT T23’ 3’端引物为5’2CGGGA TCCT TAA2 TAA CTAA CA TAA GGGCA23’1.4 PCR扩增的禽传染性支气管炎病毒S1基因 在PCR反应管中依次加入下列试剂10×T aq P lus I PCR buffer10ΛL,25mmo l L M gC l26ΛL,10mmo l L d N T P混合物2ΛL, 20Λmo l L5’、3’端引物各1ΛL,含S1基因的pBS质粒1ΛL,灭菌M illi Q水78.5ΛL,T aq P lusI(5u ΛL)0.5ΛL,混匀后在表面加入2滴液体石腊Λ然后在PCR仪上94℃预变性2 m in,94℃45s,53℃45s,72℃2m in,共计30个循环进行扩增,最后一个循环后,72℃延伸10m inΛ1.5 禽传染性支气管炎病毒S1基因植物重组表达载体的构建与鉴定 用PCR产物纯化K it纯化PCR产物Λ纯化的I B V S1基因PCR产物用XbalI和Ba mH I 在37℃酶切2h;pB I121质粒用XbalI和Ba mH I在37℃酶切5hΛ酶切产物用Q I A GEN 公司的Gel Ex tracti on K it割胶回收Λ两种酶切产物在16℃条件下用T4DNA L igase连接过夜Λ连接产物全部转化DH5Α感受态细胞,在含卡那霉素50Λg mL的LB固体培养基上挑取单菌落接种,碱法提取重组质粒,用PCR、XbalI 和Ba mH I双酶切来鉴定重组质粒(图1)Λ图1 S1基因植物表达载体的构建F ig.1 The constructi on of p lant exp ressi onvecter of S1gene1.6 禽传染性支气管炎病毒S1基因的植物重组表达载体转化根癌农杆菌 受体农杆菌EHA105于液体YEP培养基中28℃振摇培养,将含帮助质粒pR K2013的菌株HB101和含目的质粒的菌株DH5Α接种于LB培养基上,37℃振摇培养Λ三种菌长到对数生长期时等体积混合,离心弃上清.50ΛL LB 悬浮,涂布于LB固体平板上培养过夜;用少量培养基洗下菌落,以适当倍比稀释后,涂布于含R if、Km和Sm的LB固体平板上培养,24h后长出的菌落按常规的碱法提取质粒,进行PCR 鉴定(图2)Λ492 浙江大学学报(农业与生命科学版) 第27卷 图2 三亲交配示意图F ig .2 T ri parental m ating2 结 果2.1 传染性支气管炎病毒S 1基因的PCR 产物鉴定 PCR 扩增后,取10ΛL 产物经1%琼脂糖电泳,可观察到一条约1.7kb 的片段,与预期的S 1基因大小一致(图3)Λ3,8,12,19为重组质粒,CK 为非重组质粒(PB I121质粒),S1为S1基因PCR 扩增产物;M 为1kb 的DNAM arker图3 S 1基因扩增及植物重组质粒Xba l I 和Bam H I 酶切鉴定结果F ig .3 Amp lificati on of I BV Sigene and digesti on identi 2ficati on of recom binant p las m id w ith Xba and Ba mH I2.2 传染性支气管炎病毒S 1基因植物重组表达载体的构建和鉴定 将酶切纯化的PCR 产物经Xba 和Ba mH I 进行双酶切后定向插入到经相同酶切过的PB I 121载体上,构建成含S 1基因的中间载体Λ在含Km (50Λg mL )的培养基上筛选重组子,经PCR 和双酶切后的电泳分析表明,植物中间表达载体中确实插入了1.7kb 左右的S 1基因(图3,4).3、7、8、12、19为重组质粒,M 为1kb 的DNA M arker ,CK 为非重组质粒PB I 121质粒图4 重组质粒S 1基因PCR 扩增产物F ig .4 PCR p roduct of S 1gene of recom binant p las m id3、7、8、12、19为转化子;1为S1基因;M 为1kb DNA M arker图5 转化子的PCR 鉴定F ig .5 Identificati on of transfor m ant by PCR2.3 根癌农杆菌的转化与鉴定 以pR K 2013为辅助质粒,通过三亲交配的方式转化农杆菌Λ在R if (100Λg mL )的LB 培养基上筛选转化子,挑取20个单菌落接种,用592 第3期 吴建祥,等 禽传染性支气管炎病毒S 1基因植物表达载体的构建 碱法抽提质粒,并以该质粒为模板,以S1基因的特异引物进行PCR扩增Λ结果表明:大多数转化子1,3,7,8,12,19均能扩增出与S1基因大小相同的1.7kb片段(图5)Λ3 讨 论 20世纪80年代以来,植物转基因工程在植物改良上取得了许多成就(如抗病水稻,抗虫棉等)[8,9],在生物医药方面作为生物反应器,也有巨大的潜在优势Λ1992年,M as on等[10]就乙肝表面抗原在转基因植株中表达一文中,提出了用转基因植物生产疫苗的概念ΛT ubo ly等在转基因烟草中表达了猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因并研究了其表达产物的免疫原性[11]Λ与常规疫苗及其他新技术疫苗相比,转基因植物疫苗具有生产简单、安全、廉价及保存和运输方便等优点,是目前世界各国新型疫苗研究的热点之一Λ我们利用禽传染性支气管炎病毒的S1基因成功构建了植物表达载体,并转化了根癌农杆菌,为进一步分析转基因马铃薯所表达的I B V S1基因产物的免疫原性及禽传染性支气管炎植物疫苗的研究打下了基础Λ虽然转基因植物疫苗存在外源蛋白的免疫原性、表达水平低及糖基化等问题,但用植物生产外源蛋白质则是安全廉价的生产系统,很有吸引力ΛReferences:[1] Y I N Zhen,L I U jing2hua(殷震,刘景华).A ni m al V irolo2gy(动物病毒学)[M],2nd ed.Beijing:Science P ress,1997.(in 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传染性支气管炎病毒广西分离株S1基因克隆与序列分析
１ 材 料 与方 法
１ ． １ 材 料
性、 高度 接 触性 传 染 病 ， 主要 侵 害 呼 吸 系统 、 消化 系 统 和泌 尿 生殖 系统 。Ｉ Ｂ Ｖ 由于其 特殊 的复 制机 制 和 Ｒ ＮＡ 聚合 酶校 对机 制 ， 使得 病毒 基 因组 极 易发 生 基
１ ． １ ． １ 毒株
大量 研究 表 明［ ５ ］ ， ｓ １蛋 白可诱 导 血 凝 抑 制 抗 体 和
中和 抗体 ， 血 清特 异性 抗原 决定 簇也 主要 针 对 Ｓ １蛋
白 ， 所以 Ｓ １蛋 白 与 Ｉ Ｂ Ｖ 的 免 疫 原 性 关 系 最 密
１ ． １ ． ３ 主要 试 剂 Ａｘ ｙ Ｐ ｒ ｅ ｐ体 液 病 毒 ＤＮＡ／ ＲＮＡ
鸡传 染 性支 气 管炎 （Ｉ ｎ ｛ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｕ ｓ ｂ ｒ ｏ ｎ ｃ ｈ ｉ ｔ ｉ ｓ ，Ｉ Ｂ ）
是 由冠状 病 毒科 冠状 病毒 属 的传 染性 支 气 管炎 病 毒
（Ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｕ ｓ ｂ ｒ ｏ ｎ ｃ ｈ ｉ ｔ ｉ ｓ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，Ｉ Ｂ Ｖ ） 引 起 的 一 种 急
损 失 。为及 时 了解传 染性 支 气管 炎病 毒 （ Ｉ Ｂ Ｖ） 的 变异 情 况 ， 从 而进 行 更 有 效 的 防控 ， 本研究对 ２ ０ １ ２年 分 离 自广西 的 ８株 Ｉ Ｂ Ｖ的 ｓ １ 基 因进 行 了序 列测 定与 分析 。参 考 Ｎ Ｃ Ｂ Ｉ 上的Ｉ Ｂ Ｖ ｓ １基 因序 列 ， 设计 合 成 了一对
ＧＸ １ 一 ＧＸ ８分 离 株 ， 均 由广 东 温 氏 食
品集 团股份 有 限公 司技 术 中心 禽 病 室 于 日龄 的 肉鸡 中 ， 经 ＲＴ — Ｐ Ｃ Ｒ
表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建
Ｖ ｏ１ ． Ｎ ｏ． ２８． ４
Ｊ ｌ ２ ０ ｕｙ ０ ６
表达传染性支气 管炎病毒Ｓ 基 因重组鸡痘病毒的构建 １
田 占成 ，孙 永 科 ，王 云峰 ，智 海 东 ，刘胜 旺 ，王 玫 ，童 光 志
（． １ 中国农 业科 学院 哈尔 滨兽 医研 究所 兽 医生 物技 术 国家重 点实 验室 ，黑龙 江 哈 尔滨 １００ ； ５０ １ ２ 内蒙古 农 业大 学 动 物科 技 学院 ，内蒙 古 呼和 浩特 ００ １） ． １０８
摘 要 ：将 鸡传 染性 支气 管炎病毒ｓ 基 因插入到 鸡痘病毒 转移载体ｐ Ｙ ８ 中，获得 重组转移 载体ｐ Ｙ ８ 。 １ Ｓ ６１ Ｓ ６ １ 将ｐ Ｙ ８ 一 Ｖ １ 染 已感染亲本鸡痘病 毒ＳＦ Ｖ ０７ 的鸡胚成纤 维细胞 ，使其在 鸡胚 成 纤维细胞 内与鸡痘病 Ｓ ６１Ｂ Ｓ 转 Ｉ ．Ｐ ．１株 毒基 因组发 生同源重组 ，产生表 达鸡Ｉ Ｖ Ｓ 蛋 白的重组 鸡痘病 毒ｒＰ ． Ｖ １ Ｂ １ Ｆ Ｖ Ｉ Ｓ 。在含 有Ｘ ｇｌ Ｂ － 的营养 琼脂培养基 ａ 上进行 蓝斑 筛选且进一步纯化 １代。ｓ 基 因的Ｐ Ｒ ４ １ Ｃ 检测表 明，获得 的含传 染性 支气管 炎病毒ｓ 基 因的重组鸡痘 １
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第 ２ 卷 第 ４期 ８
２０ 年 ０６ ７ 月
中 国 预 防 兽 医 学 报
Ｃｈ ｎ ｓ ｏ ｒ ａ ｆＰ ｅ ｅ ｔ ｅ Ｖｅ ｅ ｉ ａｙ Ｍ ｅ ｉｉ ｅ ｉｅ ｅ Ｊ ｕ ｌｏ ｒ ｖ ｎ ｉ ｔｒｎ ｒ ｄ ｃｎ ｎ ｖ
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浙江大学学报(农业与生命科学版) 27(3):293～296,2001Journa l of Zheji a ng Un i versity (A gric.&L ife Sci .) 收稿日期:2000212215基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070570)作者简介:吴建祥(1968-),男,浙江诸暨人,硕士,讲师,主要从事免疫学和分子生物学研究Λ文章编号:100829209(2001)0320293204禽传染性支气管炎病毒S 1基因植物表达载体的构建吴建祥,周继勇,程丽琴,沈行燕,丁红梅(浙江大学动物预防医学研究所,浙江杭州310029)摘 要:以含传染性支气管炎病毒(ZJ 971毒株)S 1基因的质粒PBS 为模板,根据其序列设计引物进行PCR 扩增,得到1.7kb 左右的S 1基因产物;用XbalI 和BamH I 酶切纯化,并在T 4DNA 连接酶的作用下,定向克隆到植物表达载体PB I 121中,PCR 及酶切鉴定表明,质粒经三亲交配已导入根癌农杆菌中Λ关 键 词:禽传染性支气管炎病毒;S 1基因;植物表达载体中图分类号:S 858.3;Q 782 文献标识码:AW U J ian 2x iang ,ZHOU J i 2yong ,CH EN G L i 2qin ,SH EN X ing 2yan ,D I N G Hong 2m ei (Institu te of P reven 2tive V eterinary M ed icine ,Z hej iang U niversity ,H ang zhou 310029,Ch ina )The con structi on of plan t expressi on vector of S 1gene of av i a n i n fecti ous branch itis v i rus .Journal of Zhejiang U n iversity (A gric.&L ife Sci .),2001,27(3):293～296Abstract :T he S 1gene of avian infecti ous bronch itis virus (ZJ 971strain )w as amp lified by po lym erase chain reacti on w ith s pecial p ri m ers con tain ing XbalI and BamH I .T he purified PCR p roduct w as digested by the restricted enzym e XbalI and BamH I.T he digested and purified S 1gene of infecti ous bronch itis virus w as cl oned in to p lan t exp ressi on vecto r pB I 121.T he result show s that pB I 121w ith S 1gene w as success 2fully tran sferred in to A g robacterium tum e f aciens (A otum ef aciens )w ith m ethods of PCR and restricted en 2zym es.Key words :avian infecti ous bronch itis virus ;S 1gene ;p lan t exp ressi on vecto r 禽传染性支气管炎病毒(A vian Infecti ousB ranch itis V irus ,I B V )属冠状病毒科冠状病毒属,因I B V 抗原性的漂变可引起呼吸型、肾型、腺胃型、肌肉型等不同病变类型的鸡传染性支气管炎,对养禽业危害极大,是最重要的传染病之一[1]Λ该病毒属单股正链RNA 病毒,具有S 、M 和N 三种结构蛋白ΛS 蛋白是由S 1和S 2组成的寡聚蛋白,S 1和S 2均为糖蛋白多肽,其分子量分别为90kD 和84kD ,用酶去除寡糖后S 1和S 2的分子量分别为64kD 和61kD [2,3]ΛCavanagh[4]确证S 1蛋白是宿主的主要保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体,继而使机体得到保护,在免疫学方面起着重要作用的S 1基因一直是世界各国研究该病毒的热点Λ自20世纪90年代以来,国内外对I B V 的研究取得了长足进展,已有关于I B V S 1基因在昆虫杆状病毒、痘苗病毒等载体中进行表达的报道[5,6],但尚无在植物中表达的报道Λ为探讨植物表达家禽病毒基因的可能性,我们利用已获得的禽传染性支气管炎病毒S1基因成功地构建了植物表达载体系统Λ1 材料与方法1.1 菌种及质粒 大肠杆菌DH5Α,根癌农杆菌EHA105,植物表达载体PB I121,含辅助质粒PBK2013的HB101和含I B V S1基因的PBS质粒取自本所[7]Λ1.2 酶及试剂 所有酶均购自P rom ega公司,PCR纯化K it和割胶回收K it均为德国Q I A GEN公司产品,所有抗生素均为国产分析纯试剂Λ1.3 PCR引物设计与合成 参照已发表的I B V2ZJ971株基因组序列设计[7],并作适当改进:为了便于与PB I121质粒的多克隆位点相连接,在引物5’端引入XbalI酶切位点,在引物3’引入Ba mH I酶切位点ΛPCR引物由上海生物工程公司合成Λ引物的具体序列如下: 5’端引物为52GCTCTA GAA T2 GT T GGTAA CA CCTCT T23’ 3’端引物为5’2CGGGA TCCT TAA2 TAA CTAA CA TAA GGGCA23’1.4 PCR扩增的禽传染性支气管炎病毒S1基因 在PCR反应管中依次加入下列试剂10×T aq P lus I PCR buffer10ΛL,25mmo l L M gC l26ΛL,10mmo l L d N T P混合物2ΛL, 20Λmo l L5’、3’端引物各1ΛL,含S1基因的pBS质粒1ΛL,灭菌M illi Q水78.5ΛL,T aq P lusI(5u ΛL)0.5ΛL,混匀后在表面加入2滴液体石腊Λ然后在PCR仪上94℃预变性2 m in,94℃45s,53℃45s,72℃2m in,共计30个循环进行扩增,最后一个循环后,72℃延伸10m inΛ1.5 禽传染性支气管炎病毒S1基因植物重组表达载体的构建与鉴定 用PCR产物纯化K it纯化PCR产物Λ纯化的I B V S1基因PCR产物用XbalI和Ba mH I 在37℃酶切2h;pB I121质粒用XbalI和Ba mH I在37℃酶切5hΛ酶切产物用Q I A GEN 公司的Gel Ex tracti on K it割胶回收Λ两种酶切产物在16℃条件下用T4DNA L igase连接过夜Λ连接产物全部转化DH5Α感受态细胞,在含卡那霉素50Λg mL的LB固体培养基上挑取单菌落接种,碱法提取重组质粒,用PCR、XbalI 和Ba mH I双酶切来鉴定重组质粒(图1)Λ图1 S1基因植物表达载体的构建F ig.1 The constructi on of p lant exp ressi onvecter of S1gene1.6 禽传染性支气管炎病毒S1基因的植物重组表达载体转化根癌农杆菌 受体农杆菌EHA105于液体YEP培养基中28℃振摇培养,将含帮助质粒pR K2013的菌株HB101和含目的质粒的菌株DH5Α接种于LB培养基上,37℃振摇培养Λ三种菌长到对数生长期时等体积混合,离心弃上清.50ΛL LB 悬浮,涂布于LB固体平板上培养过夜;用少量培养基洗下菌落,以适当倍比稀释后,涂布于含R if、Km和Sm的LB固体平板上培养,24h后长出的菌落按常规的碱法提取质粒,进行PCR 鉴定(图2)Λ492 浙江大学学报(农业与生命科学版) 第27卷 图2 三亲交配示意图F ig .2 T ri parental m ating2 结 果2.1 传染性支气管炎病毒S 1基因的PCR 产物鉴定 PCR 扩增后,取10ΛL 产物经1%琼脂糖电泳,可观察到一条约1.7kb 的片段,与预期的S 1基因大小一致(图3)Λ3,8,12,19为重组质粒,CK 为非重组质粒(PB I121质粒),S1为S1基因PCR 扩增产物;M 为1kb 的DNAM arker图3 S 1基因扩增及植物重组质粒Xba l I 和Bam H I 酶切鉴定结果F ig .3 Amp lificati on of I BV Sigene and digesti on identi 2ficati on of recom binant p las m id w ith Xba and Ba mH I2.2 传染性支气管炎病毒S 1基因植物重组表达载体的构建和鉴定 将酶切纯化的PCR 产物经Xba 和Ba mH I 进行双酶切后定向插入到经相同酶切过的PB I 121载体上,构建成含S 1基因的中间载体Λ在含Km (50Λg mL )的培养基上筛选重组子,经PCR 和双酶切后的电泳分析表明,植物中间表达载体中确实插入了1.7kb 左右的S 1基因(图3,4).3、7、8、12、19为重组质粒,M 为1kb 的DNA M arker ,CK 为非重组质粒PB I 121质粒图4 重组质粒S 1基因PCR 扩增产物F ig .4 PCR p roduct of S 1gene of recom binant p las m id3、7、8、12、19为转化子;1为S1基因;M 为1kb DNA M arker图5 转化子的PCR 鉴定F ig .5 Identificati on of transfor m ant by PCR2.3 根癌农杆菌的转化与鉴定 以pR K 2013为辅助质粒,通过三亲交配的方式转化农杆菌Λ在R if (100Λg mL )的LB 培养基上筛选转化子,挑取20个单菌落接种,用592 第3期 吴建祥,等 禽传染性支气管炎病毒S 1基因植物表达载体的构建 碱法抽提质粒,并以该质粒为模板,以S1基因的特异引物进行PCR扩增Λ结果表明:大多数转化子1,3,7,8,12,19均能扩增出与S1基因大小相同的1.7kb片段(图5)Λ3 讨 论 20世纪80年代以来,植物转基因工程在植物改良上取得了许多成就(如抗病水稻,抗虫棉等)[8,9],在生物医药方面作为生物反应器,也有巨大的潜在优势Λ1992年,M as on等[10]就乙肝表面抗原在转基因植株中表达一文中,提出了用转基因植物生产疫苗的概念ΛT ubo ly等在转基因烟草中表达了猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因并研究了其表达产物的免疫原性[11]Λ与常规疫苗及其他新技术疫苗相比,转基因植物疫苗具有生产简单、安全、廉价及保存和运输方便等优点,是目前世界各国新型疫苗研究的热点之一Λ我们利用禽传染性支气管炎病毒的S1基因成功构建了植物表达载体,并转化了根癌农杆菌,为进一步分析转基因马铃薯所表达的I B V S1基因产物的免疫原性及禽传染性支气管炎植物疫苗的研究打下了基础Λ虽然转基因植物疫苗存在外源蛋白的免疫原性、表达水平低及糖基化等问题,但用植物生产外源蛋白质则是安全廉价的生产系统,很有吸引力ΛReferences:[1] Y I N Zhen,L I U jing2hua(殷震,刘景华).A ni m al V irolo2gy(动物病毒学)[M],2nd ed.Beijing:Science P ress,1997.(in 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