场强化_微波_超声波技术在固相多肽合成中的应用_邓玉营

场强化———微波、超声波技术在固相多肽合成中的应用邓玉营　张文雯(常州工程职业技术学院应用化学技术系,常州江苏213164)摘　要　综述了两种场强化技术———微波和超声波在固相多肽合成中的研究进展,重点介绍了它们的作用机理、在强化多肽合成中的应用及反应器设计进展情况。

关键词　微波　超声波　固相多肽合成　场强化收稿日期:2007-01-18作者简介:邓玉营(1978～),男,硕士,助教,从事生物技术方向研究Application of Fields Enhancement in Solid Phase Peptide SynthesisDeng Yuying Zhang Wen wen(Department of Appliance Chemical Technology ,Changzhou Institute ofEngineering Technology ,Jiangsu Changzhou 213164)A bstract The application of microwave and ultrasonic as two fields enhancement techniques in solid phase peptidesynthesis was reviewed .The mechanism ,enhancing peptide synthesis and advancement in the reactor design were empha -sized .Keywords microwave ultrasonic wave solid phase peptide synthesis fields enhancement 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质,且常经过糖苷化、磷酸化或酰化衍生,具有安全、副作用小,用量小以mg 计,功能多样、特异性强等特点,在细胞生理及代谢功能的调节上具有重要的作用[1～4]。

据Frost &Sullivan 统计,目前全世界上市的多肽类药物已超过40种,还有270种正在临床试验中以及400多种正处于临床前的研究中。

其中,仅治疗型多肽药物的市场已达到每a10亿美元,而且还以每a 10.5%的速度在增长。

由此可见,多肽药物具有并存在巨大的潜在市场前景。

自1963年Merri -field [5]提出多肽固相合成的思想,经过40多a 的完善和发展,现在多肽固相合成技术已经成为多肽合成中的一种常规技术。

尽管固相多肽合成具有方便、简单等优越性,但是由于其反应的非均相性,所以仍然存在许多问题,如反应慢且不完全、载体溶胀性问题以及溶剂选择受限制等。

其中有些问题还相当突出,如合成较长的肽链时反应时间特别长还不能反应完全,导致产生大量副产物,给分离造成很大的困难[6、7]。

因此,任何能够进一步提高反应效率,减少反应时间的技术就成为目前固相多肽合成的又一个新的关注点。

随着学科之间的交叉应用,物理场强化在化学中也有了越来越多的应用[8～10],本文主要综述了微波和超声波这两种场强化技术在多肽合成中的应用。

1微波技术及其在多肽固相合成中的应用1.1　微波作用原理及在有机合成中的应用微波是频率大约在300MHz ～300GHz ,即波长在100cm 至1mm 范围内的电磁波。

它位于电磁波谱的红外辐射(光波)和无线电波之间[11]。

微波在有机反应中具有以下的特点[12]:①加快反应速度,缩短反应时间;②提高反应转化率;③微波辐射下不引起反应产物的改变。

微波的作用机理目前存在两种解释[13]:机理一:—63—第21卷第3期2007年3月 化工时刊Chemical Industry Times Vol .21,N o .3Mar .3.2007D OI :10.16597/j .cn ki .iss n .1002-154x .2007.03.020微波技术仅仅是一种加热手段,无论微波加热还是普通加热方法,反应的动力学不变。

机理二:微波技术除具有热效应外,还存在微波的特殊效应,微波催化了反应的进行,降低了反应的活化能,也就是说改变了反应动力学。

从1986年至今短短20a时间,微波促进有机反应的研究已发展成为一门引入注目的全新领域———MORE化学(Microwave-induced Orgmnic Reaction En-hancement Chemistry)。

目前,在德、英、法、美、日等外国微波有机化学的研究进展迅速,据报道现已在相当多类型的有机反应中进行了研究,酯化、烷基化、Diels -Alder反应、Claisen反应、Ene反应、氧化、重排、缩合、Tipson-Cohen反应、皂化、Knoevenegel反应、Refor-mafsky反应、醛合成腈、Krapcho反应、成环反应、碳烯制备、酯交换反应、环合反应、卟啉合成等方面取得了相当的研究成绩[11]。

1.2　微波在多肽合成中的应用虽然微波在许多有机反应中应用都取得了成功,但是把微波技术用于多肽固相合成的首次报道仅始于1992年[14]。

原因主要是:微波反应器技术落后阻碍了微波在多肽合成中的应用。

早期的微波反应器没有温控装置,仅仅靠功率和反应时间来控制反应的进行,技术落后,从而阻碍了微波作为一种强化技术在多肽合成中的应用。

随着微波技术在其它有机合成中的广泛应用,大大促进了微波技术在多肽固相合成中的应用,出现了更为先进的专门适合于多肽合成的微波反应器。

本文从微波在固相合成多肽、多肽衍生物及微波多肽合成反应器3个方面综述微波的应用。

1.2.1　微波应用于合成多肽1992年,中国台湾大学的于辉明等[14]采用普通微波炉改造的微波反应装置,以D MF为反应溶剂,首次进行了微波辅助合成困难二肽的研究,结果表明:在55℃下,微波辐射6min,含有侧链立体阻碍氨基酸的两种困难二肽Ile-Gly、Val-Ile的缩合率均达到100%,和常规方法相比,产率分别提高了21%和40%。

他们又以Gly-HMP树脂作为起始物,采用Fmoc-氨基酸的HOBt活泼酯为原料微波辅助下合成了困难多肽Acp65～74。

每步缩合反应微波辐射时间均为4min,合成结果与常规方法及多肽合成仪的结果分别进行了比较,见表1。

表1　合成方法对Acp氨基酸间缩合效率的影响合成方法每步的连接效率/(%)微波辐射99.910010099.899.599.999.999.799.8常规方法80.483.187.994.893.176.770.579.983.4多肽合成仪99.499.910099.898.999.998.999.799.5↑↑↑↑↑↑↑↑↑H-Val—G l n—Ala—Al a—Ile—Asp—Tyr—Il e—As n—Gl y-Res in从表1中结果可见,与常规方法及多肽合成仪方法相比较,采用微波辅助方法,每步的缩合效率明显提高,均在99.5%以上。

采用多肽合成仪合成,缩合效率也在98.9%以上,但是其氨基酸用量是以树脂的10倍为代价的,合成成本过高,不适合放大生产。

而采用常规方法合成,缩合效率平均仅83.3%,9步缩合后产率仅为19.3%,其中含有大量杂肽,与目标肽性质非常接近而难以分离,从而导致合成失败。

比较自动合成仪和微波辅助合成Acp的产率,采用微波固相合成得率为79.0%,而采用多肽合成仪的合成得率为69.4%。

多肽合成仪中每步的缩合反应大概需要45min,而微波中仅需4min即可完成。

结果表明,采用微波辐射方法,大大缩短了反应时间,并提高了产物产率。

从此,拉开了微波在多肽固相合成应用中的序幕。

但是由于于辉明等采用的反应器是用家用微波炉改装的,反应温度不能控制,且微波发射方式是多模形式而非单模,反应的重复性受到质疑。

由于没有发明更为先进的微波反应装置,微波在多肽固相合成中的应用也就暂时停滞下来。

直到2002年,Mate Erdelyi等[15]采用了新式的单模微波反应器,反应温度、压力均可在线控制,应用于多肽固相合成中一些有立体阻碍性的Fmoc氨基酸(如Val,Thr,Ile)的连接。

研究发现对于不同的偶合试剂(HATU,TB TU, PYB OP,Mukaiya ma's reagents),最优的偶合条件都不同。

基本上,在1.5～20min内(反应温度一般在110℃以上),缩合反应都能完成,并且不产生氨基酸消旋。

相比于常规的固相多肽偶合反应(反应时间超过30min),反应速度提高了2～4倍以上,并且一次缩合反应就能完全。

在此之后,由于世界多肽药物市场的急剧膨胀及先后出现了更加精密的微波反应器及专门的适合多肽固相合成的反应器,大大加速了微波在多肽固相合成中的应用。

—64—化工时刊　2007.Vol.21,No.3 论文综述《Overview of Thesises》微波除了应用于多肽固相合成中最重要的步骤———缩合反应以外,还逐渐延伸到合成后的脱保护反应中,并取得了满意的结果。

Sebestik等[16]采用微波辐射方法脱除多肽—NH2和—C OOH上的保护基B oc 和t—Bu,通过提高微波辐射量及延长微波作用时间,可使得反应进行完全。

Mafia Caterina Daga等[17]用微波辅助方法脱除多肽的氨基保护基———N-Cbz 和N-Bn,以异丙醇为溶剂,Pd/C为催化剂, HCOONH4为质子供体,600W微波辐射3次,每次1min,脱保护反应完全,并且没有二酮哌嗪副反应的发生。

若采用常规方法,以甲苯为溶剂,反应5h,或者以甲醇为溶剂反应12h,获得的产物中含有20%～40%的副产物二酮哌嗪。

1.2.2　微波应用于合成多肽衍生物微波在多肽合成中的成功应用,大大推动了微波技术应用于多肽衍生物合成的发展。

多肽衍生物包括环肽、糖肽、巯酯肽、核酸肽以及一些含有非天然氨基酸或者受到特殊修饰的多肽。

多肽环化在生物体内有着重要的生理作用,可以提高多肽的生物利用度及对特定生物靶向目标的选择性,但是成环反应一般时间长,即使在高温下,产率也很低。

B yk Gerardo 等[18]采用改造的家用微波炉,以D MF为溶剂,反应1～30min,含有R GE序列的多肽产率在15%～25%之间,提高了产率,大大缩短了反应时间。

Nagaike Fu-mihiro等[19]采用微波辐射方法合成巯酯肽取得了较高的产率。

采用家用微波炉改造的反应器,功率150W,反应温度为80℃,多肽在40%MPA反应30min即可完全巯酯化;若MPA浓度降为10%和20%,反应完成需要60min,分离后肽巯酯的产率分别达到4.2%和3.7%。

和以前的文献报道相比,产率均提高了两倍多。

这表明采用微波方法可以大大提高巯酯肽的合成效率和产率。