最新Westernblot所需溶液的配制
Western blot 试剂与操作步骤
[主要试剂]1、SDS-PAGE 试剂：2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。
3、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O 定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O 至1000ml。
5、膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml 的0.01M PBS 中。
6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H202 1.0μl。
7、兔抗猪R 蛋白抗体、HRP 标记羊抗兔IgG（二抗）。
[操作步骤]1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。
然后4℃，13,000g 离心15min。
取上清液作为样品。
2、电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3、转移（半干式转移）：（1）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3 次。
（2）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC 膜，浸入转膜缓冲液中10min。
（3）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24 层滤纸、NC 膜、凝胶、24 层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC 膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g 重物，将碳板上多余的液体吸干。
接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。
转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。
将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s 后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
WESTERNBLOT常用液体配方
WESTERN BLOT常用液体配方1 、凝胶储备液（30%Acr/Bise）acrylamide 58gBis - acrylamide 2g加超纯水溶解（约100ml）定容至200毫升。
4℃棕色瓶避光保存2 、Gel buffer pH：8.8 （分离胶用）Tris-base 36.3g加超纯水溶解（约100ml）用浓HCL调pH值至8.8加超纯水定容至200ml 4℃保存3 、Gel buffer pH：6.8 （浓缩胶用）Tris-base 12.1g加超纯水溶解（约100ml）用浓HCL调pH值至6.8加超纯水定容至200ml 4℃保存4 、10%APS：过硫酸铵（APS）0.1g加超纯水至1ml新鲜配制，4℃可保存10天。
5 、10%SDS(十二烷基磺酸钠)SDS 10g加超纯水至100ml 室温保存。
6 、10× TBSTris-base 61gNaCl 90g加超纯水溶解调pH值至7.6定容至1000ml7、10×电泳缓冲液（Running buffer）Tris-base 30.3gGlycine 144gSDS 10g加超纯水定容至1000ml8 、转膜液（1000ml）Tris-base 3.03gGlycine 14.4g加超纯水至850ml ，加甲醇150ml9 、杂交液（稀释抗体用）0.05g BSA加TBST至50ml 4℃保存10、TBST 洗膜液1X TBS 1000ml（取900ml 超纯水+ 100ml 10× TBS）加Tween 20 1ml11、封闭液（1%BSA）0.4g BSA加TBST至40ml 摇匀※※必须现用现配※※※※备注：凝胶储备液（30%Acr/Bise）剧毒，操作时请自带口罩，手套。
TEMED有刺激性气味，注意防护。
10X液体为储备液，请稀释至1X使用。
western blot各种液体配制
一、所需试剂的配制1、丙烯酰胺贮存液（30%Acr/Bic）丙烯酰胺（Acr）29.2gN，N-甲叉双丙烯酰胺（Bic）0.8g超纯水至100ml37度溶解，4度避光保存一个月，使用时恢复至室温且无沉淀。
2、分离胶缓冲液（4×）（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：Tris（MW121.14）18.15g超纯水90ml用HCl调pH值至8.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
3、浓缩胶缓冲液（4×）（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）:Tris（MW121.14）12.1g超纯水90ml用HCl调pH值至6.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
4、10%十二烷基硫酸钠（SDS）SDS 10g蒸馏水至100ml50度水浴溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶解后仍可使用。
5、10%过硫酸铵（Aps）Aps 0.1g超纯水1ml溶解后4度避光保存，保存时间为一周，现用现配，也可-20度保存6、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）：避光保存。
7、2×上样缓冲液（2×Loading Buffer）：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.8ml10%SDS（电泳级）2ml溴酚蓝0.5mg甘油0.8ml2-巯基乙醇0.2ml蒸馏水 1.2ml总量为5ml，可在4度存放数周，-20存放数月。
（其中2-巯基乙醇可保护二硫键，并使蛋白下沉用利于电泳的进行。
）8、电泳缓冲液（pH8.3）Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4gSDS 1g或10%SDS 10ml蒸馏水至1L无需调pH值（8.2~8.3），可在4度存放数周，次溶液可重复使用3~5次。
9、转移缓冲液：Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4g甲醇200ml蒸馏水至1L先用蒸馏水溶解甘氨酸和Tris，然后再加入甲醇，最后补足液体。
无需调pH值（8.1~8.4），可在4度存放数周。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
Western Blot Protocol
Western Blot Protocol1.SDS-PAGE试剂的配制1)40%丙烯酰胺溶液(Acrylamide)2)10%过硫酸铵溶液(APS)3)TEMED4)分离胶缓冲液4X Buffer (pH 8.8)5)浓缩胶缓冲液4X Buffer (pH 6.8)6)10X电泳缓冲液(Running buffer)2.制胶1)10%分离胶的制备ddH2O 4.92ml 9.98mlTris-HCl缓冲液（pH 8.8，1.5mol/l） 2.5ml 5ml40%丙烯酰胺 2.48ml 4.96ml10% APS 100μl 200μlTEMED 4μl 8μl10%分离胶10ml 20ml2)灌注分离胶在加完TEMED后，速在两玻璃板间灌注丙烯酰胺溶液，预留1.5cm灌注浓缩胶（约在夹子高度稍低），应排除凝胶底部玻璃与板间的气泡。
用移液枪在丙烯酰胺溶液上层覆盖无水乙醇约4ml（至溢出），凝胶静置室温30min。
30min后，分离胶聚合凝固，倾倒出上层覆盖的无水乙醇，并用滤纸吸尽残留的液体。
3)5%浓缩胶的制备ddH2O 2.5ml 5mlTris-HCl缓冲液（pH 8.8，1.5mol/l）1ml 2ml40%丙烯酰胺0.46ml 0.92ml10% APS 40μl 80μlTEMED 2μl 4μl浓缩胶4ml 8ml4)灌注浓缩胶在加完TEMED后，迅速在已经聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶至溢出，并立即插入梳子，避免产生气泡。
凝胶静置30min。
浓缩胶聚合凝固，小心拔出梳子，立即用ddH2O洗涤加样槽，以去除未聚合的丙烯酰胺。
3.加样1)蛋白样品变性在浓缩胶聚合的同时，将蛋白抽提液和加样缓冲液在沸水中加热5分钟，使蛋白变性。
2)灌注电泳缓冲液电泳槽中加满电泳缓冲液（ph8.3的Tris-Gly）。
3)蛋白加样用移液枪加样槽中加入样品和分子量蛋白标准品（Markers）。
所有加样槽均加样，空白孔用加样缓冲液代替，第一个孔加Markers5μl，其余孔加样品30μl。
(整理)WesternBlot试剂的准备.
Western Blot试剂的准备1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr） 29.0g亚甲双丙烯酰胺（Bis） 1.0g混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。
2. 4×分离胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl PH 8.8）Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。
3. 4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl PH 6. 8） Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。
4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。
5. 5×电泳缓冲液（PH 8.3）：Tris 15.2g甘氨酸 94gddH2O 定容到1000mlSDS 5g 先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。
6. 10%过硫酸铵（AP）：0.1g AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。
7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2ml10%SDS 4 mlβ-巯基乙醇1ml甘油 2ml1%溴芬蓝1ml置4℃避光保存8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：即1×SDS-PAGE10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ：NaCl 8.5g(12H2O)Na2HPO4 2.9011g(2H2O)NH2PO4 0.24g加ddH2O定容至 1000ml11. 封闭液: 1×PBS中加入 30ml5%（V/V）脱脂奶粉 1.5g0.02%叠氮钠 0.006g0.05%Tween-20 0.015g12. 漂洗液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS溶液每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-2013. 水饱和正丁醇：正丁醇 50 mlddH2O 5 ml 加入瓶中震荡，使结合，存于室温。
western-blot 通用配方
1.Western Blotting 相关溶液及抗体1)转膜缓冲液（running buffer）(10×)(1L)Tris 30.3g甘氨酸144g不调pH转膜工作液（1×)(1L)（现配现用）(10×)转膜缓冲液（running buffer）100ml无水乙醇100ml水800ml2)TBS 缓冲液(5×)（1L）Tris-HCl 12.15gNaCl 146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4（约5ml浓盐酸，pH试纸检测即可）TBST：TBS+Tween-20 0.1%（1ml for 1L）3) 封闭液TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine)4）Western Blotting 第一抗体适合于自己蛋白的抗体5）Western Blotting 第二抗体辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤（1）SDS-PAGE 电泳分离蛋白质：(浓缩胶70V，30-40min；分离胶120V，1h)5×loading buffer: 4mlddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml甘油1ml 10%（w/v）SDS 0.8mlß-巯基乙醇0.2ml（2）将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形（3）配（1×)转膜工作液(10×)转膜缓冲液（running buffer）80ml无水乙醇80ml水640ml800ml（4）将胶泡在（1×)转膜工作液中（防止胶干掉，最好不要用水，水泡胶会涨）（5）用尺子量胶大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到（1×)转膜工作液中。
（PDVF膜为疏水性的，先在乙醇中泡会使其亲水性好）（7）将海绵和滤纸在水中浸湿，然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干)：白板—海绵—两层滤纸--PDVF膜（靠正极）--胶（靠负极）（用小试管排气泡）--两层滤纸—海绵（用小试管排气泡）--夹住—放入胶槽中（白板靠红，黑板靠黑，保证电极方向不要错）--在胶槽中加入转子—倒入（1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V～100V 恒压，60min(该条件可以转移25kD～90kD的蛋白)(8)封闭：在封闭液中室温，摇1h或者4℃静置过夜。
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WB所需溶液的配制
1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）
必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置
电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
4Tris.HCl的配置
注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置
称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置
加HCl调pH到7.6，室温储存。
7TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置
8 上样缓冲液（loading buffer）的配置
SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
9 stacking gel buffer (4×)
10 5×Sample buffer (10ml)
11 封闭液的配置 Blocking solution 要用TBST 配制牛奶
5% (w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA
0.01% antifoam A (Sigma)
0.01%(v/v) sodium azide
12 丽春红溶液：
100微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。
1）4%多聚甲醛（PFA ）的配制 （1000毫升）
40克多聚甲醛，加入800毫升水，60度搅拌溶解，加入300微升氢氧化钠，全部溶解后冷却到4度，再加入100毫升的10×PBS ，加水定容到1000毫升。
调pH 到7.2-7.4。
通风橱过滤，4度保存。
13 组织裂解液
步骤：
首先加10-20毫升的水溶解EDTA,再加入0.2%NaOH 使溶解，再调pH 至 7.4；然后分别加入其他成分，溶解一个再加另外一个；去氧胆酸钠开盖后会飞出，应戴口罩。
14. PBS 的配制（1000毫升） （PH 7.2~7.4）
七年级上册英语语法 1．动词be
（is,am,are
）的用法
我(I)用am, 你(you)用are，is跟着他(he)，她(she)，它(it)。
单数名词用is，复数名词全用are。
变否定，更容易，be后not加上去。
变疑问，往前提，句末问号莫丢弃。
还有一条须注意，句首大写莫忘记。
2．this，that和it用法
(1)this和that是指示代词，it是人称代词。
(2)距离说话人近的人或物用this, 距离说话人远的人或物用that。
如：
This is a flower. 这是一朵花。
(近处)
That is a tree. 那是一棵树。
(远处)
(3)放在一起的两样东西，先说this, 后说that。
如：
This is a pen. That is a pencil. 这是一支钢笔。
那是一支铅笔。
(4)向别人介绍某人时说This is…, 不说That is…。
如：
This is Helen. Helen, this is Tom. 这是海伦，海伦，这是汤姆。
(5)This is 不能缩写, 而That is可以缩写。
如：
This is a bike. That’s a car. 这是一辆自行车。
那是一辆轿车。
(6)打电话时，介绍自己用this, 询问对方用that。
如：
—Hello! Is that Miss Green? 喂，是格林小姐吗？
—Yes, this is. Who’s that? 是的，我是，你是谁？
注意：虽然汉语中使用“我”和“你”，但英语中打电话时绝不可以说：I am…, Are you…？/Who are you?
(7)在回答this或that作主语的疑问句时, 要用it代替this或that。
如：
①—Is this a notebook? 这是笔记本吗？
—Yes, it is. 是的，它是。
②—What’s that? 那是什么？
—It’s a kite. 是只风筝。
3．these和those用法
this, that, these和those是指示代词，these是this的复数形式,指时间,距离较近的或下面要提到的人或事;those是that的复数形式,指时间、距离较远或前面已经提到过的人或事物。
①This is my bed. That is Lily’s bed. 这是我的床。
那是莉莉的床。
②These pictures are good. 那些画很好。
③Are those apple trees? 那些是苹果树吗？
在回答主语是these或those的疑问句时，通常用they代替these或those以避免重复。
如：。