荧光光谱
荧光光谱分析
百泰派克生物科技
荧光光谱分析
荧光光谱法（又称荧光分析法或分光荧光测定）是一种电磁光谱法，可以测量样品吸收光子后发出的光子强度。
实际上，大多数荧光分子是芳香族的，如蛋白质/肽中的色氨酸。
光学技术，如UV-Vis、圆二色谱（CD）、傅立叶变换红外（FTIR）和荧光光谱，都被用于获取被测化合物的结构、相互作用和动力学信息。
荧光光谱是研究溶液状态和显微镜下蛋白质/肽的实时结构和动力学的重要研究工具。
荧光光谱分析。
生物制药，特别是蛋白质和多肽类药物，在整个研发过程中都面临着独特的挑战。
在成功批准和上市之前，需要对治疗性蛋白质/肽的生物物理、生化特性和3D结构有透彻的了解，因为产品的活性、稳定性、毒性、功效和保质期会因结构-活性关系而受到影响。
与小分子不同，这些大分子需要多种分析方法结合进行分析。
荧光光谱法可应用于：1，通过改变荧光强度来探测结构变化或两个分子的结合；2，通过色氨酸荧光的波长定位色氨酸残基（在蛋白质表面或深埋在蛋白质内部）；3，通过荧光偏振和各向异性研究荧光团迁移率。
荧光发光光谱
荧光发光光谱荧光光谱（也称为荧光测定法或荧光分光光度计）是一种分析样品荧光的电磁光谱学。
它涉及使用一束光，通常是紫外线，激发某些化合物分子中的电子并使它们发光；通常但不一定是可见光。
一种补充技术是吸收光谱。
在单分子荧光光谱的特殊情况下，发射光的强度波动是从单个荧光团或荧光团对测量的。
测量荧光的设备称为荧光计。
分子具有称为能级的各种状态。
荧光光谱主要关注电子和振动状态。
通常，被检查的物质具有感兴趣的基电子态（低能态）和较高能的激发电子态。
在这些电子状态中的每一个中，都有各种振动状态。
在荧光中，物质首先通过吸收光子从其基态电子状态激发到处于激发电子状态的各种振动状态之一。
与其他分子的碰撞导致激发分子失去振动能量，直到它从激发电子态达到最低振动状态。
然后分子再次下降到基电子态的各种振动水平之一，在此过程中发射光子。
由于分子可能会下降到基态的几个振动能级中的任何一个，因此发射的光子将具有不同的能量，从而具有不同的频率。
因此，通过分析荧光光谱中发出的不同频率的光，以及它们的相对强度，可以确定不同振动能级的结构。
对于原子种类，过程是相似的；然而，由于原子种类没有振动能级，因此发射的光子通常与入射辐射处于相同的波长。
这种重新发射吸收的光子的过程是共振荧光，虽然它是原子荧光的特征，但也可以在分子荧光中看到。
在典型的荧光（发射）测量中，激发波长是固定的，而检测波长是变化的，而在荧光激发测量中，检测波长是固定的，而激发波长在感兴趣的区域中是变化的。
发射图是通过记录一系列激发波长产生的发射光谱并将它们组合在一起来测量的。
这是一个三维表面数据集：作为激发和发射波长函数的发射强度，通常描绘为等高线图。
荧光光谱的原理与应用
荧光光谱的原理与应用一、简介荧光光谱是一种非常重要的光谱技术，用于研究物质的光谱特性。
和吸收光谱相比，荧光光谱具有很多优点，包括高灵敏度、高选择性和动态特性等。
本文将介绍荧光光谱的原理和应用。
二、荧光光谱的基本原理荧光光谱是物质在受激发后发射荧光的光谱。
荧光的产生涉及两个过程：激发和发射。
具体来说，当物质受到足够能量的激发后，其内部的电子会升级到激发态，并在短时间内返回到基态，释放出荧光。
这个过程伴随着光的吸收和发射。
荧光光谱图通常由激发光和发射光组成。
激发光是用于激发物质的光，而发射光是物质在激发后发射的荧光。
通过测量激发光和发射光的强度和波长，可以得到荧光光谱。
三、荧光光谱的应用1. 荧光光谱在生物学中的应用荧光光谱在生物学中有广泛的应用。
例如，它可以用来研究生物分子的结构和函数。
荧光标记是研究生物分子的常用方法之一，该方法利用荧光染料或荧光蛋白标记生物分子，通过测量荧光光谱来研究它们的相互作用、分子结构以及代谢路径等。
2. 荧光光谱在材料科学中的应用荧光光谱在材料科学中也有很多应用。
例如，它可以用于研究材料的光电特性。
通过测量材料激发和发射的荧光光谱，可以了解材料的能带结构、载流子动力学等信息，对材料的性能进行评估和优化。
3. 荧光光谱在环境监测中的应用荧光光谱在环境监测中也起到重要作用。
例如，它可以用于水质监测。
通过测量水样中的荧光光谱，可以判断水质的污染程度和有机物的种类。
同时，荧光光谱还可以用于检测空气中的有害气体，如VOCs、NOx等。
4. 荧光光谱在食品安全中的应用荧光光谱在食品安全领域也有广泛应用。
例如，它可以用于检测食品中的有害物质和污染物。
通过测量食品样品的荧光光谱，可以判断食品是否受到了污染，确保食品的安全性。
5. 荧光光谱在医学诊断中的应用荧光光谱在医学诊断中也有很多应用。
例如，它可以用于癌症的早期诊断。
通过测量病变组织或体液中的荧光光谱，可以鉴别正常组织和癌变组织之间的差异，帮助早期发现癌症。
荧光光谱的原理和应用
荧光光谱的原理和应用1. 荧光光谱的基本概念•荧光：荧光是指物质受到激发后，在短时间内吸收能量并发出较长波长的光。
•荧光光谱：荧光光谱是指在特定激发光源照射下，物质发出的荧光光在不同波长下的强度分布。
•荧光发射：当物质受到激发并返回基态时，通过辐射发出光的过程称为荧光发射。
2. 荧光光谱的原理2.1 荧光激发和发射•荧光激发：物质受到外界能量的激发，电子从基态上升到激发态。
•荧光发射：激发态电子回到基态的过程中，通过辐射发出光。
2.2 荧光激发与发射能级•电子能级：物质中的电子具有不同能量的电子能级。
•激发态：电子从基态跃迁到更高能级的状态称为激发态。
•发射态：电子从激发态回到基态的状态称为发射态。
2.3 荧光与分子结构•分子结构：不同分子结构对荧光发射的波长和强度有影响。
•良好的激发能量传递：分子结构中共轭体系的存在有助于良好的激发能量传递。
3. 荧光光谱的应用3.1 荧光光谱分析•分析特性：荧光光谱可以提供物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
•应用领域：荧光光谱分析广泛应用于环境监测、生物医学、食品安全等领域。
3.2 荧光探针和标记物•荧光探针：利用荧光探针可以对生物分子进行检测和定量分析。
•标记物应用：荧光标记物在生物学领域中的应用非常广泛，例如细胞成像、蛋白质定位研究等。
3.3 荧光荧光显微镜•荧光显微镜：利用荧光显微镜可以观察和研究生物样本中的荧光信号，无需对样本进行染色处理。
•应用领域：荧光显微镜被广泛应用于生物学、医学和材料科学领域。
3.4 荧光染料•荧光染料：具有良好荧光性能的化合物，可以用于荧光显微镜观察、荧光分析和药物研究等方面。
•应用领域：荧光染料广泛应用于细胞成像、分子探针、生物传感器等领域。
4. 总结荧光光谱是一种重要的光谱学技术，在科学研究和应用中具有广泛的应用前景。
通过荧光光谱可以获得物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
荧光光谱在环境监测、生物医学、食品安全等领域发挥着重要作用。
荧光光谱
OH H2C O HO O H2C OH HO OH O HO C H2 O OH OH OH O HO O HO CH2 O HO O CH2 HO OH O O OH HO O HO O HO H2C OH
OH
O
CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2
HO
OCH2CH2(OCH2CH2)n OH
β－CD∶OP 加合物的组成
用摩尔比法测定了βCD∶OP 二元体系的组 成. 由图4 可以看出, β - CD 与OP 的摩尔比为1∶1 , 说明在溶液中形成了 1∶1 的二元加合物,
加合物形成的机理及其结构
OP 疏水性烷基链的长 度、径度和体积分别为 1.036 nm、0.400 nm和 0.216 nm3 。 β- CD 空腔的深度 (0.780 nm) 、空腔口直 径(0.780 nm) 和体积 (0.346nm3 ) 相比, OP 的 疏水性烷基链中至多有 6 个碳被包络在空腔内, 其余未被包络部分和极 性头基位于空腔外
H2C
H2C
CH3 N
NpMA
PyMA
DMAA AMPS NpMA PyMA
AIBN DMF
乙醚
乙醇多次洗涤干燥
萘和芘标记聚电解质在水溶液中的紫外光谱和荧光光谱
在水溶液中的紫外吸收 光谱与小分子萘和芘的 光谱基本相同, 说明萘 和芘标记到聚电解质上 并没有对它们的光谱结 构产生明显影响, 而且 混合溶液表现出两者光 谱的迭加. 290 nm 处萘有一吸收带, 而芘的吸收很弱, 所以 在混合溶液中可用290 nm 激发萘; 343 nm 处仅 有芘的吸收, 因此可用 343 nm 选择性地激发芘.
330 nm 为中心的发射带 是萘的荧光, 360～ 440 nm 是单体态芘的发射光 谱, 480 nm 是芘激基缔 合物的发射光谱.
荧光光谱
0.46
0.60
λexmax(nm) 205 286
365
390
λ max em
(nm)
278
321
400
480
3. 刚性平面结构 荧光物质的刚性和平面
性增加，有利于荧光发射。
芴
F=1
戊省 0.52 580 640
联苯
F=0.2
-O
O
O
荧光黄
C
COO产生荧光
F=0.92
-O
O
酚酞
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱC COO不产生荧光
到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。
C. 激发光谱与发射 IF4800 固定em=620nm(MAX) 固定ex=290nm (MAX)
光谱的镜像关系
4400 4000
1→ 4
1→1
4 3
3600
S1
3200
1→ 3
1→2
2 1
2800
1→ 2
2400
1→4
2000
1600
1200 800
1→4
400
1→1
0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
4 3 2 1
S0 ex =290nm (MAX)
em= 620nm(MAX)
D.磷光光谱
与发射光谱相同条件下的磷光光谱
IF4800
4400 4000
488
τ p(s)
2.6
2.5
1.4
0.23 0.014 0.0023
含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。
荧光光谱名词解释
荧光光谱名词解释
以下是几个与荧光光谱相关的常见名词的解释：
1. 荧光：荧光是指物质吸收光能后，在经历激发态到基态跃迁过程中发出的光辐射。
这种光辐射通常具有较长的波长，可见光范围内的颜色。
2. 激发：激发是指将物质从基态转移到激发态，使其能级上升，通常是通过吸收光能或其他能量来实现。
激发是产生荧光的前提条件。
3. 激发光源：激发光源是用于激发荧光的光源。
常见的激发光源包括紫外线灯、激光器和白炽灯等。
激发光源的选择通常取决于所研究的物质的特性和所需的激发波长。
4. 荧光发射：荧光发射是指物质在激发后返回基态时所发出的光辐射。
荧光发射的波长范围通常比激发光波长长，且具有特定的荧光峰。
5. 荧光光谱：荧光光谱是通过测量荧光发射强度随波长的变化而得到的图谱。
荧光光谱可以提供有关物质荧光性质的信
息，如发射波长、发射强度和荧光峰的位置等。
6. 荧光光谱峰：荧光光谱峰指荧光发射谱中最强的发射峰。
荧光光谱峰的位置和强度可以提供关于物质结构和荧光特性的重要信息。
7. 荧光量子产率：荧光量子产率是指物质发生荧光的效率，即荧光发射光子数与吸收光子数之比。
荧光量子产率越高，表示物质更有效地发出荧光。
以上是一些与荧光光谱相关的名词解释。
荧光光谱是研究物质荧光性质和特征的重要工具，广泛应用于生物化学、材料科学、分析化学等领域。
荧光光谱缩写
荧光光谱缩写荧光光谱缩写（FluorescenceSpectroscopy）是一种研究物质结构和活性的常用技术，它可以获得物质中离子、激发态、和荧光能带等高分辨率的光谱信息，常用于鉴定、分析和研究物质结构和活性。
荧光光谱是基于物质本身能够吸收光谱，然后发射出对应频率长度的光谱，来测量物质结构和活性。
它是一种无损测量技术，可以在原位测量，无需样品的剥离，能够获得物质结构和活性的高精度数据。
荧光光谱研究的结果包括吸收光谱、激发态、和荧光能带等信息。
吸收光谱是根据物质的结构，在不同的频率长度入射的光，物质会有不同程度的吸收，研究其吸收率变化可以了解物质的结构。
激发态是物质中激发态电子在不同跃迁时发出的能量，研究其激发态，可以获得更多关于物质结构的信息。
荧光能带是激发态电子跃迁到其它能态时，所释放的能量的波长范围，研究荧光能带可以了解物质中活性的程度和结构变化。
荧光光谱研究广泛用于地球科学、材料科学、生物科学、分析化学等领域，也经常被应用在大气物质、生物样品和地质样品等实际工程中。
其优势是在不同温度，物质中吸收光谱、激发态、和荧光能带的变化可以被准确测量，可以帮助科学家研究物质的动态性质和结构变化，能够获取有关物质结构的定量数据。
荧光光谱的研究有很多种技术，包括单量子荧光（Single-Photon Fluorescence）、多量子荧光（Multiphoton Fluorescence）、多光子共振荧光（Multiphoton Resonance Fluorescence）、共振能量转移荧光（Resonance Energy Transfer Fluorescence）等，被广泛应用在各种研究领域，用来检测并了解物质的结构和活性。
荧光光谱研究结合了物理和化学，是一种重要的物质研究手段，它可以提供近似于分析化学实验的结果，不仅可用于鉴定、分析和研究物质结构和活性，还可以用于其它科学研究中，比如药物研究、水处理、空气治理等。
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2. 内转换: 是指两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，
常发生电子由高能级转移至低能级的无辐射跃迂过程。 3. 系间跨越: 不同多重态间的无辐射跃迁，同时伴随着受激电子 自旋状态的改变，如S1→T1。 4. 外转换：激发分子通过与溶剂或其他溶质分子间的相互作用使
非辐射去激——不伴随发光现象的过程叫非辐射去激，体系内的多余的 能量以热的形式释放。
36
2.3 原理
1. 振动弛豫: 它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转移 至低振动能级的无辐射跃迁过程。
37
振动驰豫
S2
S1 T1
S0 λ1 吸 光 λ2 吸 光
S0
38
2.3 原理
1. 振动弛豫: 它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转移
8
1.2 特点
优点： （1）有较低的检出限，灵敏度高。特别对Cd、Zn等元素有相当低的检 出限，Cd可达0.001ng·cm-3、Zn为0.04ng·cm-3。现已有2O多种元素 低于原子吸收光谱法的检出限。由于原子荧光的辐射强度与激发光源 成比例，采用新的高强度光源可进一步降低其检出限。
45
振动驰豫
S2 内转换
S1
系 间 跨 跃
T1
外转换
S0 λ1 吸 光 λ2 吸 光 λ3 荧 光
S0
46
2.3 原理
2.3.3 辐射方式 磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。由 于磷光的产生伴随自旋多重态的改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿 命为10-4 ~10s
c.阶跃线荧光
15
1.4 类型
3．anti -Stokes荧光 当自由原子跃迁至某一能级，其获得的 能量一部分是由光源激发能供给，另一部 分是热能供给，然后返回低能级所发射的 荧光为 anti-Stokes 荧光。其荧光能大于激 发能，荧光波长小于激发线波长。例如铟 吸收热能后处于一较低的亚稳能级，再吸 收 410.13nm的光后，发射 410.18nm的荧光， 见图(d). d.anti -Stokes荧光
激发光源停止后，荧光立即消失。 原子荧光的波长范围为紫外及可见区。分子荧光的波长范围处于紫外 及可见区，部分在远紫外区。
5
1. 基 本 知 识
荧光光谱类型：
1.原子荧光光谱法 2.分子荧光光谱法
6
1. 原子荧光光谱法 （AFS）
7
1.1 概述
原子荧光光谱分析法（ AFS ）是通过 测定待测原子蒸气在辐射激发下发射 的荧光强度来进行定量分析的方法。 原子荧光光谱法是 1964年以后发展起 来的分析方法，近年来发展较快。 从原理来看该方法属于原子发射光谱 范畴，但所用仪器与原子吸收光谱法 相近。
a.共振荧光
12
1.4 类型
（2）非共振荧光 当产生的荧光与激发光的波长不相同时，产生非共振荧 光，即跃迁前后的能级发生了变化。非共振荧光又分为直跃 线荧光、阶跃线荧光、anti-Stokes（反斯托克斯）荧光。
如果荧光线激发能大于荧光能，即荧光线的波长大于激 发线的波长称为Stokes荧光；反之，称为anti－Stokes荧光。
If = φ · I a
22
1.5 原子荧光参数
3.待测原子浓度与荧光的强度： 在理想状况下：
原子荧光定量 的依据
If = φ ·A·I0·K0·l·N= K·c
I0 A K0 l N c
为原子化火焰单位面积接受到的光源强度； 为受光照射在检测器中观察到的有效面积； 为峰值吸收系数； 为吸收光程； 为单位面积内待测元素的基态原子数； 为试样中待测元素的浓度
27
28
2. 分子荧光光谱法 （MFS）
29
2.1 概述
分子荧光法：根据物质分子荧 光光谱进行定性，以荧光强度进 行定量的一种分析方法。
30
2.2 特点
优点： 1. 灵敏度高 荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧 光强度）通常比紫外－可见分光光度法检出限低 2～4个数量级检出限 可达0.1-0.001ug·cm-1。 2. 选择性好 不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长 不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长 比较容易排除其它物质的干扰，选择性好
23
1.6 原子荧光光谱仪
原子荧光光谱仪与原子吸收仪相似，包括激发光源，原子化器，单 色器，检测器及信号处理显示系统。但光源与其他部件不在一条直 线上，而是900 直角，避免激发光源发射的辐射对原子荧光检测信号 的影响。 光源： 高强度空心阴极灯，激光，无极放电灯，氙弧灯 原子化器： 与原子吸收法相同 色散系统 ： 色散型 光栅 非色散型 滤光器 检测系统： 光电倍增菅
16
1.4 类型
（3）敏化荧光
受光激发的原子与另一种原子碰撞时，把激发能传递 给另一个原子使其激发，后者再以辐射形式去激发而发射 荧光即为敏化荧光。
在以上各种类型的原子荧光中，共振荧光强度最大，最 为常用。
17
1.4 类型
表1.不同荧光类型实例
18
1.5 原子荧光参数
在产生荧光的过程，同时也存在着非辐射去激发的现象。 1.荧光猝灭：当受激发原子与其他原子碰撞，能量以热或其他 非荧光发射方式给出后回到基态，产生非荧光去激发过程，使 荧光减弱或完全不发生的现象。
基态分子
光照激发
价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基 态
在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（ 、n电子） 处于不同的自旋状态，通常用电子自旋状态的多重性来描述
33
2.3 原理
2.3.2 电子自旋状态的多重性 大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方 向总是相反的 ，处于基态单重态。用 “S0” 表示 ；当物 质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符 合光谱选律的。 第一激发单重态 S1
荧光光谱法 （FL）
环境科学：李蔷 2015.11.30
主要内容
1.基本知识 2.原子荧光光谱法
3.分子荧光光谱法
2
1. 基 本 知 识
荧光：荧光是物质吸收电磁辐射后受到激发，受激发的原子或分子在去激
发过程中再发射波长与激发辐射波长相同或不同的辐射。当激发光源停止
辐照试样以后，再发射过程立刻停止，这种再发射的光称为荧光。发射的
第一激发三重态 T1 基态单重态 S0
自旋平行
T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态 三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为10-4~1S
35
2.3 原理
2.3.3 辐射方式 分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去 激返回到较低激发态或基态时有两种方式：非辐射去激和辐射去激。
能量转换，而使荧光或磷光强度减弱或消失的过程。这一现象又
称为“熄灭”或“淬灭”。
43
振动驰豫
S2 内转换
S1
系 间 跨 跃
T1
外转换
S0 λ1 吸 光 λ2 吸 光
S0
44
2.3 原理
2.3.3 辐射方式 辐射去激
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能 级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。由于是 相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数 kf为106~109s-1。
直跃线荧光为Stokes荧光。
b.直跃线荧光
14
1.4 类型
2. 阶跃线荧光 正常阶跃荧光为被光照激发的原子，以非辐射 形式去激发返回到较低能级，再以辐射形式返回基 态而发射的荧光。很显然，荧光波长大于激发线波 长。例钠原子吸收330.30nm光，发射出588.99nm的 荧光 。 非辐射形式为在原子化器中原子与其他粒子 碰撞的去激发过程。 热助阶跃线荧光为被光照激发的原子，跃迁至 中间能级，又发生热激发至高能级，然后返回至低 能级发射的荧光。例如铬原子被359.35nm的光激发 后，会产生很强的357.8 7nm荧光。阶跃线荧光的产 生见图（c）。
至低振动能级的无辐射跃迁过程。
2. 内转换: 是指两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，
常发生电子由高能级转移至低能级的无辐射跃迂过程。
39
振动驰豫
S2 内转换
S1 T1
S0 λ1 吸 光 λ2 吸 光
S0
40
2.3 原理
1. 振动弛豫: 它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转移 至低振动能级的无辐射跃迁过程。
13
1.4 类型
1. 直跃线荧光
激发态原子跃迁至高于基态的亚稳态 时所发射的荧光称为直跃线荧光，见图 (b). 如铅原子吸收 283．31nm的光，而 发射 405．78nm的荧光。它是激发线和荧 光线具有相同的高能级，而低能级不同。 由于荧光的能级间隔小于激发线的能线间 隔，所以荧光的波长大于激发线的波长。
2. 内转换: 是指两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，
常发生电子由高能级转移至低能级的无辐射跃迂过程。 3. 系间跨越: 不同多重态间的无辐射跃迁，同时伴随着受激电子 自旋状态的改变，如S1→T1。
41
振动驰豫
S2 内转换
S1
系 间 跨 跃
T1
S0 λ1 吸 光 λ2 吸 光
S0
42
2.3 原理
31
2.2 特点
优点： 3. 实验方法简单 4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广