葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
葡聚糖层析实验报告
一、实验目的1. 掌握葡聚糖凝胶层析的原理及其在生物大分子分离中的应用。
2. 学习并掌握葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
3. 通过实验，验证葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
二、实验原理凝胶层析，又称分子排阻层析或凝胶过滤，是一种基于被分离物质分子量差异的层析分离技术。
该技术利用凝胶颗粒的多孔网状结构，通过分子量差异使不同组分在层析柱中以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
葡聚糖凝胶是一种由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的高分子化合物。
通过调节葡聚糖和交联剂的比例，可以控制凝胶颗粒的孔径大小。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随溶剂流动快速流出层析柱；而分子量小的物质可进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程慢，后流出层析柱。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 葡聚糖凝胶（Sephadex）- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白、鸡蛋清蛋白等）- 溶剂（如磷酸盐缓冲溶液）- 离心机- 层析柱- 漏斗- 吸管2. 实验仪器：- 电子天平- 移液器- 显微镜四、实验步骤1. 准备层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱中，用溶剂冲洗，直至凝胶床均匀。
2. 加载样品：将标准蛋白质溶液加入层析柱中，使其在凝胶床表面形成一薄层。
3. 洗脱：用溶剂缓慢冲洗层析柱，收集不同时间流出的洗脱液。
4. 分析洗脱液：将收集到的洗脱液进行比色分析或电泳分析，确定各组分的位置。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 洗脱液在比色分析或电泳分析中，可观察到不同分子量的蛋白质分别在凝胶层析柱中的位置。
- 小分子量的蛋白质先流出层析柱，大分子量的蛋白质后流出。
2. 结果分析：- 通过实验，验证了葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
- 实验结果表明，小分子量的蛋白质在凝胶层析柱中的流动速度较快，大分子量的蛋白质流动速度较慢。
六、实验结论1. 葡聚糖凝胶层析是一种基于分子量差异的层析分离技术，在生物大分子分离中具有广泛的应用。
实训 凝胶柱色谱纯化蛋白质类药物
实训凝胶柱色谱纯化蛋白质类药物［任务描述］凝胶色谱是把样品加到充满着凝胶颗粒的色谱柱中，然后用缓冲液洗脱。
凝胶过滤柱色谱的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
本次实训任务采用葡聚糖凝胶G-75作固相载体，可分离分子量范围在2000～70000之间的多肽与蛋白质，上样样品为牛血清蛋白和溶菌酶的混合溶液，当混合液流经色谱柱时，两种物质因Kav值不同而被分离。
［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
2.收集凝胶柱色谱分离蛋白质工作中必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。
3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。
（1）材料准备葡聚糖凝胶Sephadex G-75。
（2）试剂0.9% NaCl溶液（洗脱液）、牛血清白蛋白：Mw=67000、溶菌酶：Mw =14300。
（3）器具色谱柱、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测器、记录仪、量筒、烧杯、试管、吸管、玻璃棒等。
二、操作过程（一）操作流程如图1所示。
（二）操作步骤1.凝胶预处理将Sephadex G-75置烧杯中，加入洗脱液于室温溶胀2～3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2～3小时，在凝胶溶胀时避免剧烈搅拌，以防凝胶交联结构的破坏。
2.装柱选取色谱柱，将色谱柱固定在支架上，调整色谱柱与水平面垂直。
烧结板下端的死区用蒸馏水充满，然后关闭色谱柱的出口。
将凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积1～2cm时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶沉积约15cm高度即可（注意：凝胶悬液尽量一次加完，以免出现分层的凝胶带）。
3.平衡装柱完成后，接上恒流泵，以0.9%的氯化钠为流动相，以0.75mL/min或0.5mL/min的速度开始洗脱，用1～2倍床体积的洗脱液平衡，平衡1h，使柱床稳定。
葡聚糖凝胶分离原理
葡聚糖凝胶分离原理葡聚糖凝胶分离原理是指利用葡聚糖凝胶作为分离介质，根据分子的大小、形状以及电荷等性质进行分离的原理。
这是一种普遍应用于生物大分子分离、纯化的方法，也被广泛应用于各种生物学研究和生产中。
下面我们来分步骤阐述葡聚糖凝胶分离原理。
第一步：准备葡聚糖凝胶首先需要准备葡聚糖凝胶，也叫葡聚糖凝胶珠。
葡聚糖凝胶是一种由葡萄糖聚合而成的大分子化合物，具有空心珠状结构，内部的孔道大小可以通过调整反应条件来控制。
一般来说，制作葡聚糖凝胶是通过交联反应来实现的。
这个反应可以在空气中进行，也可以在水中进行。
反应结束之后，需要将凝胶珠洗涤干净并保存。
（此处省略反应式，不过可以考虑简单描述制作过程）第二步：根据分子大小选用不同的葡聚糖凝胶根据待分离分子的大小，可以选用孔径不一的葡聚糖凝胶珠进行分离。
一般来说，凝胶珠的孔径越大，可以分离的大分子也就越大。
因此，选用合适的葡聚糖凝胶对于分离大分子很关键。
第三步：将待分离混合物加入到葡聚糖凝胶柱中将待分离的混合物加入到葡聚糖凝胶柱中，通常是通过上一端加样，并在另一端接收洗脱液来实现。
当待分离混合物进入凝胶柱后，各种组分便可以进入到凝胶珠中。
此时，分子会因为凝胶珠孔道大小的排斥，或者是因为电荷、极性等原因而被分离开来。
第四步：使用洗脱液进行洗脱分离的分子在分子分离的过程中，分子部分会被“捕获”在葡聚糖凝胶中，而另外一部分则会穿过凝胶珠而漏出柱外。
因此，需要通过洗脱液来脱离已分离出的分子，将它们从凝胶珠中洗脱出来。
一般来说，选择适当的洗脱液并采用合适的洗脱方法，可以获得高纯度和高产率的分离产品。
以上就是葡聚糖凝胶分离原理的分步骤阐述。
葡聚糖凝胶分离原理被广泛地应用于各种生物学实验中，如生物大分子的分离纯化，蛋白质的组分分析等等。
通过掌握葡聚糖凝胶分离原理，我们可以更好地理解生物大分子之间的关系，优化生物大分子的纯化过程，提高生物制品的纯度和质量。
sephadexg-75凝胶层析法分离蛋白质
Sephadex G-75 凝胶层析法分离蛋白质一.实验原理凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。
这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
二.试剂器材Sephadex G-75粉末洗脱液(10mmol/L Tris，10mmol/L NaCl，：取Tris 1.2114g和NaCl5.844g分别溶于适量的蒸馏水中，将两种溶液合并，用4mol/L的盐酸溶液调节pH值至，再用蒸馏水定容至1000mL；其他器材：18mm试管、层析柱、紫外分光光度计、分部收集器等三.操作步骤凝胶的制备：称取Sephadex G-75粉末20g，加双蒸水400ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3hr，冷却至室温抽真空30min以排除气泡，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；装柱：取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的双蒸水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；平衡：凝胶床用洗脱液平衡过夜，约2个柱体积；加样：称取样品溶解于5mL的洗脱液中。
实验三葡聚糖凝胶柱层析
4000~1.5×105 4000~1×105 5000~3×105 5000~1.5×105 5000~6×105 5000~2.5×105
100~4 000
特别为使用有机溶剂而设计。适合分离脂类、胆固醇、脂肪酸、激素、 维生素及其他小生物分子。此分离范围指以酒精为溶剂的分离
凝胶过滤介 质名称
分离范围
分离 范围 <700 <1500 1000~5000 1000~5 000 1000~5000
颗粒 大小 （μm） 干粉40~120 干粉40~120 干粉100~300 干粉50~150
特性/应用
pH 稳定性 工作 2~13 2~13 2~13 2~13
干凝胶 溶胀体 积mL/g 2~3 2.5~3.5 4~6 4~6
3.5 试剂、器材：
3.1 层析介质 Sephadex G-50； 3.2 混合样品（由三个组分组成）（要过滤或离心）： 蓝葡聚糖2000－10mg/ml， 溶菌酶—40mg/ml, Trp—10mg/ml。 上样量：0.2ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐水（需抽滤） 3.4、层析系统：层析柱、恒流泵、部分收集器、 核酸蛋白检测仪、记录仪。
颗粒大 小μm
24~44 24~44 24~44 20~40 20~40 25~75 25~75 25~75
特性/应用
肽类、寡糖、小蛋白等 重组蛋白、细胞色素 单抗、大蛋白 蛋白、肽类、多糖、核酸 蛋白、肽类、寡糖、多糖 肽类、小蛋白 蛋白，如清蛋白 蛋白、抗体 多糖、具延伸结构的大分 子如蛋白多糖、脂质体 巨大分子 巨大分子如重组乙型肝炎表 面抗原 蛋白、大分子复合物、病毒、 不对称分子如核酸和多糖 （蛋白多糖） 蛋白、多糖 蛋白、多糖 蛋白、大分子复合物、病毒 、不对称分子如核酸和多糖 （蛋白多糖）
丙烯葡聚糖凝胶柱
丙烯葡聚糖凝胶柱丙烯葡聚糖凝胶柱（Acrylamide-grafted-dextran gel column）是一种用于生物大分子分离纯化的柱层析材料。
它的主要特点是基质材料采用了由Dextran和Acrylamide共聚物构成的凝胶，具有良好的化学稳定性、物理强度、较高的柱效以及优秀的卫生性等优点。
丙烯葡聚糖凝胶柱广泛应用于生物医学、制药、食品及环境领域等，是纯化比较复杂的生物大分子时的首选柱层析材料之一。
丙烯葡聚糖凝胶柱的制备的主要步骤包括：基质制备、柱层析填料、柱装填、洗脱条件的选择。
基质制备时，首先制备一定浓度的Dextran/丙烯酰胺共聚物水溶液，然后将其加入化学引发剂，并在反应后迅速凝胶化。
柱层析填料时，制备出适当大小的凝胶颗粒，并进行化学处理，使其能够在柱层析过程中稳定地固定在柱内。
柱装填时，将处理好的凝胶颗粒装入柱体中，并使其达到充填度。
洗脱条件的选择则需要根据大分子的特性选择不同的缓冲液、pH和盐度等，以最大限度地提高纯化效果。
1. 高柱效：丙烯葡聚糖凝胶柱具有良好的化学稳定性和物理强度，使其在高线速度下运行时也能保持良好的传质条件和柱效。
2. 容量大：由于基质凝胶中Acrylamide含量较高，其微孔结构也比较丰富，因此其容量比市面上其他吸附性柱层析材料大不少。
3. 极佳的卫生性：丙烯葡聚糖凝胶柱的基质对微生物生长、热辐射、紫外线等均有较好的抵抗力，能够在保证高生物质量的前提下有效防止杂质交叉污染。
4. 广泛应用：丙烯葡聚糖凝胶柱广泛应用于制药、食品、环境和生物领域，例如：分离免疫球蛋白、病毒蛋白、血凝素、酶、细胞因子、抗原和肽等。
丙烯葡聚糖凝胶柱在生物大分子的分离纯化中发挥着重要的作用。
在免疫学领域，丙烯葡聚糖凝胶柱可用于分离IgG和IgM。
在病毒学领域，丙烯葡聚糖凝胶柱可用于纯化HIV、疱疹病毒、流感病毒等。
在药物研发领域，丙烯葡聚糖凝胶柱则可用于纯化药物，如重组蛋白、激素等。
葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 8吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
葡聚糖凝胶柱层析
分离 范围
颗粒 大小 （μm）
<700 <1500 1000~5000
干粉40~120 干粉40~120 干粉100~300
1000~5 000
干粉50~150
1000~5000
干粉20~80
1000~5000
干粉10~40
1500~30000
干粉100~300
1500~30000
干粉50~150
1500~30000
pH 稳定性 工作
2~13 2~13 2~13
干凝胶 溶胀体
积mL/g
2~3 2.5~3.5 4~6
溶胀最少 平衡时间h
室温 沸水
3
1
3
1
6
2
最快 流速 (cm/h)
2~5 2~5 2~5
2~13 4~6
6
2
2~5
2~13 4~6
6
2
2~5
2~13 4~6
6
2
2~5
2~10 9~11
6
2
2~5
2~10 9~11
2、影响凝胶层析分离的因素：
2.1、样品的体积、粘度。 2.2、层析柱 ：（高度，内径，材质）。 2.3、洗脱液的流速：
过慢：扩散； 过快：拖尾。 2.4、洗脱液的离子强度、pH。
2.1、样品的体积、粘度：
分析分离时：Vsample=1-4%Vbed； 制备分离时：Vsample=25-30%Vbed. 分离体积(Vsep): 相邻两组分Ve之差，用于衡量相邻两组分的
同型号的胶，同样的床体积，粒度小的胶对样品的分离度要优 于粒度大的胶，即有较高的分辨率。
4.4、凝胶的防腐、保存：
Sephadex、Sepharose 是多糖类物质，易于长菌。因 此，常在凝胶不用时，加入抑菌剂，使用时再除去。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
凝胶层析的实际操作
4、上样 上样体积不大于6%柱床体积，上样浓度控制再35mg / ml~50 mg / ml， 以不大于12cm / h线性流速上样。
5、洗脱 用0.05mol / L NaCl-5mmol / L PB溶液，以不大于12cm / h线性流速洗脱
凝胶层析的操作注意事项
1、盐析过程盐溶液加少，盐析程度不够；盐溶液加多，盐 浓度过高有可能会导致蛋白变性； 2、蛋白的上样浓度不宜过高（70 mg / ml GE公司凝胶手册 数据 ），否则样品粘稠影响分离效果； 3、样品必须是均匀的溶液体系，没有颗粒，否则容易造成 柱子阻塞；
凝胶柱层析 分离纯化蛋白质
学习目的
了解：层析技术的基本原理;
有效分配系数Kav的计算。
理解：凝胶的选择和准备。 掌握：凝胶层析的原理和操作方法;
有效分配系数Kav的意义。
重点：
1、凝胶层析的原理和实际操作步骤。
2、分配系数与被分离分子量之间的关系。
蛋白质的分离纯化
蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间 特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。
凝胶层析的基本原理
凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析） 指混合物随流动相经过装有凝胶作为固 定相的层析柱时，各组分因分子大小不 同而被分离的技术。
凝胶：一些具有立体网状结构 和一定孔径的高分子化合物。
分子大于凝胶孔隙范围的物质： 随着溶剂在凝胶颗粒间流动
分子小于凝胶孔隙范围的物质： 渗入凝胶颗粒的孔隙中
型号：S-100,S-200,S-300,S-400等
Sephacryl的常见规格（分级范围）
预装柱
车间现有规格 1000~100000
凝胶层析的实际操作
1、样品准备 1.1、根据Phenyl下样合格样品的体积，加入3.5 mol / L (NH4)2SO4溶液， 使样品中(NH4)2SO4溶液浓度稀释到1.35~1.83mol / L。置于层析柜中10 min以上。4℃，6500 rpm离心30 min，收集沉淀。用pH 7.2士0.1的 5mol / L PB溶解沉淀，完全溶解后，4℃，6500 rpm离心15分钟，取上 清。
积Ve有关： Kav = （Ve — Vo）/（Vt — Vo）
Vt和Vo恒定，Ve随分离物分子量的变化而变化 ， 分离物分子量越大Kav值越小
葡聚糖凝胶柱层析法的特点
天然凝胶：一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。 人工合成凝胶：葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。
葡聚糖凝胶（Sephadex）：由许多右旋葡萄糖单位通过 1，6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂交联形成不溶 水的多孔网状高分子化合物。
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15
Sephadex的常见规格（分级范围）
X：① 交联度。X越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子 量产品。反之亦然。
② 吸水量。G-25表示：1g干胶吸水2.5mL，依次类推。
葡聚糖凝胶柱层析法的特点
聚丙烯酰胺葡聚糖（Sephacryl）：烯丙基葡聚糖和N,N亚甲双丙烯酰胺的交联共聚物
思考题
1. 为什么分离物分子量越大Kav值越 小？
2. 用凝胶柱层析分离不同蛋白质，怎 样才能得到较好的分离效果？
凝胶层析的过程
凝体积Vg 柱床体积Vt = Vg + Vo + Vi
内水体积Vi
洗脱体积（Ve）：自加入样品时算起，到组分最大浓度 出现时所流出的洗脱液体积。
凝胶层析的分配系数
* 分配系数Kav：表示任何一种被分离的化合物被
凝胶排阻的程度。
* Kav与凝胶柱的总体积Vt、外水体积Vo、洗脱体
2、前处理 2.1、0.5mol / L NaOH以22cm/h线性流速冲1.5%的柱床体积，再用注射 用水冲中性
3、平衡 3.1先用4L200 mmol / L PB以22cm/h线性流速平衡 3.2再用0.05mol / L NaCl-5mmol / L PB以22cm/h线性流速平衡层析柱， 不时检测出液端穿液电导和pH，如果与平衡液的电导和pH一致，表明 层析柱已经平衡好。