实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。
Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。
一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
根据分子大小分离蛋白质的方法
根据分子大小分离蛋白质的方法蛋白质是生命体中非常重要的分子，它们在细胞的结构和功能中起着关键作用。
为了研究蛋白质的特性和功能，科学家们经常需要对蛋白质进行分离和纯化。
分离蛋白质的一个重要方法是根据蛋白质的分子大小进行分离。
本文将介绍几种常用的根据分子大小分离蛋白质的方法。
一、凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的常用分离技术。
其原理是利用孔径大小不同的凝胶材料，将大分子蛋白质滞留在凝胶中，而小分子溶质可以顺利通过凝胶。
常用的凝胶材料有琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等。
根据需要选择不同的凝胶孔径，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术。
它利用电场作用将蛋白质分子按照大小进行分离。
在聚丙烯酰胺凝胶中，较大的蛋白质分子迁移速度较慢，而较小的蛋白质分子迁移速度较快。
通过调整电场强度和时间，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
三、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的变性凝胶电泳方法。
尿素是一种强变性剂，可以使蛋白质分子解离成单体，并且具有较好的可溶性。
在尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质分子的迁移速度主要取决于它们的电荷和分子大小。
通过调整电场强度和时间，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
四、尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱是一种利用固定相孔径大小进行分离的色谱技术。
在尺寸排阻色谱中，较大的蛋白质分子无法进入固定相孔径，因此会以较快的速度从色谱柱中洗脱，而较小的蛋白质分子则会在固定相中发生多次扩散，从而保留更长的时间。
通过调整固定相的孔径，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
五、离心过滤法离心过滤法是一种简便快速的蛋白质分离方法。
它利用离心力将大分子蛋白质沉淀在滤膜上，而小分子蛋白质则通过滤膜被洗脱出来。
通过选择不同孔径的滤膜，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
根据分子大小分离蛋白质的方法有凝胶过滤层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳、尺寸排阻色谱和离心过滤法等。
凝胶过滤层析实验报告
凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告引言：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，广泛应用于蛋白质纯化、分析和富集等领域。
本实验旨在通过凝胶过滤层析的方法，对混合蛋白样品进行分离和纯化，探究其原理和应用。
材料与方法：1. 凝胶过滤层析柱：选择合适的分子量截留范围，如10 kDa。
2. 混合蛋白样品：包含多种蛋白质，分子量范围从10 kDa到100 kDa。
3. 缓冲液：选择适当的缓冲液，如PBS。
4. 装载样品：将混合蛋白样品与缓冲液按比例混合，使其浓度适当。
实验步骤：1. 准备凝胶过滤层析柱：将柱子连接到系统中，并进行预洗，以去除残留物和杂质。
2. 样品装载：将装载样品注入凝胶过滤层析柱中，注意不要过载。
3. 层析过程：使用缓冲液进行层析，使样品在柱子中通过，并收集出流液。
4. 收集样品：根据需要，可以分别收集不同分子量范围的样品。
结果与讨论：通过凝胶过滤层析实验，我们成功分离并纯化了混合蛋白样品。
在层析过程中，不同分子量的蛋白质通过凝胶过滤层析柱时，会受到凝胶孔径的限制，从而分离出不同大小的蛋白质。
较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔径，会在柱中滞留，而较小分子量的蛋白质则能够通过凝胶孔径，从柱中流出。
通过收集不同分子量范围的样品，我们可以得到纯化后的蛋白质。
这些蛋白质可以进一步进行质谱分析、酶活性检测等实验，以获取更多关于蛋白质的信息。
凝胶过滤层析方法具有许多优点。
首先，它是一种快速、简单且高效的分离技术。
其次，凝胶过滤层析柱具有较高的容量和稳定性，可以处理大量样品。
此外，凝胶过滤层析适用于多种样品类型，包括细胞裂解液、培养基和体液等。
然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。
首先，凝胶孔径的选择需要根据样品的分子量范围来确定，如果样品中存在分子量相近的蛋白质，则可能无法完全分离。
其次，凝胶过滤层析无法去除溶液中的小分子物质，如盐离子和小分子有机物，这些物质可能对后续实验产生影响。
结论：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，通过分子量选择性分离和纯化蛋白质。
实验报告 蛋白质分子的测定
实验一蛋白质分子的测定─凝胶层析法一、实验原理凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。
将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，小分子可以进入凝胶内部，流苏缓慢，一直最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得以分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，其内部都具有很微细的多空网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（Sepharose），人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）和葡聚糖凝胶（Sephadex G）。
其中葡聚糖凝胶是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
Vt由V o，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+V o。
V o为“孔隙体积”、“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积；Vg为凝胶本身体积；Ve为洗脱体积，即自加入样品时算起到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积，Ve与V o及Vi之间的关系为：Ve=V o+K d Vi，；K d为样品组分在二相间的分配系数，Kd=(Ve-V o)/Vi，有效分配系数为Kav，Kav=(Ve-V o)/(Vt-V o)。
在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析的特点，与一般层析方法不同。
Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。
Ve与分子量的关系为：Ve=K1-K2logM，K1与K2为常数，M为分子量，通常用Kav代替V e，建立标准蛋白质分子式量LgM与Kav的标准曲线，称为“选择曲线”。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【实验器材】
层析柱 恒流泵 紫外检测仪 部分收集器 试管等普通玻璃器皿
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【实验试剂】
待分离样品 葡聚糖凝胶 Sephadex G-100 洗脱液：0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋 白质分子量大小进行分 离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。
单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的 程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
带网入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过凝滤胶层层析法分析离纯过化蛋程白质 示意图
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤凝胶层层析法析分离过纯化程蛋白质示意图
总结：
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。
sephadexg-75凝胶层析法分离蛋白质
Sephadex G-75 凝胶层析法分离蛋白质一.实验原理凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。
这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
二.试剂器材Sephadex G-75粉末洗脱液(10mmol/L Tris，10mmol/L NaCl，：取Tris 1.2114g和NaCl5.844g分别溶于适量的蒸馏水中，将两种溶液合并，用4mol/L的盐酸溶液调节pH值至，再用蒸馏水定容至1000mL；其他器材：18mm试管、层析柱、紫外分光光度计、分部收集器等三.操作步骤凝胶的制备：称取Sephadex G-75粉末20g，加双蒸水400ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3hr，冷却至室温抽真空30min以排除气泡，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；装柱：取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的双蒸水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；平衡：凝胶床用洗脱液平衡过夜，约2个柱体积；加样：称取样品溶解于5mL的洗脱液中。
生化实验报告凝胶过滤
一、实验目的1. 理解凝胶过滤的原理和操作步骤。
2. 掌握凝胶过滤在蛋白质分离纯化中的应用。
3. 通过实验验证凝胶过滤的分离效果。
二、实验原理凝胶过滤，又称分子筛层析，是一种基于分子大小差异的分离技术。
层析柱内填充带有小孔的凝胶颗粒，凝胶颗粒的孔径大小不同。
当含有不同大小蛋白质的混合溶液通过层析柱时，小分子蛋白质能够进入凝胶颗粒的孔隙中，从而在层析柱中停留时间较长；而大分子蛋白质则无法进入孔隙，在层析柱中的停留时间较短。
因此，不同大小的蛋白质得以分离。
三、实验材料1. 蛋白质混合样品（如血红蛋白、肌红蛋白等）2. 凝胶过滤柱（如Sephadex G-75）3. 缓冲液（如磷酸盐缓冲液）4. 离心机5. 分光光度计6. 移液器7. 玻璃棒8. 实验记录表格四、实验步骤1. 柱的制备：将凝胶过滤柱垂直放置，用缓冲液充分洗涤，去除凝胶颗粒表面的杂质。
2. 样品的制备：取一定量的蛋白质混合样品，用缓冲液稀释至适当的浓度。
3. 样品的加载：将样品缓慢加入层析柱的顶部，使其自然流下。
4. 洗脱：用缓冲液以恒定流速（如1 mL/min）洗脱层析柱，收集洗脱液。
5. 检测：使用分光光度计检测洗脱液中的蛋白质含量，记录不同洗脱峰的位置和峰面积。
6. 收集：根据蛋白质含量变化，收集不同洗脱峰的蛋白质溶液。
五、实验结果与分析1. 洗脱曲线：根据洗脱曲线，可以观察到不同大小的蛋白质在层析柱中的洗脱顺序。
通常，小分子蛋白质先被洗脱，而大分子蛋白质后被洗脱。
2. 蛋白质分离效果：通过比较不同洗脱峰的峰面积，可以评估凝胶过滤的分离效果。
峰面积越大，说明蛋白质含量越高，分离效果越好。
六、实验讨论1. 凝胶过滤是一种高效、简便的蛋白质分离纯化方法，广泛应用于生物化学和分子生物学领域。
2. 凝胶过滤的分离效果受到凝胶类型、柱径、流速等因素的影响。
在实际应用中，需要根据具体实验目的和样品特性选择合适的凝胶类型和操作条件。
3. 凝胶过滤可以与其他分离技术（如SDS-PAGE、电泳等）联合使用，进一步提高蛋白质的分离纯化效果。
凝胶层析法测定蛋白质分子量
凝胶层析法测定蛋白质的分子质量【实验原理】凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。
凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose）；人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶（商品名称为Sephadex）的各种交联凝胶，它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同M r的物质。
为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t(total volume)表示。
实际上V t是由V O，V t与V g三部分组成，：V t=V O+V t+V gV o称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；V g为凝胶本身的体积，因此V t-V o.等于V i+V g。
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6. 洗脱
当此少量蒸馏水接近流干时， ① 当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸 馏水，进行洗脱， 馏水，进行洗脱，直到两带分开 ② 检查 在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后， 检查Hb在层析床中色带位置 在层析床中色带位置， 洗脱完后， 洗脱完后 用试管分步收集洗脱液 ③ 10d/管，每管加 管 每管加NaOH 2d，CuSO4 2d ， 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（ ） ④ 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）
又名分子筛过滤体，不带电荷，吸附力弱， 属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条 件较温和，可在相当广的温度范围内进行， 件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要 有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。 有机溶剂， 交联葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶
（3）层析技术的优点
分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广
适用： 适用：
杂质多、含量少的复杂样品分析， 杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生 物样品的分离分析
3. 凝胶过滤层析法 （gel filtration chromatography） ） 原理： （1）原理：
根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗 根据分子大小的差别进行分离。 粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部， 粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部， 大分子物质被排阻在外。 大分子物质被排阻在外。
生物化学与分子生物学实验
带教: 张学礼、 带教 张学礼、戴薇薇 龚张斌、 龚张斌、黎志萍
实验课要求
试剂用后及时归位 及时记录实验结果 按时完成实验报告 离开时做好清洁工作
实验报告的书写
标题日期 一、实验目的 二、实验原理 三、操作步骤 四、实验结果 五、分析讨论
实验基本操作
一、玻璃仪器的洗涤 二、吸量管及微量取样器的使用 三、溶液的混匀 四、离心机的使用
三、实验操作
1. 柱的选择 直径： 直径： 1~5 cm 一般长度： 一般长度：直径 = 10：1 ~ 20：1 ： ： 本实验玻柱： 直径0.8~ 1.5cm 本实验玻柱： 直径 长度 17~ 20cm
2. 凝胶选择、制备 凝胶选择、 血红蛋白 溶菌酶 分离 （64500） （11400） ） ） 选择 Sephadex G-50 Sephadex G-50： ： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量 分子量)为 对多肽及蛋白质的筛分范围 分子量 为: 1500 – 30000
双缩脲反应） 缩二脲反应 （双缩脲反应）
O
O CuSO4 碱性 紫 红色
H2N - C - NH - C - NH2
肽键
四、实验结果
绘制洗脱结果示意图， 绘制洗脱结果示意图，并分析所得结果
五、讨论
下次实验： 下次实验：
《碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定》 碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定》 时间： 月 日上午 日上午9： 开始 时间：4月18日上午 ：00开始
例： Sephadex G-50： ：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量 为 对多肽及蛋白质的筛分范围 分子量)为: 分子量 1500 – 30000
Sephadex G-200： ：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量 为 对多肽及蛋白质的筛分范围 分子量)为: 分子量 5000 – 80000
B. 琼脂糖凝胶
制备： 制备：
将干胶颗粒悬浮于5 将干胶颗粒悬浮于 ~ 10倍的蒸馏水或洗脱液中 倍的蒸馏水或洗脱液中 充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去 充分溶胀，
3. 凝胶装柱
①柱固定于架子上，垂直放置，关住出口 柱固定于架子上，垂直放置， 开始下沉， ②自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉， 自顶部缓缓加入葡聚糖悬液， 至1 ~2cm时，打开出口 时 ③凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，关闭出口 凝胶逐层上升， 时
( 商品名: Sepharose , Bio- gel – A ) 商品名 温度, 对实验条件要求高 ( 温度 ＜40℃ ℃ pH ) 4.5- 9.0
工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限, 工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限 用于大分子物质的分离
C. 聚丙烯酰胺凝胶
商品名: 商品名 Bio – gel – P（生物胶 ） （生物胶P）
名称 原理 吸附层析法 固定相为固体吸附剂，利用各组分在吸附 固定相为固体吸附剂， 剂表面吸附能力不同而分离 分配层析法 各组分在流动相和固相中的分配系数不同 固定相是离子交换剂， 离子交换层 固定相是离子交换剂，各组分与离子交换 析法 剂亲和力不同而分离 亲和层析法 固定相只能与一种待分离组分专一结合， 固定相只能与一种待分离组分专一结合， 以此和无亲和力的其它组分分离 凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不 固定相是多孔凝胶， 同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同
按操作形式不同分类
名称 柱层析法 操作形式 固定相装于层析柱内， 固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方 向前移而达分离的层析法， 向前移而达分离的层析法，包括一般柱层 析法、 析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
平面层析法 层析过程在固定相构成的平面层内进行的 层析法，包括纸层析法、 层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄 膜层析法
注意点： 注意点：
垂直放置 防止气泡产生 防止柱的分层
4. 平衡
放置一段时间， 分钟（ 放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实） 分钟 使凝胶更好的压实）
注意： 注意：
防止床面干涸， 防止床面干涸，可适当补充蒸馏水
5. 加样
加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出， ① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露 出床面时，立即关闭出口（将干未干） 出床面时，立即关闭出口（将干未干） ② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 用滴管将混合样品 ， 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面 缓缓沿柱内壁小心加于床表面 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, ③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水 倍于样品体积的蒸馏水 立即加入
实验一 凝胶过滤层析法分离蛋白质
一、 实验目的
1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 掌握凝胶过滤层析法的基本原理 2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。 掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。 掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程
二、 实验原理
1. 常用生化实验技术
分光光度技术 电泳技术 离心技术 层析技术
固体物质 / 固定于固体物质的成分 可以流动的物质： 可以流动的物质： 如水和各种溶媒
待分离混合物（ 、 ） 待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相 由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（ 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比） 量对比）不同 与固定相相互作用力越弱的组分， 与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 越弱的组分 受到的阻滞作用小 移动速度快 受到的阻滞作用小，移动速度快
2. 层析技术（色谱技术） 层析技术（色谱技术）
是利用混合物中各组分的理化性质差异（ 是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附 力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲 溶解度、分子形状和大小、分子极性、 和力等）建立起来的技术。 和力等）建立起来的技术。
（1）层析系统的基本组成 ）
固定相 + 流动相
分步收集流出液， 分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一 组分，从而达到将各组分分离 分离的目的 组分，从而达到将各组分分离的目的
（2）层析法的分类 按两相所处状态分类
流动相 液体 液体 固定相 固体 液—液层析法 液层析法 液— 固层析法 气体 气—液层析法 液层析法 气— 固层析法
按层析原理分类
（3）凝胶的选择 多孔网孔结构 A. 葡聚糖凝胶 (商品名 Sephadex，Dextran) 商品名: 商品名 ， 型号: 型号: G-10 – G-200
吸水能力， 干胶吸水量的10倍 吸水能力，每g干胶吸水量的 倍 干胶吸水量的 数字愈小,交联度越大 被筛分物质的分子量也愈小 数字愈小 交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小 交联度越大