凝胶层析法分离纯化蛋白质
葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
凝胶层析的实际操作
4、上样 上样体积不大于6%柱床体积，上样浓度控制再35mg / ml~50 mg / ml， 以不大于12cm / h线性流速上样。
5、洗脱 用0.05mol / L NaCl-5mmol / L PB溶液，以不大于12cm / h线性流速洗脱
凝胶层析的操作注意事项
1、盐析过程盐溶液加少，盐析程度不够；盐溶液加多，盐 浓度过高有可能会导致蛋白变性； 2、蛋白的上样浓度不宜过高（70 mg / ml GE公司凝胶手册 数据 ），否则样品粘稠影响分离效果； 3、样品必须是均匀的溶液体系，没有颗粒，否则容易造成 柱子阻塞；
凝胶柱层析 分离纯化蛋白质
学习目的
了解：层析技术的基本原理;
有效分配系数Kav的计算。
理解：凝胶的选择和准备。 掌握：凝胶层析的原理和操作方法;
有效分配系数Kav的意义。
重点：
1、凝胶层析的原理和实际操作步骤。
2、分配系数与被分离分子量之间的关系。
蛋白质的分离纯化
蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间 特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。
凝胶层析的基本原理
凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析） 指混合物随流动相经过装有凝胶作为固 定相的层析柱时，各组分因分子大小不 同而被分离的技术。
凝胶：一些具有立体网状结构 和一定孔径的高分子化合物。
分子大于凝胶孔隙范围的物质： 随着溶剂在凝胶颗粒间流动
分子小于凝胶孔隙范围的物质： 渗入凝胶颗粒的孔隙中
型号：S-100,S-200,S-300,S-400等
Sephacryl的常见规格（分级范围）
预装柱
车间现有规格 1000~100000
凝胶层析的实际操作
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。
Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。
一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
根据分子大小分离蛋白质的方法
根据分子大小分离蛋白质的方法蛋白质是生命体中非常重要的分子，它们在细胞的结构和功能中起着关键作用。
为了研究蛋白质的特性和功能，科学家们经常需要对蛋白质进行分离和纯化。
分离蛋白质的一个重要方法是根据蛋白质的分子大小进行分离。
本文将介绍几种常用的根据分子大小分离蛋白质的方法。
一、凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的常用分离技术。
其原理是利用孔径大小不同的凝胶材料，将大分子蛋白质滞留在凝胶中，而小分子溶质可以顺利通过凝胶。
常用的凝胶材料有琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等。
根据需要选择不同的凝胶孔径，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术。
它利用电场作用将蛋白质分子按照大小进行分离。
在聚丙烯酰胺凝胶中，较大的蛋白质分子迁移速度较慢，而较小的蛋白质分子迁移速度较快。
通过调整电场强度和时间，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
三、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的变性凝胶电泳方法。
尿素是一种强变性剂，可以使蛋白质分子解离成单体，并且具有较好的可溶性。
在尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质分子的迁移速度主要取决于它们的电荷和分子大小。
通过调整电场强度和时间，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
四、尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱是一种利用固定相孔径大小进行分离的色谱技术。
在尺寸排阻色谱中，较大的蛋白质分子无法进入固定相孔径，因此会以较快的速度从色谱柱中洗脱，而较小的蛋白质分子则会在固定相中发生多次扩散，从而保留更长的时间。
通过调整固定相的孔径，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
五、离心过滤法离心过滤法是一种简便快速的蛋白质分离方法。
它利用离心力将大分子蛋白质沉淀在滤膜上，而小分子蛋白质则通过滤膜被洗脱出来。
通过选择不同孔径的滤膜，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
根据分子大小分离蛋白质的方法有凝胶过滤层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳、尺寸排阻色谱和离心过滤法等。
分离纯化蛋白质的方法
分离纯化蛋白质的方法蛋白质是生命体内最基本的分子，它们参与了生命体内的许多重要生物学过程，如代谢、信号转导、免疫防御等。
因此，对蛋白质的研究具有重要的科学意义。
但是，蛋白质在生物体内的含量很少，且与其他成分相混合，因此需要通过分离纯化的方法来获取纯净的蛋白质样品。
本文将介绍几种常用的分离纯化蛋白质的方法。
1. 溶液层析法溶液层析法是一种常用的蛋白质分离纯化方法。
它基于蛋白质在不同的化学性质和结构特征下在固定相中的不同亲和力，通过不同的溶液组成、pH值、离子强度等条件来分离纯化蛋白质。
溶液层析法的操作简单、效果好，可以分离出高纯度的蛋白质。
但是，它需要对分离材料的性质和蛋白质的性质有深入的了解，以便选择合适的分离条件。
此外，溶液层析法需要大量的分离材料和实验室设备，成本较高。
2. 凝胶层析法凝胶层析法是一种基于蛋白质分子大小、形状和电荷等性质的分离纯化方法。
它利用凝胶作为分离材料，通过分子筛效应、凝胶孔道大小和分子电荷等因素来分离不同大小和电荷的蛋白质。
凝胶层析法具有操作简单、分离效果好、成本低等优点。
但是，它需要长时间的分离过程，而且凝胶的孔径大小和材料的性质会影响分离效果。
此外，凝胶层析法只能分离相对较小的蛋白质，对大分子蛋白质的分离效果较差。
3. 电泳法电泳法是一种通过电场作用将不同电荷的蛋白质分离的方法。
它利用电泳移动速度与蛋白质质量和电荷密度之间的关系，将蛋白质分离纯化。
电泳法具有操作简单、分离效果好、成本低等优点。
但是，它需要专业的电泳设备和实验技能，而且对蛋白质的性质和电泳条件有较高的要求。
此外，电泳法只能分离相对较小的蛋白质，对大分子蛋白质的分离效果较差。
4. 亲和层析法亲和层析法是一种基于蛋白质与其配体之间的亲和作用来分离纯化蛋白质的方法。
它利用配体与蛋白质的特异性结合来分离纯化目标蛋白质。
亲和层析法具有分离效果好、选择性高、可重复使用等优点。
但是，它需要高纯度的配体和专业的实验技能，而且对蛋白质的性质和配体的选择有较高的要求。
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质
层析柱的重要参数 ：
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的 体积很少时（与洗脱体积比较可以忽 略不计） ，在洗脱图中，从加样到峰 顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当 样品体积与洗脱体积比较不能忽略时， 洗脱体积计算可以从样品体积的一半 到峰顶位置。③当样品体积很大时， 洗脱体积计算可以从应用样品开始到 洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1 厘 米 光 程 时 ， 254nm 处 透 光 率 为 60 ％ ，
280nm处透光率为100％。
3、试剂、器材：
3.1、层析介质 Sephadex G-50； 3.2、样品（包含三个组分）： ①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp
上样量：0.4ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐 水。
、洗脱液流速的影响：
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。 流速过快，会使色谱峰变形， 流速过慢，样品扩散倾向加剧。 一般流速控制在30－200ml/h。
今天洗脱流速控制在1ml/min。
、洗脱液的离子强度和pH值的影响：
纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐 溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和 消除凝胶的吸附作用；
Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率， 是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质 分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长 短粗细无关。
Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法蛋白质是细胞中的重要生物大分子，具有多样的结构和功能。
为了研究蛋白质的性质和功能，需要将蛋白质从混合样品中分离纯化出来。
蛋白质的分离纯化方法有很多种，主要包括离心法、电泳法、层析法和亲和纯化法等。
下面将逐一介绍这些方法及其原理。
1. 离心法离心法是利用离心机将混合物中的蛋白质分离出来。
首先将细胞裂解，得到细胞裂解液，然后进行离心，以将细胞器、胞外物质和亲粒子（如蛋白质颗粒）分离。
离心可以根据不同物质的相对密度和大小进行分层分离，快速旋转离心机可以很好地分离出不同密度的颗粒。
2. 电泳法电泳法是将带电的蛋白质沿着电场移动，根据蛋白质的带电性质和大小分离的方法。
蛋白质可以根据电荷性质分为阴离子蛋白和阳离子蛋白，也可以根据亲水性质分为亲水性蛋白和疏水性蛋白。
电泳法常用的有SDS-PAGE、等电聚焦电泳等。
其中，SDS-PAGE可以根据蛋白质的分子量进行分离。
3. 层析法层析法是通过蛋白质与载体之间的亲和性或者分离介质之间的亲和性进行分离的方法。
层析法主要分为凝胶层析、离子交换层析、亲合层析和大小排阻层析等。
凝胶层析法是利用凝胶的网格结构来分离蛋白质，如凝胶过滤层析、凝胶过渡层析等。
离子交换层析法是利用蛋白质对离子交换树脂的吸附性质进行分离。
亲合层析法是通过亲和柱中的配体与蛋白质的亲和作用进行分离。
大小排阻层析法是根据蛋白质的分子量和形状进行分离。
4. 亲和纯化法亲和纯化法是利用特定的亲合剂与目标蛋白质之间的特异性亲和性进行分离纯化的方法。
亲和纯化主要包括亲和柱层析法、浸没纯化法、亲和剂电泳法等。
亲和柱层析法是将具有亲和填料的柱子与样品接触，通过洗脱再生的操作，将目标蛋白质从其他组分中分离纯化出来。
浸没纯化法是将特定亲合剂浸泡在蛋白质混合物中，使其与目标蛋白质发生亲和结合，然后以特定条件洗脱目标蛋白质。
亲和剂电泳法是负载亲和剂的凝胶片上进行电泳，使蛋白质与亲和剂结合，再通过电泳将其分离纯化出来。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【实验器材】
层析柱 恒流泵 紫外检测仪 部分收集器 试管等普通玻璃器皿
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【实验试剂】
待分离样品 葡聚糖凝胶 Sephadex G-100 洗脱液：0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液
凝胶层析法分离纯化蛋白质
【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋 白质分子量大小进行分 离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。
单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的 程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
凝胶层析法分离纯化蛋白质
带网入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过凝滤胶层层析法分析离纯过化蛋程白质 示意图
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤凝胶层层析法析分离过纯化程蛋白质示意图
总结：
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。
实验3凝胶过滤法使蛋白质脱盐
学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原 理与操作技术
【实验原理】
凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或 凝胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质的 大小和形状，即蛋白质的相对分子质量进行 分离和纯化。
该方法广泛用于生物大分子的分离、纯 化、浓缩等。
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凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶 性珠状颗粒。多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂 糖)类物质，用它来进行物质分离，主要是根据 多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同 的排阻效应实现的。
脱液（去离子水），将凝胶 浆液沿玻棒缓慢倾入柱中 （注满）。凝胶自然沉积约 1～2cm 高度后打开下端出 水口,待凝胶床面上升到约 3/4柱高停止。关闭出水口, 静置。
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2.洗柱 通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层
析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗 层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称 作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般
2
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葡聚糖凝胶的商品名称为 Sephadex，它具有三维空实验用G-25使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当 蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的 (NH4)2SO4扩散进入G-25的网孔中，而大分子的 蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻 在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分 子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动， 首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩散 进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到 阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质 与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白质 样品脱盐的目的。
。
为柱床体积的2～3倍），再拧紧螺旋夹。 洗柱过程中注意调整流速约2ml/min。
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3.加样与洗脱
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了解凝胶层析分基本原理，学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
三、试剂和材料
1）载体：葡聚糖凝胶G-50 2）样品液：
含蓝色葡聚糖2000[相对分子质量在200万以上，蓝色]， 红色水溶性百里香酚蓝[分子质量488.60，红色]
3）洗脱液： 50mmol/L pH3.0 磷酸缓冲液。
（每组200ml。溶液配方：磷酸氢二钠：1.754g；磷酸二氢钠： 0.796g；NaCl：1.752g，用水定容至200ml。配制完成后用盐酸调pH 值为3.0）
凝胶过滤层析原理示意图
一、目的 二、原理
1）凝胶层析是基于分子大小不同而进行分离的一种分离方 法。 2）将一定量的含有不同大小分子的混合原料加在柱上并用 流动相洗脱，则无法进入多孔凝胶颗粒内部的大分子会直接随 流动相由凝胶颗粒之间的空隙被洗脱下来； 3）小分子因可深入凝胶颗粒内部而受到很大的阻滞，最晚 洗脱下来； 4）中等大小的分子虽可进入凝胶颗粒内部但并不深入，受 到凝胶颗粒的阻滞作用不强，因而在两者之间被洗脱下来。
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实验步骤
五、收集： 1、用试管进行样品的收集，每管1ml。
2、注意观察层析柱内分离现象，并观察收集管内颜色深浅， 以—、+、++等记号记录两种物质洗脱液的颜色。或者用400nm， 550nm测其OD值
六、凝胶柱的处理： 1、凝胶柱用过后，反复用蒸馏水（2~3倍床体积）通过柱即可。
2、如果凝胶有颜色或比较脏，需用0.5 mol/L 的NaOH-0.5 mol/L NaБайду номын сангаасl洗涤，再用蒸馏水洗。
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实验步骤
三、平衡： 1、将洗脱液与恒流泵相连，用2倍床体积的洗脱液平衡，平衡 完成后，检测流出液的pH值是否为3.0。 四、加样和洗脱： 1、将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口。 2、将400ul的样品沿层析柱管壁小心加入，加完后，在打开底 端出口。 3、用少量洗脱液清洗柱内壁2次，加洗脱液至液层4cm左右， 按上恒流泵，开始洗脱。
实验七
凝胶层析法分离纯化蛋白质
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析是按照 蛋白质分子量大小进行分
离的技术，又称之凝胶过
滤、分子筛层析或排阻层 析。 凝胶过滤层析的固定相为
凝胶珠，单个凝胶珠本身
象“筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。
凝胶珠
带网孔的 葡聚糖凝 胶珠
小分子进入 凝胶珠内 大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
实验步骤
1、凝胶的预处理 2、装柱 3、平衡 4、样品的准备 5、上样 6、洗脱和收集
7、凝胶的再生及保存
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实验步骤
一、凝胶（G-50）的预处理： 1、Sephadex G-50 干粉室温用蒸馏水充分溶胀24h。溶胀过程注 意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。 二、装柱： 1、将层析柱垂直装好，关闭出口，加入洗脱液约3cm高。 2、强处理好的凝胶自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待底部凝 胶沉积约1cm高时，再打开出口，继续加入凝胶浆，至凝胶沉积至 一定高度，约12cm即可。 3、装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”
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七、实验结果： 1、哪种物质先被分离出来？为什么？ 2、每种物质在收集过程中颜色的变化？
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