RNA ChIP
CHIP技术
染色质免疫沉淀分析ChIP技术介绍染色质免疫沉淀分析ChIP 技术介绍(Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChiP)(Abcam 公司与Upstate 公司都提供ChIP 抗体产品)染色质免疫沉淀法(Chromatin immunoprecitation,ChIP)就是研究体内DNA 与蛋白质相互作用的重要工具。
它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况,还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。
核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等,这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。
根据“组蛋白密码”假说,组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能,因此,ChIP 也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用,全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。
真核生物细胞状态就是由内源与外源因素共同影响的,所有信号传递途径的终点都就是DNA。
DNA 通过核蛋白复合物组成染色质,染色质就是基因调控的一个重要作用位点。
转录激活因子与辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制--“组蛋白密码”,其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。
该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。
随着越来越多组蛋白核心结构区域与羧端修饰的确定,组蛋白密码在控制与调节基因功能过程中的作用越来越明确。
参与修饰的酶根据其作用的不同而分类:如组氨酸乙酰转移酶(HATs)可以将乙酰基团转到组蛋白上;组蛋白去乙酰酶(HDACs)可以去除氨基酸上的乙酰基团;组蛋白甲基转移酶(HMTs)可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程,它可以作为调节因子的作用位点,也可以用来改变染色质结构。
染色质免疫沉淀分析(ChiP)就是基于体内分析发展起来的方法,它的基本原理就是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA 复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。
chip引物设计原则
chip引物设计原则
在设计chip（芯片）引物时，需要考虑以下原则：
1. 引物应与目标DNA或RNA序列相互补，以确保引物能够与目标序列特异性结合。
2. 引物长度通常在18到25个核苷酸之间，较短的引物更容易与目标序列结合，但可能会导致非特异性结合，而较长的引物则更特异性，但可能会产生非特异性杂交。
3. 引物中应避免重复核苷酸序列或富含GC碱基，以减少非特异性杂交的可能性。
4. 引物应避免形成自身互补结构或内部有自相似序列，以防止引物间相互结合或引物自身的结构变化。
5. 引物的3'端应尽量避免包含重复核苷酸，以确保扩增产物的长度准确。
6. 引物的熔解温度（Tm）应在50°C到65°C之间，以确保在PCR反应中引物与目标序列稳定结合。
7. 引物的末端可以添加适当的化学修饰，如磷酸化或终止子，以增加PCR反应的效率和特异性。
8. 在设计多个引物时，引物间的Tm应尽量相似，以确保它们在PCR反应中同时扩增。
9. 引物设计时应考虑目标序列的特点，如GC含量、嵌合序列、变异位点等。
10. 在设计引物时，可以使用专门设计引物的软件或在线工具
来帮助验证引物的合适性和特异性。
ChIP 原理及实验方法
染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验方法实验原理染色质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。
ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少了体外实验的误差。
在活体细胞中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一定的方法（例如：超声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过一定手段把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用PCR等方法检测鉴定共沉淀的DNA片段的特性。
仪器和试剂真空设备、涡旋器、液氮、冷冻离心管、离心机、超声波粉碎仪、miracloth 37%甲醛，2M甘氨酸，ddHO，剪切的鲑精DNA/protein A琼脂糖珠(Sant cruz)，2蛋白酶K（14mg/ml）,RNaseA,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,氯仿,无水乙醇,提取缓冲液1（EB1）:0.4M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；5mM β-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（aprotinin、pepstain A、Leupeptin、Antipain、TPCK、Benzamidine）•提取缓冲液2（EB2）:0.25M 蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；10mM MgCl2；1%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)；5mM β-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上）提取缓冲液3（EB3）：1.7M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；0.15%Triton X-100；2mM MgCl；5mMβ-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上）2核裂解缓冲液（NLB）：50mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA；1%SDS；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上）ChIP稀释缓冲液（ChIP DB）：1.1%Triton X-100；1.2mM EDTA；16.7 mMTris-HCl，pH8.0；167mM NaCl；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上）洗脱缓冲液（EB）：1%SDS；0.1M NaHCO3（现配）低盐洗脱液：150mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0高盐洗脱液：500mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0LiCl洗脱液：0.25M LiCl；1%NP-40；1%脱氧胆酸钠；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0TE缓冲液：1mM EDTA；10mM Tris-HCl，pH8.0实验方法植物材料的准备（以拟南芥为例）1．在覆盖有保鲜膜的土里播上拟南芥的种子。
CHIP原理
关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结ChIP实验原理在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor,TF）与启动子（promoter）的关联性。
由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。
这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。
当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。
细胞内，当TF与Promoter 相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。
ChIP实验步骤第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。
（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
450ul2.5M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS 依次为5ml，3ml和3ml）。
预冷后2000rpm5min收集细胞。
6、倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
ChIP实验精讲(做科研的必看)
ChIP实验精讲(做科研的必看)染色质免疫共沉淀（ChIP）概述ChIP：chromatinimmunoprecipitation assay，染色质免疫沉淀技术。
研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法原理在活细胞状态下固定“蛋白质-DNA”复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
ChIP应用1、检测体内反式因子与DNA的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系；2、CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-ChIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；3、CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；4、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
试验流程一、交联染色质免疫沉淀技术1. 细胞甲醛交联和收集注意事项：①需要优化甲醛使蛋白质和DNA交联的时间。
②交联的时间很关键。
交联的时间一般为2-30 分钟。
③交联过度会降低抗原的可结合性和超声的效率，也会被遮盖抗原的表位。
④甘氨酸可抑制甲醛的作用，终止交联反应。
1.1 取1直径10cm培养皿的细胞。
加入甲醛至终浓度为0.75%（V/V），使蛋白和DNA 交联。
1.2 室温下，轻摇10 分钟。
1.3 加入甘氨酸至终浓度为125 mM，室温下放置5 分钟，以终止交联。
1.4 吸去培养基，用冰冷PBS 洗细胞2 次。
1.5 使用细胞刮刀，加入5ml 冰冷PBS，刮下细胞，收集至一个50 ml 离心管中。
1.6 再用 3 ml 冰冷PBS 洗培养皿2次，至50ml 离心管中。
1.7 4℃，1000 g，离心5分钟收集细胞。
1.8 吸弃上清，用SDSLysis Buffer重悬沉淀（每1 X 107 个细胞加800 μl）。
chip操作步骤
磁珠吸附法chip操作步骤及试剂配方1、每盘细胞（8ml培液），加入11×Fixation solution 800ul使得甲醛的终浓度为1%，fixation solution为现配，室温摇床10min。
(甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。
甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析; 交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。
交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。
甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。
)2、终止交联：加1M甘氨酸1.26ml，使其终浓度为0.125。
室温摇床5min。
3、用冰冷的PBS 冲洗两次后，加适量pbs+pmsf，用细胞刷刮下细胞，4℃ 1000RPM离心5min。
4、倒去上清，加入1ml Scell Lysis Buffer，冰上放置10min，匀浆器匀浆后转入2ml Ep管中，4℃ 5000RPM离心5min.5、弃上清，300ul nuclei Lysis buffer，吹散沉淀。
6、socinate破碎：1min on off 30 10次左右，4℃ 13000RPM离心20min，琼脂糖胶电泳，亮带集中在1000bp左右的方可。
(以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。
)7、分别收集20ul样品做input -20℃保存。
(Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。
Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
)8、用 Chip Diluiton Buffer 稀释样品10倍9、准备beads，用Pre-Blocking buffer for dynabeads 洗beads3次.(Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合)，最好实验前一天准备beads。
测RNA浓度
测RNA浓度：
nanodrop的话，一般浓度在40ng/ul以上的样品，定量还是比较准的，低于这个浓度，Nanodrop就不行了，因为我经常同时做chip和drop两种检测，所以这方面的经验还是有一些。
如果你的RNA浓度偏低，而且你要高精确的定量分析：
建议上 nano chip，有效测定范围在0.5ng/ul到50ng/ul，如果浓度低于这个，可以采用pico chip。
Nanodrop的话，一般浓度在40ng/ul以上的样品，定量还是比较准的，低于这个浓度，Nanodrop就不行了，因为我经常同时做chip和drop两种检测，所以这方面的经验还是有一些。
至于紫外分光光度计法，这个没试过，其实Nanodrop就是一种程序化的紫外分光光度计法，只不过流水线化做成一台仪器了，直接给值的，很方便。
另外chip的操作相对复杂，你自己取舍了。
但是一般用作next generation sequencing的RNA，感觉nanochip是定量常规检测。
至于一般要求的RNA，nanodrop检测可以满足要求。
:tuzi11::tuzi32:。
rna芯片
rna芯片RNA芯片是一种用于检测和分析RNA分子的技术工具。
它使用基因芯片的原理，将大量的RNA序列固定在芯片上，通过杂交技术检测样品中的RNA分子。
RNA是一类可以传递遗传信息的核酸分子，与DNA不同的是，RNA可以直接参与蛋白质合成，扮演着基因表达的重要组成部分。
通过对RNA进行分析，可以了解细胞中所表达的基因及其活性水平，从而揭示生物活动的机制。
RNA芯片的制作过程是首先将RNA分子转录成cDNA，再将其标记为荧光物质，最后通过杂交技术将其固定在芯片上。
样品中的RNA与固定在芯片上的cDNA互相结合，形成双链杂交体。
通过检测荧光信号的强度和位置，可以确定样品中的RNA分子的类型和数量。
RNA芯片的应用十分广泛。
它可以用于研究基因表达调控的机制，例如在不同发育阶段或不同环境条件下细胞中基因表达的变化。
它还可以用于筛选和诊断疾病相关的基因标记物，从而实现个性化医疗。
此外，RNA芯片还可以用于药物研发和安全性评价，帮助发现和优化药物靶点，并评估药物对基因表达的影响。
与传统的基因表达分析方法相比，RNA芯片具有高通量、高灵敏度和高特异性的优势。
它可以同时检测数千到数万个基因，并对其进行定量分析，大大加快了研究进程。
此外，RNA芯片还可以对不同样品进行比较，揭示它们之间的差异和相似性，为生物学研究提供更全面的信息。
然而，RNA芯片也存在一些局限性。
首先，由于RNA的不稳定性，样品的取样和处理过程需要严格控制，以确保结果的准确性和可靠性。
其次，由于RNA的碱基组成多样性，芯片上的探针设计也需要考虑到不同RNA分子的异质性，从而减少假阳性结果的出现。
此外，芯片的高成本和复杂的数据分析过程也限制了它的使用范围。
总的来说，RNA芯片是一种重要的基因分析工具，广泛应用于基因表达研究、疾病诊断和药物研发等领域。
随着技术的不断发展，RNA芯片将继续在生物学和医学领域发挥重要作用，为我们揭示生命的奥秘。
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RNA ChIP-IT Experimental Design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5
Protocols A. Cell Fixation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 B. Lysis & Shearing of Chromatin by Sonication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 C. DNase I Treatment of Chromatin (optional; recommended) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 D. Immunoprecipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 E. Wash Magnetic Beads . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 F. Elution and Reversal of Cross-links . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 G. RNA Purification with Trizol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 H. DNase I Treatment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 I. Analysis of Samples by RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 End point RT-PCR analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Real-time RT-PCR analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2-21 Ageba-Cho, Shinjuku-Ku
Tokyo, 162-0824, Japan
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Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Appendix Section A. Cell Fixation to Optimize Shearing Conditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 Section B. Optimization of Chromatin Shearing by Sonication . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Section C. RNA Clean Up to Assess Shearing Efficiency and RNA Concentration . . . . . 20 Section D. Use of Magnetic Beads and Included Bar Magnet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Section E. Troubleshooting Guide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Section F. Related Products . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
This documentation may not be copied, transferred, reproduced, disclosed, or duplicated, in whole or in part, without the prior written consent of Active Motif, Inc. This documentation is proprietary information and protected by the copyright laws of the United States and international treaties.
Flow Chart of Process . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Components and Storage RNA ChIP-IT Kit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Additional Materials Required . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
France Free Phone: 0800 90 99 79
Germany Free lephone:
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Fax:
+32 (0)2 653 0050
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Technical Services . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28