27医学分子生物学技术PPT课件
合集下载
医学分子生物学_PPT课件
2016/9/3 12
分子生物学技术：
由生物化学、生物物理学、细胞生物学、 遗传学、应用微生物学及免疫学等各专业技术 的渗透、综合而成，并在此基础上发明和创造 了一系列新的技术。 例如：DNA及RNA的印迹转移、核酸分子杂 交、基因克隆、基因体外扩增、DNA 测序等， 形成了独特的重组DNA技术及其相关技术。
2. 前体mRNA分子的拼接，去除内含子序列，连接成 成熟mRNA； 3. 发现单基因遗传病的基因结构的变异； 4. 从cDNA序列推导出蛋白质的一级结构； 5. 根据DNA序列合成基因，并与载体连接，使之在细 菌中表达，合成活性蛋白质，开创了基因工程。
2016/9/3
37
6. 基因的人工合成
1978年体外首次成功地人工合成第一个完
☻基因工程和蛋白质工程
外源DNA与载体在体外进行连接，或在基因水
平上进行有目的的定向诱变。
生物技术进入了分子水平，基因（或DNA）也 进入了社会生产和人们生活的方方面面。
2016/9/3 16
按照自己的意愿和社会需求改造基因，制备
各种具有生物活性的大分子。
DNA、RNA 和蛋白质成为人类治病、防病的一
的遗传密码，证明DNA分子中的遗传信息是以三联密
码的形式贮存。 遗传密码在生物界具有通用性。
2016/9/3
29
2016/9/3
30
2016/9/3
31
4. 中心法则的建立
1958 年， Crick 提出了分子生物学的中 心法则（central dogma）。 中心法则是分子遗传学基本理论体系。
整基因。 直接证实了Mendel G在1865年发现的遗传 因子(基因)的化学本质，就是 DNA分子。 DNA分子是多种多样生命现象的物质基础。
分子生物学技术：
由生物化学、生物物理学、细胞生物学、 遗传学、应用微生物学及免疫学等各专业技术 的渗透、综合而成，并在此基础上发明和创造 了一系列新的技术。 例如：DNA及RNA的印迹转移、核酸分子杂 交、基因克隆、基因体外扩增、DNA 测序等， 形成了独特的重组DNA技术及其相关技术。
2. 前体mRNA分子的拼接，去除内含子序列，连接成 成熟mRNA； 3. 发现单基因遗传病的基因结构的变异； 4. 从cDNA序列推导出蛋白质的一级结构； 5. 根据DNA序列合成基因，并与载体连接，使之在细 菌中表达，合成活性蛋白质，开创了基因工程。
2016/9/3
37
6. 基因的人工合成
1978年体外首次成功地人工合成第一个完
☻基因工程和蛋白质工程
外源DNA与载体在体外进行连接，或在基因水
平上进行有目的的定向诱变。
生物技术进入了分子水平，基因（或DNA）也 进入了社会生产和人们生活的方方面面。
2016/9/3 16
按照自己的意愿和社会需求改造基因，制备
各种具有生物活性的大分子。
DNA、RNA 和蛋白质成为人类治病、防病的一
的遗传密码，证明DNA分子中的遗传信息是以三联密
码的形式贮存。 遗传密码在生物界具有通用性。
2016/9/3
29
2016/9/3
30
2016/9/3
31
4. 中心法则的建立
1958 年， Crick 提出了分子生物学的中 心法则（central dogma）。 中心法则是分子遗传学基本理论体系。
整基因。 直接证实了Mendel G在1865年发现的遗传 因子(基因)的化学本质，就是 DNA分子。 DNA分子是多种多样生命现象的物质基础。
分子生物学技术ppt课件
• 核酸研究中的应用十分广泛。
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增
分子生物学ppt课件完整版
肿瘤标志物
寻找和验证肿瘤特异性标志物，用于肿瘤的早期诊断、预后评估和 个性化治疗。
肿瘤免疫治疗
利用分子生物学技术，研究和开发肿瘤免疫治疗策略，如CAR-T细胞 疗法等。
免疫学中的分子生物学应用
免疫相关基因
研究免疫相关基因的突变、表达和调控，揭示免疫应答和免疫疾 病的分子机制。
疫苗研发
利用分子生物学技术，研究和开发新型疫苗，如mRNA疫苗、 DNA疫苗等。
03
DNA修复机制
当DNA受到损伤时，细胞会启动修复机制对损伤进行修复。常见的修
复方式包括直接修复、切除修复和重组修复等。这些修复机制能够确保
遗传信息的稳定性和准确性。
03
RNA的结构与功能
RNA的分子组成
核糖核苷酸
RNA的基本组成单位是核 糖核苷酸，由磷酸、核糖 和碱基组成。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌 呤（A）、鸟嘌呤（G）、 胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U ）。
基因诊断与治疗
基因诊断
通过检测特定基因或基因突变来 预测或诊断疾病，如遗传性疾病
、癌症等。
基因治疗
通过修改或替换病变基因来治疗 疾病，如基因编辑技术CRISPR-
Cas9等。
个性化医疗
基于患者的基因组信息，制定个 性化的治疗方案，提高治疗效果
和减少副作用。
肿瘤分子生物学研究
肿瘤基因
研究肿瘤相关基因的突变、表达和调控，揭示肿瘤发生和发展的分 子机制。
分子生物学ppt课 件完整版
目 录
• 分子生物学概述 • DNA的结构与功能 • RNA的结构与功能 • 基因的表达与调控 • 分子生物学技术与方法 • 分子生物学在医学领域的应用
01
分子生物学概述
寻找和验证肿瘤特异性标志物，用于肿瘤的早期诊断、预后评估和 个性化治疗。
肿瘤免疫治疗
利用分子生物学技术，研究和开发肿瘤免疫治疗策略，如CAR-T细胞 疗法等。
免疫学中的分子生物学应用
免疫相关基因
研究免疫相关基因的突变、表达和调控，揭示免疫应答和免疫疾 病的分子机制。
疫苗研发
利用分子生物学技术，研究和开发新型疫苗，如mRNA疫苗、 DNA疫苗等。
03
DNA修复机制
当DNA受到损伤时，细胞会启动修复机制对损伤进行修复。常见的修
复方式包括直接修复、切除修复和重组修复等。这些修复机制能够确保
遗传信息的稳定性和准确性。
03
RNA的结构与功能
RNA的分子组成
核糖核苷酸
RNA的基本组成单位是核 糖核苷酸，由磷酸、核糖 和碱基组成。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌 呤（A）、鸟嘌呤（G）、 胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U ）。
基因诊断与治疗
基因诊断
通过检测特定基因或基因突变来 预测或诊断疾病，如遗传性疾病
、癌症等。
基因治疗
通过修改或替换病变基因来治疗 疾病，如基因编辑技术CRISPR-
Cas9等。
个性化医疗
基于患者的基因组信息，制定个 性化的治疗方案，提高治疗效果
和减少副作用。
肿瘤分子生物学研究
肿瘤基因
研究肿瘤相关基因的突变、表达和调控，揭示肿瘤发生和发展的分 子机制。
分子生物学ppt课 件完整版
目 录
• 分子生物学概述 • DNA的结构与功能 • RNA的结构与功能 • 基因的表达与调控 • 分子生物学技术与方法 • 分子生物学在医学领域的应用
01
分子生物学概述
医学分子生物学PPT课件
1、孕育阶段（1869-1952）
※ DNA是遗传物质
• 1869 年 ， 德 国 ， Miescher, 发 现 核 素 (chromatin) • 1928年，英国，Griffith, 发现转化现象 • 1944年，美国， Avery ，肺炎双球菌 (离体实验 ) • 1952 年， Hershey&Chase, 噬菌体 T2 的感染实验
基因导入，标志人类基因治疗的开始。 • 1990年，美国启动人类基因组计划 中国：人、鸡、水稻、表皮葡萄球菌、 痢疾杆菌、赖氏钩端螺旋体 • 2000年，后基因组计划（蛋白质组计划）
三、医学分子生物学研究领域
1、人体发育调控和功能调控
¶发育、分化与衰老 ¶细胞增殖 ¶神经内分泌和免疫调控
2、基因与疾病
3、发展阶段（1973-）
※ DNA重组及其它
• 1972 年美国斯坦福大学的 Berg P 等用限
制 性 内 切 酶 EcoRⅠ 在 体 外 切 割 猴 病 毒
SV40 和λ噬菌体 DNA ，再用 T4DNA 连接酶 把两种不同来源的DNA片段连接成一个片 段，完成了世界上第一个DNA体外重组。
•1970年，Smith ，限制性核酸内切酶
•1972年，Mertz-Davis，连接酶
Rosalind Franklin
1953, JamesWatson and Frances Crick 1962，Nobel Prize
•1970 年，美国约翰· 霍布金斯大学的
h. smith 于偶然中发现，流感嗜血杆 菌 （haemophilus influenzae）能迅 速降解外源的噬菌体 dna ，其细胞提 取液可降解 e.coli dna ，但不能降 解自身 dna ，从而找到 hindⅱ 限制 性内切酶。
分子生物学技术 PPT课件
局限性 联合应用
RNA制备
• Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织 或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol 法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直 接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+ 分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
• RNA提取试剂盒：国产、进口 常用总RNA提取试剂盒 尽量选用含DNA酶的试剂盒
步骤
• 以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积 不能超过所用Trizol体积的10%。
• 研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的 比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
• 取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙 醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10 分钟。
• 操作过程中带手套、口罩。
PCR
• 聚合酶链式反应(PCR)扩增：指数扩增是一 种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的 RNA。
• 一种选择性体外扩增DNA的方法. • 一种将微量的目的DNA片段在体外快速、
大量扩增的技术。 • 半保留复制
• 三个基本步骤: • (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下
PCR反应体系的基本成分
• 模板: cDNA • 引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷
酸片段，一般18-30bp, 上下游引物 • DNA聚合酶: 如Taq酶 • 底物: 等浓度的四种核苷酸（dNTP） • 反应环境: 含有Mg2＋的Tris-Cl缓冲液。
含DNA聚合酶的2×反应混合物
PCR反应体系的基本成分
✓ 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使 非特异性增高。
RNA制备
• Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织 或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol 法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直 接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+ 分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
• RNA提取试剂盒：国产、进口 常用总RNA提取试剂盒 尽量选用含DNA酶的试剂盒
步骤
• 以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积 不能超过所用Trizol体积的10%。
• 研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的 比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
• 取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙 醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10 分钟。
• 操作过程中带手套、口罩。
PCR
• 聚合酶链式反应(PCR)扩增：指数扩增是一 种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的 RNA。
• 一种选择性体外扩增DNA的方法. • 一种将微量的目的DNA片段在体外快速、
大量扩增的技术。 • 半保留复制
• 三个基本步骤: • (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下
PCR反应体系的基本成分
• 模板: cDNA • 引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷
酸片段，一般18-30bp, 上下游引物 • DNA聚合酶: 如Taq酶 • 底物: 等浓度的四种核苷酸（dNTP） • 反应环境: 含有Mg2＋的Tris-Cl缓冲液。
含DNA聚合酶的2×反应混合物
PCR反应体系的基本成分
✓ 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使 非特异性增高。
医学分子生物学PPT课件
高通量测序技术则可以对整个 基因组进行测序，提供更加全 面和准确的基因信息，是目前 最先进的基因诊断技术之一。
基因诊断技术在临床中应用案例分析
01
基因诊断技术在临床中应用广泛，如用于遗传性疾病的诊断、病原体 检测、药物基因组学等。
02
例如，对于遗传性疾病的诊断，基因诊断技术可以检测出患者是否携 带某种遗传病的致病基因，为疾病的早期预防和治疗提供依据。
03
在病原体检测方面，基因诊断技术可以快速、准确地检测出病原体的 种类和数量，有助于临床医生及时采取有效的治疗措施。
04
药物基因组学则是利用基因诊断技术，分析个体对药物的代谢和反应 差异，为个体化用药提供指导。
07
基因治疗策略安全性问题 探讨
基因治疗策略概述
基因治疗定义
通过修改或操纵人类或其 他生物的遗传物质以达到 治疗疾病的目的。
06
基因诊断技术原理临床应 用
基因诊断技术原理简介
基因诊断是利用分子生物学技术 ，检测和分析基因的结构和功能 异常，从而对疾病进行诊断和预
测。
基因诊断技术基于DNA或RNA 水平的变化，包括基因突变、基 因缺失、基因插入、基因重排等
。
通过检测这些变化，可以确定个 体是否携带某种疾病的易感基因 或已经患病，为临床诊断和治疗
提供依据。
基因诊断技术方法分类
基因诊断技术主要包括核酸检 测技术、基因芯片技术、高通
量测序技术等。
核酸检测技术是最常用的基因 诊断方法之一，包括聚合酶链 式反应（PCR）、实时荧光定 量PCR等，可用于检测病原体
、基因突变等。
基因芯片技术是一种高通量的 基因检测技术，可以同时检测 多个基因的变化，适用于大规 模筛查和基因表达谱分析。
基因诊断技术在临床中应用案例分析
01
基因诊断技术在临床中应用广泛，如用于遗传性疾病的诊断、病原体 检测、药物基因组学等。
02
例如，对于遗传性疾病的诊断，基因诊断技术可以检测出患者是否携 带某种遗传病的致病基因，为疾病的早期预防和治疗提供依据。
03
在病原体检测方面，基因诊断技术可以快速、准确地检测出病原体的 种类和数量，有助于临床医生及时采取有效的治疗措施。
04
药物基因组学则是利用基因诊断技术，分析个体对药物的代谢和反应 差异，为个体化用药提供指导。
07
基因治疗策略安全性问题 探讨
基因治疗策略概述
基因治疗定义
通过修改或操纵人类或其 他生物的遗传物质以达到 治疗疾病的目的。
06
基因诊断技术原理临床应 用
基因诊断技术原理简介
基因诊断是利用分子生物学技术 ，检测和分析基因的结构和功能 异常，从而对疾病进行诊断和预
测。
基因诊断技术基于DNA或RNA 水平的变化，包括基因突变、基 因缺失、基因插入、基因重排等
。
通过检测这些变化，可以确定个 体是否携带某种疾病的易感基因 或已经患病，为临床诊断和治疗
提供依据。
基因诊断技术方法分类
基因诊断技术主要包括核酸检 测技术、基因芯片技术、高通
量测序技术等。
核酸检测技术是最常用的基因 诊断方法之一，包括聚合酶链 式反应（PCR）、实时荧光定 量PCR等，可用于检测病原体
、基因突变等。
基因芯片技术是一种高通量的 基因检测技术，可以同时检测 多个基因的变化，适用于大规 模筛查和基因表达谱分析。
医学分子生物学PPT课件
Friedeich Miescher
21
自核酸被发现以来的相当长时期内， 对它的生物学功能几乎毫无所知。 1928 年(Frederick Griffith)以后，核酸功能 研究取得了重大进展。
22
In 1928, an experiment of Frederick Griffith using pneumonia bacteria and mice
8
现代分子生物学的建立
1950年，Astbury在一次讲演中首 先使用 “分子生物学”这一术语, 用以 说明它是研究生物大分子的化学和物 理学结构。
9
DNA双螺旋结构模型的建立
罗沙琳德·弗兰克林 （Rosalind Franklin，
1920－1958）英国
DNA的X光衍射照片 1952年5月拍摄
基因操作 (gene manipulation) 分子克隆 (molecular cloning) 基因克隆 (gene cloning) 基因工程 (gene engineering)
14
分子医学（molecular medicine）： 由于分子生物学渗透进入生物学和医学的
每一分支领域，全面推动了生命科学和医学 的各个方面的发展，如疾病的发病机理研究、 疾病的诊断和治疗，使医学进入了一个崭新 的时代。
DNA、RNA 和蛋白质成为人类治病、防病的 一类新型的生物制品或药物。
生物技术在农业上用于快速育种，改良品种， 提高农作物的产量、质量以及抗病虫害，抗干旱 等能力。
17
二、分子生物学的研究内容
18
分子生物学的主要研究内容 生物大分子的结构、功能，生物大分
子之间的相互作用及其与疾病发生、发展 的关系。
24
医学分子生物学 绪论PPT27页
医学分子生物学 绪论
61、辍学如磨刀之石不见其损，日 有所亏 。 62、奇文共欣赞，疑义相与析。
63、暧暧远人村，依依墟里烟，狗吠 深巷中 ，鸡鸣 桑树颠 。 64、一生复能几，倏如流电惊。 65、少无适俗韵，性本爱丘山。
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
61、辍学如磨刀之石不见其损，日 有所亏 。 62、奇文共欣赞，疑义相与析。
63、暧暧远人村，依依墟里烟，狗吠 深巷中 ，鸡鸣 桑树颠 。 64、一生复能几，倏如流电惊。 65、少无适俗韵，性本爱丘山。
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
信 进样 号
t0
因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与 流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱长 L与t0的比值计算，即
ū = L/t0
17.07.2020
21
2. 保留时间tr 试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，
称为保留时间，如下图。
信 进样 号
tr
17.07.2020
生物功能专一性 亲和层析
疏水性
疏水作用层析、反相高效液相层析
17.07.2020
3
第一章 蛋白质的分离与纯化
二、 蛋白质纯化的一般设计原则 1、目的蛋白的分离和纯化应该尽可能选 择来源方便、成本低、易操作的组织或 细胞作为原料； 2、要建立一个特异、快速、可重复、经 济的目的蛋白活性检测方法； 3、蛋白质分离纯化工艺的设计应该分级 分离、先粗后细的原则； 4、纯化条件要尽可能温和。
17.07.2020
14
顶替法是将样品加到色谱柱头后，在 惰性流动相中加入对固定相的吸附或 溶解能力比所有试样组分强的物质为 顶替剂（或直接用顶替剂作流动相）， 通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解 能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。 很明显，吸附或溶解能力最弱的组分 最先流出，最强的最后流出。顶替法 的流出曲线如下图。
17.07.2020
8
塔板理论假设：
1. 在柱内一小段长度H内，组分可以在两
相间迅速达到平 衡。这一小段柱长称为
理论塔板高度H。
2. 以气相色谱为例，载气进入色谱柱不
是连续进行的，而是脉动式，每次进气
为一个塔板体积（ΔVm）。
3. 所有组分开始时存在于第0号塔板上，
而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。
17.07.2020
23
4. 死体积V0
指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空 间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的 总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与 色谱柱出口的载气流速Fco（cm3·min-1）计算。
17.07.2020
4
第一章 蛋白质的分离与纯化
第二节 蛋白质的层析(chromatography) 分离 一、层析技术的发展简史及科学意义 二、层析技术的基本原理 固定相：在层析系统分离过程中静止不 动的相。 流动相：在层析系统分离过程中在载体 上延一定方向移动的相。
17.07.2020
5
17.07.2020
17.07.2020
15
17.07.2020
16
迎头法是将试样混合物连续通过色谱 柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先 一纯物质的状态流出，其次则以第一 组分和吸附或溶解能力较弱的第二组 分混合物，以此类推。流出曲线如下 图。
17.07.2020
A
A+ B
17
层析流出曲线及相关术语
色谱流出曲线和色谱峰 由检测器输出的电信号强度对
22
3. 调整保留时间tr´
• 某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留
时间，即 tr´= tr t0
• 由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通 过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所 以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间。
• 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时 间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留 体积来表示保留值。
峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距
离，以（h）表示。
17.07.2020
19
信 号
进样 空气峰
色谱峰 h a
色谱流出曲线 • 色谱流出曲线和色谱峰 • 基线（a） • 峰高（h）
17.07.2020
20
保留值
死时间t0
不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样 到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱 的空隙体积，如下图。
17.07.2020
10
17.07.2020
11
17.07.2020
12
17.07.2020
13
层析的展开方式
洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将 样品加到色谱柱头上，然后用吸附或 溶解能力比试样组分弱得多的气体或 液体作冲洗剂。由于各组分在固定相 上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂 带出的先后次序也不同，从而使组分 彼此分离。流出曲线下图。
第一章 蛋白质的分离与纯化
第一节 蛋白质分离纯化的一般原则 一、蛋白质分离纯化技术及其依据
表1－1 主要的蛋白质分离纯化方法及依据
性质Байду номын сангаас
分离方法
分子大小与形状 超滤、透析、密度梯度离心、凝胶过滤层析、凝胶电泳
溶解度
沉淀法、相分配法、分配层析、结晶、溶剂抽提、逆流分配
电荷分布
电泳技术、等电点沉淀、离子交换层析、聚焦层析、等电聚倍数电泳
4. 分配系数在所有塔板上是常数，与组
分在某一塔板上的量无关。
17.07.2020
9
简单地认为：在每一块塔板上，溶质 在两相间很快达到分配平衡，然后随 着流动相按一个一个塔板的方式向前 移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质 平衡的次数应为：
n=L/H n称为理论塔板数。与精馏塔一样， 色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加 而增加，随板高H的增大而减小。
6
17.07.2020
7
塔板理论：
(溶质在固定相中的浓度) Cs
K＝
＝
(溶质在流动相中的浓度) Cm
把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中 塔板的概念来描述组分在两相间的分配行 为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率 的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相 等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用 H表示，称为塔板高度，简称板高。
17.07.2020
1
概述 General overview
点击输入本栏的具体文字，简明扼要的说明分项内容，请根据您 的具体内容酌情修改。
Click to enter the specific text in this column to explain the sub item content briefly. Please modify it according to your specific content.
时间作图，所得曲线称为色谱流出曲 线。曲线上突起部分就是色谱峰。
如果进样量很小，浓度很低， 在吸附等温线（气固吸附色谱）或分 配等温线（气液分配色谱）的线性范 围内，则色谱峰是对称的。
17.07.2020
18
基线 在实验操作条件下，色谱柱后
没有样品组分流出时的流出曲线称为 基线，稳定的基线应该是一条水平直 线。
t0
因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与 流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱长 L与t0的比值计算，即
ū = L/t0
17.07.2020
21
2. 保留时间tr 试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，
称为保留时间，如下图。
信 进样 号
tr
17.07.2020
生物功能专一性 亲和层析
疏水性
疏水作用层析、反相高效液相层析
17.07.2020
3
第一章 蛋白质的分离与纯化
二、 蛋白质纯化的一般设计原则 1、目的蛋白的分离和纯化应该尽可能选 择来源方便、成本低、易操作的组织或 细胞作为原料； 2、要建立一个特异、快速、可重复、经 济的目的蛋白活性检测方法； 3、蛋白质分离纯化工艺的设计应该分级 分离、先粗后细的原则； 4、纯化条件要尽可能温和。
17.07.2020
14
顶替法是将样品加到色谱柱头后，在 惰性流动相中加入对固定相的吸附或 溶解能力比所有试样组分强的物质为 顶替剂（或直接用顶替剂作流动相）， 通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解 能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。 很明显，吸附或溶解能力最弱的组分 最先流出，最强的最后流出。顶替法 的流出曲线如下图。
17.07.2020
8
塔板理论假设：
1. 在柱内一小段长度H内，组分可以在两
相间迅速达到平 衡。这一小段柱长称为
理论塔板高度H。
2. 以气相色谱为例，载气进入色谱柱不
是连续进行的，而是脉动式，每次进气
为一个塔板体积（ΔVm）。
3. 所有组分开始时存在于第0号塔板上，
而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。
17.07.2020
23
4. 死体积V0
指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空 间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的 总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与 色谱柱出口的载气流速Fco（cm3·min-1）计算。
17.07.2020
4
第一章 蛋白质的分离与纯化
第二节 蛋白质的层析(chromatography) 分离 一、层析技术的发展简史及科学意义 二、层析技术的基本原理 固定相：在层析系统分离过程中静止不 动的相。 流动相：在层析系统分离过程中在载体 上延一定方向移动的相。
17.07.2020
5
17.07.2020
17.07.2020
15
17.07.2020
16
迎头法是将试样混合物连续通过色谱 柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先 一纯物质的状态流出，其次则以第一 组分和吸附或溶解能力较弱的第二组 分混合物，以此类推。流出曲线如下 图。
17.07.2020
A
A+ B
17
层析流出曲线及相关术语
色谱流出曲线和色谱峰 由检测器输出的电信号强度对
22
3. 调整保留时间tr´
• 某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留
时间，即 tr´= tr t0
• 由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通 过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所 以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间。
• 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时 间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留 体积来表示保留值。
峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距
离，以（h）表示。
17.07.2020
19
信 号
进样 空气峰
色谱峰 h a
色谱流出曲线 • 色谱流出曲线和色谱峰 • 基线（a） • 峰高（h）
17.07.2020
20
保留值
死时间t0
不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样 到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱 的空隙体积，如下图。
17.07.2020
10
17.07.2020
11
17.07.2020
12
17.07.2020
13
层析的展开方式
洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将 样品加到色谱柱头上，然后用吸附或 溶解能力比试样组分弱得多的气体或 液体作冲洗剂。由于各组分在固定相 上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂 带出的先后次序也不同，从而使组分 彼此分离。流出曲线下图。
第一章 蛋白质的分离与纯化
第一节 蛋白质分离纯化的一般原则 一、蛋白质分离纯化技术及其依据
表1－1 主要的蛋白质分离纯化方法及依据
性质Байду номын сангаас
分离方法
分子大小与形状 超滤、透析、密度梯度离心、凝胶过滤层析、凝胶电泳
溶解度
沉淀法、相分配法、分配层析、结晶、溶剂抽提、逆流分配
电荷分布
电泳技术、等电点沉淀、离子交换层析、聚焦层析、等电聚倍数电泳
4. 分配系数在所有塔板上是常数，与组
分在某一塔板上的量无关。
17.07.2020
9
简单地认为：在每一块塔板上，溶质 在两相间很快达到分配平衡，然后随 着流动相按一个一个塔板的方式向前 移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质 平衡的次数应为：
n=L/H n称为理论塔板数。与精馏塔一样， 色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加 而增加，随板高H的增大而减小。
6
17.07.2020
7
塔板理论：
(溶质在固定相中的浓度) Cs
K＝
＝
(溶质在流动相中的浓度) Cm
把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中 塔板的概念来描述组分在两相间的分配行 为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率 的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相 等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用 H表示，称为塔板高度，简称板高。
17.07.2020
1
概述 General overview
点击输入本栏的具体文字，简明扼要的说明分项内容，请根据您 的具体内容酌情修改。
Click to enter the specific text in this column to explain the sub item content briefly. Please modify it according to your specific content.
时间作图，所得曲线称为色谱流出曲 线。曲线上突起部分就是色谱峰。
如果进样量很小，浓度很低， 在吸附等温线（气固吸附色谱）或分 配等温线（气液分配色谱）的线性范 围内，则色谱峰是对称的。
17.07.2020
18
基线 在实验操作条件下，色谱柱后
没有样品组分流出时的流出曲线称为 基线，稳定的基线应该是一条水平直 线。