Taq酶的制备
Taq DNA聚合酶的热纯化制备
Taq DNA聚合酶的热纯化制备丁燕华;刘树涛;齐庆远【摘要】[ Objective ] The paper was to improve the preparation efficacy of Taq DNA polymerase. [ Method ] Ni column was used to purify Taq DNA polymerase carrying with 6xHis tag, and recombined vector. Using the thermal -resistant characteristics of TaqDNA polymerase, the crude extract was treated at 75 ℃ for 1 h, and the activity of prepared enzyme solution was verified by PCR test. [ Result] The recombinant pET-32A-Taq could highly express in BL21 (DE3) host bacteria and remove hybrid protein by thermal denaturation. The enzyme preparation with the activity further higher than purchased TaqDNA polymerase was obtained. [ Conclusion ] Taq DNA polymerase prepared by thermal purification method is simple with low cost, and can meet the needs of a large number of conventional PCR amplification.%[目的]提高Taq DNA聚合酶的制备效率.[方法]利用Ni柱亲和色谱纯化载有6xHis标记的Taq DNA聚合酶,并重组载体,利用Taq DNA聚合酶的耐热特性,对粗提液75℃处理1h,之后通过PCR试验验证制备酶液的活力.[结果]所获重组的pET-32A-Taq能够在BL21(DE3)宿主菌中高效表达并可通过热变性去除杂蛋白,获得了活力远高于购买的Taq DNA聚合酶的酶制剂.[结论]使用热纯化法制备的Taq DNA聚合酶工艺简单,成本较低,能满足常规大量PCR实验要求.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)017【总页数】3页(P10153-10155)【关键词】Taq DNA聚合酶;热纯化;pET-32A;BL21(DE3)【作者】丁燕华;刘树涛;齐庆远【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江,金华,321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江,金华,321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江,金华,321004【正文语种】中文【中图分类】Q786Taq DNA聚合酶由水生嗜热菌(Thermus aquatics)YT-1菌株中分离而得。
Axygen Taq 酶 产品说明书
11/02 Ver.1爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-******** 传真：0571-******** E-mail: technical@ 仅限于实验室研究和体外实验研究。
Axygen Taq 酶产品说明书产品组成：AP-TAQ-M-5 Taq polymerase 500U (5 U/µl) 100 μl 10×PCR Buffer (Mg 2+-Free) 2×1.2 ml 25 mM MgCl 2 Buffer 2×1.2 mldNTP Mixture (各10 mM) 400 µl产品组成：AP-TAQ- 5Taq polymerase 500U (5 U/µl) 100 μl 10×PCR Buffer (Mg 2+-plus) 2×1.2 mldNTP Mixture (各10 mM)400 µl注：经常使用避免反复冻融。
产品说明：本制品是94KDa 的耐热性Taq DNA 聚合酶(简称Taq 酶)。
基因来源为Thermus aquaticus DNA polymerase ，将其克隆到大肠杆菌中进行表达后，经分离提取而得到的。
其具有与天然Taq DNA 聚合酶相同的功能。
Taq 酶可以催化5’至3’方向的依赖于DNA 模板的脱氧核苷酸的聚合。
Taq 酶不具有3’到5’的外切酶活性。
活性定义：用活化的大马哈鱼精子DNA 作为模板/引物，在74℃下，30分钟内，将10nmol 的全核苷酸转化为酸性不溶物所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。
纯度：1)将10U 的酶与1μg λDNA 在50μl 反应体系中，25℃反应8小时，45℃反应4小时，74℃反应4小时，DNA 电泳条带不发生变化。
2) 将10U 的酶与1μg 超螺旋DNA(ΦX174 RFI DNA)在50 µl 反应体系中，25℃反应8小时，45℃反应4小时，74℃反应4小时，DNA 电泳条带不发生变化。
taq酶冻干工艺
taq酶冻干工艺Taq酶冻干工艺是一项重要的生物技术方法，广泛应用于分子生物学领域。
它以Taq酶为主角，通过冻干技术将其保存和利用，以实现高效、稳定的DNA扩增。
下面将从冻干工艺的原理、应用以及优势等方面进行阐述。
我们来了解一下Taq酶冻干工艺的原理。
Taq酶是一种从热泉中分离出的热稳定酶，具有较高的耐热性和DNA聚合酶活性。
在PCR （聚合酶链式反应）实验中，Taq酶起到了关键的作用，它能够在高温下扩增DNA模板，从而实现对DNA的复制。
然而，Taq酶的活性易受到环境条件的影响，如温度、湿度等。
为了保证Taq酶的活性和稳定性，科学家们开发出了冻干工艺。
冻干工艺的步骤相对简单，首先将Taq酶溶液冷冻至极低温，然后通过真空脱水的方式将水分从冷冻的Taq酶溶液中去除，最后将干燥的Taq酶溶液密封保存。
这样，Taq酶的活性和稳定性就得到了保证。
在需要使用Taq酶时，只需将其重新溶解即可，而且保持了原有的活性和稳定性，方便实验操作。
Taq酶冻干工艺在分子生物学领域有着广泛的应用。
首先，它是PCR技术的关键步骤之一，用于扩增目标DNA序列。
PCR技术在基因工程、医学诊断、疾病预防等方面具有重要的应用前景。
其次，Taq酶冻干工艺还可以应用于DNA测序、基因克隆、基因突变分析等领域。
这些应用都依赖于Taq酶的高效、稳定的活性。
与传统的酶保存方法相比，Taq酶冻干工艺具有明显的优势。
首先，冻干工艺可以将Taq酶保存在较长的时间内而不失活性，延长了其使用寿命。
其次，冻干Taq酶易于储存和运输，方便实验室的使用。
此外，冻干工艺还可以提高Taq酶的稳定性，减少不必要的损失。
因此，Taq酶冻干工艺在分子生物学研究中具有重要的应用价值。
Taq酶冻干工艺是一项重要的生物技术方法，通过冻干技术实现对Taq酶的高效、稳定的保存和利用。
其原理简单，步骤清晰，应用广泛，具有明显的优势。
Taq酶冻干工艺的发展为分子生物学领域的研究提供了有力的支持，为相关领域的进一步发展和应用提供了有力的技术支持。
Taq酶的制备
1、BufferA:20ml 0.5M Tris（8.0）1.9817g 葡萄糖0.4ml 0.5M EDTA（8.0）定容至200ml2、Pre-lysis Buffer:200mg 溶菌酶+50ml BufferA 定容至50ml3、Lysisi Buffer：2ml 0.5M Tris（8.0）0.2ml 0.5M EDTA(8.0)0.5ml Tween20372.5mg KCl17.4mg PMSF(苯甲基磺酰胺) （用的时候再加）将以上药品定容至100ml4、Storage Buffer5ml 1M Tris(7.4)0.02ml 0.5M EDTA (8.0)0.154ml 0.648M DTT (100mg/ml DTT=0.648M) (DTT:二硫苏糖醇) 0.3725g KCl50ml 甘油将以上药品定容至100ml4、Dialysis Buffer （2L）100ml 1M Tris（8.0）0.4ml 0.5M EDTA (8.0)2.08ml 0.648M DTT1.6ml 0.5M PMSF (0.1394g) （用的时候再加）7.45g KCl1L甘油将以上药品定容至2L具体步骤：1、划线过夜2、单菌落试管过夜（4ml）3、加20ul到6ml LB试管中，37O C ,200rpm，7.5h4、加100ul到500ml LB，200rpm ，5.5h，测OD600=0.455、加2.6ml IPTG（→125mg/L），37O C ,200rpm，14h6、菌液5000rpm，10min7、向沉淀中加大于50ml Buffer A，涡旋，5000rpm，10min8、沉淀加25ml Pre—lysis Buffer 重悬，RT 15min9、加25ml Lysis Buffer ，75 O C,80min10、15000rpm，10min ，收集上清11、上清加约15g （NH4）2SO4，混合5min，15000rpm ，10min，弃上清12、向沉淀中加入20ml storge buffer ，透析2d，换四次透析液13、分装由于我们的50ml离心管装不了50ml，实验操作中的试剂用量我是按比例缩小了。
taq酶 测序 原理
taq酶测序原理
Taq酶测序是一种基于DNA聚合酶的测序方法。
Taq酶是一
种热稳定的DNA聚合酶，能够耐受高温条件下的DNA扩增
反应。
Taq酶测序的原理基于DNA链延伸和截断反应。
在Taq酶测序中，首先需要将待测DNA片段进行扩增，通常
使用聚合酶链反应（PCR）方法。
PCR使用一对引物（primers）在模板DNA的两侧进行扩增。
引物在反应体系中
的高温下与目标DNA片段特异性结合，并由Taq酶催化下的DNA聚合酶链扩增。
在扩增反应中，加入一种特殊的二进制链终止核苷酸（ddNTPs），它们是缺少3'羟基的核苷酸。
由于缺少3'羟基，当ddNTPs被加入新合成的DNA链上时，DNA聚合酶无法再
在其上继续延伸，导致链的突然终止。
经过多轮PCR反应，会产生一系列不同长度的DNA片段，每个片段以ddNTPs停止的位置为终点。
这些DNA片段随后可
以通过凝胶电泳进行分离，然后通过染料标记或放射性测定等方法进行检测。
通过对不同长度的DNA片段的测定，可以推断出原始DNA
片段的序列。
由于每个ddNTPs只能终止于特定的碱基，因此
可以通过测定每条DNA片段上的终止核苷酸来确定原始序列。
taq酶标准
TAQ酶标准一、酶的分类TAQ酶（Thermostable DNA polymerase）是一种热稳定DNA聚合酶，属于DNA聚合酶的一种。
根据酶的来源和性质，可以将酶分为多种不同的类型，包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、酯酶、氧化还原酶、蛋白水解酶等等。
每种酶都有其特定的生物学功能和特点，在生物体内发挥着不同的作用。
二、酶的特性TAQ酶具有热稳定性，能够在高温条件下保持活性。
这种特性使得TAQ酶在PCR等高温反应中具有广泛的应用。
此外，TAQ酶还具有高催化效率和高度特异性，能够催化DNA合成等反应，且不易发生误合成。
三、酶的应用TAQ酶在生物学、医学和生物工程领域都有广泛的应用。
在生物学研究中，TAQ酶可以用于基因克隆、DNA序列分析、基因表达等实验中。
在医学领域，TAQ酶可以用于诊断和治疗各种疾病，例如遗传性疾病、癌症、病毒感染等。
在生物工程领域，TAQ酶可以用于基因工程、蛋白质工程等研究中。
四、酶的检测与定量对于TAQ酶的检测和定量，可以使用各种方法，例如活性测定、免疫分析、光谱分析等。
其中，活性测定是常用的方法之一，可以通过测定酶促反应速率来评估TAQ酶的活性。
免疫分析则可以通过检测抗体与TAQ酶的结合情况来定量。
光谱分析可以通过测定光谱变化来定量TAQ酶的浓度。
五、酶的纯化与制备TAQ酶的纯化与制备是保证其质量和应用的关键步骤之一。
通常采用的方法包括离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等。
其中，离子交换色谱是常用的方法之一，可以通过交换TAQ酶上的离子来达到纯化的目的。
亲和色谱则可以利用抗体与TAQ酶的特异性结合来纯化。
此外，还可以使用基因工程技术生产重组TAQ酶。
六、酶的结构与功能关系TAQ酶的结构与功能关系是理解其生物学活性的关键。
TAQ酶是一种球状蛋白，由多个亚基组成，每个亚基都具有催化活性。
结构决定功能，TAQ酶的结构决定了其在高温条件下的稳定性和催化效率。
此外，TAQ酶的结构也与其特异性有关，例如识别和结合DNA模板的能力。
Taq酶
关于PCR反应的延伸时间
③3400bp的基因PCR时怎样设定程序，尤其是延伸的时间？ 求指教 这么长的PCR产物需要用特殊的Taq酶（如TAKARA的LA Taq，不知道这个酶是否换生产），普通的Taq酶一般延伸不 到这么长。你需要根据Taq酶的延伸速度计算延伸时间（Taq 酶的延伸速度一般是几百bp/min，你可以查查你用的Taq酶 的延伸速度），延伸时间=产物长度/延伸速度，然后留一些 冗余。3400bp至少需要延伸4-5min左右。 你要先看你所用的酶的说明书，上面有该酶的热启动温度， 变性温度，延伸温度等等，不同的酶都是不一样的。如果酶 的延伸速度是一分钟1kb，那么你就设3.5分钟，如果是半分 钟1kb，就设2分钟，就这样。退火温度是看你设计的引物， 你把引物放到设计软件上看一看，调整一下buffer的离子浓 度，看看退火温度是多少。就可以了。 ④延伸时间要足够长，一般按1min/kb延伸。
那么它是怎么被发现的呢
？
Taq聚合酶是我国台湾科学家钱嘉韵女士所分离， 钱嘉韵是第一个报道分离耐高温DNA聚合酶工 作的，1973 年，钱嘉韵就读于美国俄亥俄州辛 辛那提大学生物系，她的导师对黄石公园里热泉 中发现的嗜热菌十分好奇，就让钱嘉韵以该细菌 作为研究主题。在另一位老师的指导下，钱学会 了从细胞中分离蛋白质，成功分离出该细菌耐高 温的TaqDNA聚合酶。
Taq 酶 的 应 用
水生栖热菌是一种生长在温泉、蒸汽管道等 处的细菌，它体内的TAQ聚合酶可以耐受 90℃以上的高温而不失活，这在需要高温环 境的PCR反应中有着重要意义。因此TAQ聚合 酶取代了之前常用于PCR反应的大肠埃希菌 中的DNA聚合酶。PCR反应中应用TAQ聚合 酶，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得 非常简捷，大大降低了成本，PCR技术得以 大量应用，并逐步应用于临床。 一般适用于DNA片段的PCR扩增、DNA标记、 引物延伸、序列测定、平末端加A等，产物 可直接用于T-A克隆载体。
基因重组TaqDNA聚合酶的制备
收稿日期:2007-07-18基金项目:河南省科技厅自然科学基金(编号:511042300),河南省科技攻关资助项目(编号:624410041)作者简介:王天云(1968-),男,山东人,副教授,博士,研究方向为真核基因表达调控与基因工程。
基因重组Taq DNA 聚合酶的制备王天云1,秦 川2,杨 瑞2,杨献军2(1.新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,河南 新乡 453003;2.新乡医学院分子生物学研究室,河南 新乡453003)摘要: 目的 制备重组Taq D NA 聚合酶,为PCR 提供试剂。
方法 用Taq D NA 聚合酶基因的p Taq 表达质粒转化E.coli 菌株,异丙基硫代2B 2D 2半乳糖苷(IPT G )诱导12h 表达Taq D NA 聚合酶,溶菌酶、NP40裂解细菌,硫酸铵沉淀、4e 透析,SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PAGE )和PCR 扩增分析其纯度和活性。
结果 分离纯化制备的Taq 酶,纯度、活性都可与同类产品相比,能有效扩增DN A 片段。
结论 该方法制备可用于PCR 的Taq 酶具有快速简便的优点。
关键词: Taq DNA 聚合酶;基因工程;分离纯化中图分类号:Q783 文献标识码:A 文章编号:100427239(2007)0620551203P repar a tion of r eco m b i n an t Taq DNA polym era se WANG T ian 2yun 1,Q IN Chuan 2,YANG Ru i 2,et a l(1.De par t m ent of B ioche m istry and M olecular B iology ,Xinxi a ng M edica l College ,X i nxiang 453003,China;bora tory o f M o 2lecul a r B iology ,X inxi a ng M e d ica l C ollege ,Xinxi a ng 453003,Chi na )Abstr ac t : Ob jec ti ve To prepa re reco m bi nant Taq DNA poly m erase for PCR.M e thods Taq DNA poly m erase was ex 2pressed i n reco mb i nant E .coli stra i n under i sopro py 2B 2D 2thiogalactoside(IPTG)inductio n for 12h ,d isrupted w i th l ysozy m e and NP 40,follo wed d i a l yzed a t 4e .Purificati on and activiti es of pol y m erase were analyzed under sodi u m dodecyl su lfate pol yacryl 2am ide gel electropheres i s (SDS 2PAGE)and pol y me rase cha i n reac ti on(PCR )m e t hods .R esults The prepared pol y m erase pur i 2fi catio n and acti vities could co mpare with the same product can be used to amp lify the DN A frag m ent .C onc l u sion The pre 2pared m e t hods of reco m binant Taq D NA poly m erase i n our laboratory are si m ple and rap i d l y .K ey word s : Taq D NA poly m erase ;gene engi neer i ng ;separa ti on and pur ifi catio n自从1985年Mu llis [1]提出聚合酶链式反应(pol y m erase chai n reaction,PCR )以来,PCR 技术发展十分迅速,并被广泛应用于生物学、医学等相关学科领域。
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1、BufferA:
20ml 0.5M Tris（8.0）
1.9817g 葡萄糖
0.4ml 0.5M EDTA（8.0）
定容至200ml
2、Pre-lysis Buffer:
200mg 溶菌酶+50ml BufferA 定容至50ml
3、Lysisi Buffer：
2ml 0.5M Tris（8.0）
0.2ml 0.5M EDTA(8.0)
0.5ml Tween20
372.5mg KCl
17.4mg PMSF(苯甲基磺酰胺) （用的时候再加）
将以上药品定容至100ml
4、Storage Buffer
5ml 1M Tris(7.4)
0.02ml 0.5M EDTA (8.0)
0.154ml 0.648M DTT (100mg/ml DTT=0.648M) (DTT:二硫苏糖醇) 0.3725g KCl
50ml 甘油
将以上药品定容至100ml
4、Dialysis Buffer （2L）
100ml 1M Tris（8.0）
0.4ml 0.5M EDTA (8.0)
2.08ml 0.648M DTT
1.6ml 0.5M PMSF (0.1394g) （用的时候再加）
7.45g KCl
1L甘油
将以上药品定容至2L
具体步骤：
1、划线过夜
2、单菌落试管过夜（4ml）
3、加20ul到6ml LB试管中，37O C ,200rpm，7.5h
4、加100ul到500ml LB，200rpm ，5.5h，测OD600=0.45
5、加2.6ml IPTG（→125mg/L），37O C ,200rpm，14h
6、菌液5000rpm，10min
7、向沉淀中加大于50ml Buffer A，涡旋，5000rpm，10min
8、沉淀加25ml Pre—lysis Buffer 重悬，RT 15min
9、加25ml Lysis Buffer ，75 O C,80min
10、15000rpm，10min ，收集上清
11、上清加约15g （NH4）2SO4，混合5min，15000rpm ，10min，弃上清
12、向沉淀中加入20ml storge buffer ，透析2d，换四次透析液
13、分装
由于我们的50ml离心管装不了50ml，实验操作中的试剂用量我是按比例缩小了。