第三章 酶制剂的发酵(培养)生产
发酵学 第3章 培养基
3.粘度适中，具有适当的渗透压
4. 主产物合成达到最高速率，发酵后所形成的副产物尽可 能的少。
5.生产过程中既不影响通气与搅拌的效果，又不影响或少 影响产物的分离精制和废物处理。
6.大规模生产时要考虑材料的成本。
第二节
培养基的成分
碳源 氮源 无机离子 生长因子 前体 促进剂和抑制剂
水分
一、碳源
凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物 质均称为碳源。它既是构成菌体细胞和代谢产物的主要元 素，又是提供微生物生命活动中所需能源的原料。
维生素B12 钴化物
青霉素V 苯氧乙酸
链霉素 金霉素色氨酸 Nhomakorabea吲哚、氨茴酸
2-羟基-4-甲基硫代丁 酸 D-苏氨酸
肌醇、精氨酸等 蛋氨酸 氯化物等 异亮氨酸
红霉素
丙酸、丙醇等
苏氨酸
高丝氨酸
灰黄霉素 氯化物
六、产物促进剂
所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物， 又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
一些维生素生长因子及其生理功能
维生素 生理功能 维生素B1（硫胺素） 脱羧酶辅酶，与酮基转移有关 维生素B2（核黄素） 构成黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸， 作为电子传递链中的递H体 维生素B3（泛酸） 维生素B5（烟酸） 辅酶A（CoA）的前体物质之一，递酰基体， 是细胞内多种酶的辅酶 又称尼克酸，是辅酶I，辅酶II的前体，参与 细胞内很多氧化还原反应
促进剂提高产量的机制：
有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。
发酵培养基及制备
同理，可以计算并确定B3、C3、D1分别为B、 C、D因素的优水平。四个因素的优水平组合 A2B3C3D1为本试验的最优水平组合，即酶法 液化生产山楂清汁的最优工艺条件为加水量 50mL/100g，加酶量7mL/100g，酶解 温度为50℃,酶解时间为1.5h。
• 根据生产实践和科学试验的不同要求选择 • 根据经济效益分析选择培养基
–价廉、来源Βιβλιοθήκη 富、运输方便、就地取材、无毒二、发酵培养基成分选择的原则
• 不同的微生物所需要的培养基成分是不同 的，要确定一个合适的培养基，就需要了 解生产根据不同生产菌种的培养条件、生 物合成的代谢途径、代谢产物的化学性质 等确定培养基。
3
2
1
3
2
1
3
18
3
3
2
1
42
不考察交互作用的试验结果分析
（1） 确定试验因素的优水平和最优水平组合
分析A因素各水平对试验指标的影响。由表3可以看出，A1 的影响反映在第1、2、3号试验中，A2的影响反映在第4、5、 6号试验中，A3的影响反映在第7、8、9号试验中。
A因素的1水平所对应的试验指标之和为
度。Rj越大，说明该因素对试验指
标判的断影因响素越的大主。次根顺据 序。Rj大1小. ，计可算以
Kjm，kjm
极差分析法－R法
Rj 因素主次
2. 判断 优水平
优组合
试验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9
因素
液化率
A
B
C
D
％
1
1
1
1
0
1
2
2
第三章 酶的生物合成
溶氧量过低，会对微生物生长、繁殖和新陈代 谢产生影响，从而使酶产量降低。但，过高的 溶氧量对酶的发酵生产业会产生不利影响，一 方面会造成浪费，另一方面高溶氧也会抑制某 些酶的生物合成，因此在整个发酵过程中应根 据需要控制好溶氧量。.
酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节， 在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的 调节控制机制，其中，转录水平的调控占主 导地位，是酶生物合成中最重要的调节
.
操纵子
操纵子（operon）是一组功能上相关且受同 一调控区控制的基因组成的遗传单位
操纵子是酶合成调控的结构基础
.
操纵子调控模型
根据基因调节理论，在 DNA 分子中，与酶的生物 合成有密切关系的基因有 4 种。它们是调节基因 （regulator gene）、启动基因（promoter gene）、 操纵基因（operator gene）和结构基因（structural gene）。
蛋白酶
. 皮革脱毛
酶发酵生产菌种要求
产酶量高，具有生产应用价值 易培养，既能适应大生产粗放的营养和生产条
件，包括能利用廉价原料、对工艺条件要求不 苛刻 代谢速率高，发酵周期短 产酶稳定性好，菌种的生产性能不易退化，不 易感染噬菌体 安全可靠，要求菌种不是致病菌，其代谢物安 全无毒，在系统发育上与病原体无关 选用产胞外酶菌种，有. 利于酶的分离提取
.
发酵条件控制及对产酶的影响
温度：影响微生物生长和合成酶、影响酶合成 后的稳定性
pH:影响微生物体内各种酶活性，从而导致微生 物代谢途径发生变化；影响微生物形态和细胞 膜通的透性，从而影响微生物对培养基中营养 成分的吸收以及代谢产物的分泌；影响培养基 中某些营养物质的分解或中间产物的解离，从 而影响微生物对这些营养物质的利用
酶制剂生产工艺
酶制剂生产工艺
酶制剂生产工艺是指将酶通过一系列的工艺步骤进行提取、纯化、稳定化等处理，最终获得符合质量标准的酶制剂产品的过程。
酶制剂生产工艺的主要步骤如下：
1. 酶源筛选与培养：选择适合的菌株或真菌菌种作为酶源，通过培养与繁殖，获得大量的酶产生菌株。
2. 发酵过程：将酶源加入培养基中，进行发酵过程。
通过调节发酵条件，如温度、pH值、氧气供应等，使酶产量达到最大化。
3. 酶提取：将发酵液进行分离，分离出含有酶的液体部分。
常用的方法有离心、过滤、沉淀等。
通过这些方法可以去除酶产生菌株和不溶性杂质。
4. 酶溶解：将分离得到的含有酶的液体溶解在适当的溶液中，使酶能够更好地活性。
5. 酶纯化：通过一系列的纯化工艺步骤，如沉淀、离子交换、凝胶过滤、超滤等，去除酶中的杂质，使酶获得更高的纯度。
6. 酶稳定化：对于易受到温度、pH值、湿度等环境条件影响的酶来说，需要进行稳定化处理。
常用的稳定化方法包括冷冻干燥、喷雾干燥、添加保护剂等。
7. 储存与包装：将纯化稳定化后的酶制剂进行储存和包装。
通常要求酶制剂能够在常温下长期保存，并保持较好的活性。
8. 质量控制：对酶制剂进行质量控制，包括活性测定、含水量测定、纯度测定等，确保酶制剂符合相关质量标准。
以上就是酶制剂生产工艺的主要步骤。
不同的酶制剂可能会有一些微小的差别，但总体而言，工艺流程是相似的。
通过这些工艺步骤，可以有效地提高酶制剂的产量、纯度和稳定性，为酶制剂的应用提供有力的支撑。
酶制剂发酵工艺
3、霉菌
黑曲霉：糖化酶、α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡 萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。
米曲霉：氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。 红曲霉：α -淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。 青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶 等。 木霉：纤维素酶。 根霉：糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶，脂肪酶、果胶酶、 纤维素酶、半纤维素酶等。 毛霉：蛋白酶、糖化酶、α -淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、 凝乳酶等。
在外界环境因素诱导下合成速 度急增，酶浓度成百上千倍增 加
酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏
1、酶合成的诱导作用
加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为 诱导作用。
诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。
例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导a-淀粉酶的合成
2、酶合成的阻遏
（1）终产物阻遏
[ 麸皮等原料 ] ↓
[ 配制培养基] (灭菌)
[ 发酵池(固体发酵) ]
[ 成品曲 ]
{固体粗酶制剂}
酶发酵生产的一般工艺流程图
保藏菌种
试管斜面培养（活化）
培养基
摇瓶扩大培养 种子罐培养 发酵罐
无菌空气
分离纯化
酶
二、酶生产菌种
（一）产酶菌种的要求
（1）产酶量高； （2）繁殖快，发酵周期短； （3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染； （4）能够利用廉价原料，容易培养和管理；
A2 ×E B2
第三节 微生物发酵产酶工艺条件及控制
发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种提供适当的营养 和生长环境，使生产菌大量增殖，同时合成所需要的酶，然后 由发酵所得物料制成酶产品。
现代酶制剂的大规模生产以深层液体发酵法为主。
酶制剂生产工艺流程
酶制剂生产工艺流程酶制剂是一种由酶制备的药物，被广泛应用于医药、食品、化学工业等领域。
酶制剂的生产工艺流程主要包括五个步骤：原料准备、酶发酵、分离和纯化、干燥和包装。
首先，原料准备是酶制剂生产的第一步。
原料主要包括基础培养基、基因工程菌株和辅助物质。
基础培养基是酶发酵的基础，其中包含有机氮源、碳源、无机盐等成分，其他还需要加入一些辅助物质如缓冲剂、抗泡剂等。
基因工程菌株是通过基因重组技术构建的，用于产生目标酶。
辅助物质是为了提高发酵的效果和酶的稳定性。
第二步是酶发酵。
将准备好的基础培养基中添加基因工程菌株，并进行培养。
培养条件包括温度、pH值和气氛等。
通常情况下，酶发酵一般分为激活阶段、生长阶段和酶合成阶段。
在激活阶段，菌株将从冷冻状态中恢复活性。
在生长阶段，菌株将进行繁殖，并伴随有机物的消耗和产生。
在酶合成阶段，酶的合成量开始增加。
整个发酵过程需要严格控制各个参数，以确保酶的产量和质量。
第三步是分离和纯化。
将发酵后的培养液通过离心、过滤等分离方法，将酶分离出来。
之后，通过流动层析、离子交换等纯化方法，除去杂质，得到纯净的酶制剂。
分离和纯化过程中需要选择合适的材料和工艺条件，以确保酶的活性和稳定性。
第四步是干燥。
将纯化后的酶制剂进行干燥处理，以去除水分，防止酶的降解和微生物的污染。
干燥方法主要有喷雾干燥、冷冻干燥等。
选择适当的干燥方法可以减少酶的损失并提高产量。
最后一步是包装。
将干燥后的酶制剂进行包装，通常采用密封、无菌的包装方式，以确保酶的稳定性和长期保存。
综上所述，酶制剂的生产工艺流程主要包括原料准备、酶发酵、分离和纯化、干燥和包装等五个步骤。
每个步骤都需要严格控制各项参数，以确保酶制剂的产量和质量。
同时，工艺流程中的每个环节都需要选择适当的材料和工艺条件，以确保酶的活性和稳定性。
酶制剂工艺流程
酶制剂工艺流程酶制剂是一种通过使用酶来改变或促进化学反应的生物催化剂。
酶制剂工艺流程是将酶的生产和提取过程进行规范化和系统化的操作。
下面将以某酶制剂工艺流程为例，介绍其主要步骤。
首先是酶的生产阶段。
该阶段主要包括菌种培养、发酵和提取。
首先，选择适合酶生产的菌种，并通过接种在培养基中进行培养，以获得大量的菌体。
然后，将培养基转移到发酵罐中，进行大规模的发酵。
发酵过程中，需要控制好温度、pH值、氧气供应等因素，以促进菌体生长和酶的产生。
发酵结束后，通过离心等方法将发酵液分离，得到含有目标酶的菌体或酶液。
最后，在适当的条件下对菌体或酶液进行破碎或纯化，得到纯净的酶制剂。
第二是酶制剂的固化阶段。
将获得的纯酶与载体材料混合，并经适当处理形成固定化的酶制剂。
固化酶制剂可以提高酶的稳定性、重复使用性和操作性能。
固化过程可以采用物理固定化（如吸附固定化、包埋固定化等）或化学固定化（如共价结合、交联固定化等）的方法。
固定化后的酶制剂可用于工业生产或实验室研究等领域。
最后是酶制剂的应用阶段。
根据实际需要，将制备好的酶制剂应用于不同的领域。
酶制剂广泛应用于食品工业、医药工业、环境保护等领域。
具体应用可以包括食品加工中的蛋白酶、液体洗涤剂中的葡糖苷酶等。
应用过程中，需要根据具体情况进行调整和优化，以达到最佳效果。
总结起来，酶制剂工艺流程主要包括酶的生产、固化和应用三个环节。
通过科学规范的操作和精细的控制，可以获得高效、低成本的酶制剂，并应用于各个领域，实现生产、研究和环境保护等方面的目标。
随着酶工程和生物加工技术的不断发展，酶制剂工艺流程也在不断完善，为酶制剂的开发和应用提供更多的可能性。
第三章发酵工业原料及其处理
（3）无机盐
• 无机盐对菌体生长和产物合成有重要影响， 是发酵培养基的必须成分之一。
• 磷对微生物生长有明显促进作用； • 在青霉素和头孢菌素的发酵培养基中必须加
入硫源； • Mg、Zn、Co、Cu、Mn等微量元素是某些酶
• 发酵培养基中某些成分的加入有利于调节 产物的形成，而并不促进微生物的生长， 这些物质包括前体、促进剂和抑制剂。
前体
• 指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被
微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，
而其自身的结构没有多大的变化，但产物的产
量却因加入前体而有较大的提高。 • 如：在青霉素生产中加入玉米浆，青霉素产
• 优点：设备要求简单，水解时间短（20min）， 设备生产能力大
• 缺点：高温高压下进行，设备要求耐腐蚀、耐 高温、耐高压，副反应多，对原料要求严格， 淀粉颗粒不宜过大，淀粉乳浓度不能过高。
淀粉酸水解的工艺流程
中和脱色
水 淀粉
冷却
调浆
盐酸
酸水解
过滤除杂
糖液
1.酸的种类和用量：
• 盐酸：催化效能为 100 • 硫酸：催化效能为 50.35 • 草酸: 催化效能为 20.45 • 一般用盐酸，其量占干淀粉的 0.6-0.7%，
• 在酶法糖化时， -淀粉酶很难进入 老化淀粉的结晶区起作用，使淀粉 很难液化，因此，必须采取相应的 措施控制糊化淀粉的老化。
2.糖化酶的水解作用
• 糖化酶对底物作用从非还原末端开始将 -1, 4 和 -1, 6糖苷键水解，也能水解麦芽糖。
• 必须控制糖化酶的用量和液化液DE值。 • 糖化的温度和pH值决定于所用的糖化剂的性
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三、酶发酵生产的类型 1、液体深层发酵：
液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件 下发酵。
2、固体培养发酵
培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌 株，在一定条件下发酵。
3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）
将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。
翻译水平的调节
翻译产物的加工调节
分泌或定位
酶降解调节
胞内
胞外
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
二、酶生物合成的调节
按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类：
组成酶— 恒定（速度、浓度）
内因调控（遗传物质）
诱导酶— 诱导环境，酶合成速度、浓度激增
（适应型酶、调节型酶）
内因调控（基因结构） 外因调控（诱导物）
细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合
成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了
菌体生长的经济原则:不需要就不合成。 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
无活性阻遏蛋白
阻遏蛋白(无活性)
阻 遏
无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂
第三章 酶制剂的发酵（培养）生产
本章主要内容： 酶生物合成的基本理论； 发酵产酶的工艺条件及控制； 酶发酵动力学； 动植物酶的生产。
重点： 酶生物合成的基本理论； 微生物发酵产酶工艺。
难点：
酶生物合成的诱导和阻遏；
发酵过程细胞生长与酶合成之 间的关系。
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
B.有活性阻遏蛋白加诱导剂
诱导物
C.无活性阻遏蛋白
mRNA 酶蛋白
诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起 到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达
阻遏蛋白(无活性)
D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂
mRNA 酶蛋白 阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达
代谢产物
代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋 白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
基因操纵子调节系统示意图
调节基因 转录
操纵子
控制区
信息区
启动基因 操纵基因 RNA聚合酶
结构基因
DNA
（-）
（+） 转录
翻译
mRNA
阻遏蛋白
诱导剂
翻译 蛋白质
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
(二) 酶合成调节的类型
1.诱导 (induction)
组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比
调控方式
阻遏蛋白
添加物
与操纵基 因结合
4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
第一节 概述-酶合成的诱导和阻遏 一、酶生物合成的基本过程
DNA 转录 RNA 翻译 蛋白质（新生多肽链）
酶合成的 调节控制
转录水平的调节 ：基因调控加工
转录产物的加工调节成熟蛋白质（酶）
mRNA 酶蛋白 阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达
代谢产物
代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白 能够阻挡操纵基因,结构基因不表达
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
酶
的
诱
诱 导
导
和
阻
遏
操
纵
子阻 模遏
型
调节基因
启动基因 操纵基因
结构基因
阻遏蛋白 (有活性)
A.有活性阻遏蛋白
阻遏蛋白阻挡操纵基因 结构基因不表达
物而临时合成的一类酶。
2.阻遏 (repression)
分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏(feedback repression)
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1. 酶合成的诱导
加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。
实验现象： （1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上，细胞内无乳糖酶合成； （2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有乳糖酶合成； （3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
二、应用微生物来开发酶的优点 1、微生物种类多，酶种丰富； 2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶； 3、微生物培养基来源广泛，价格便宜； 4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程； 5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选 育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
（一）基因调控理论 —操纵子学说
1960年，Jocob&Monod 提出操纵子学说
操纵子——基因表达的协同单位
操纵子
结构基因（编码蛋白质, structural gene, S）
控制部位
操纵基因（operator gene, O） 启动子（promotor gene, P）
-半乳糖苷酶 -半乳糖苷透过酶 硫代半乳糖苷转乙酰酶
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
诱 导
调节 基因
R
mRNA
启 动 操纵 子 基因
PO
LacZ
乳糖结构基因 LacY Laca
基因关闭
阻遏蛋白 （有活性）
A乳糖操纵子的结构
调节 基因 R
mRNA 乳糖
阻遏蛋白 （有活性）
启 动 操纵 子 基因
酶的生产方法
一、酶的生产方法 1、提取法
牛胃—凝乳酶 胰脏—胰酶 血液—凝血酶 木瓜—木瓜蛋白酶
采用各种技术，直接从动、植物细胞或组织中将
酶提取出来。提取法虽简单易行，但受原材料来源的 限制。
2、化学合成法
是20世纪60年代中期出现的新技术。
只能合成那些已知化ຫໍສະໝຸດ 结构的酶；成本比较高。目前仍然停留在实验室内合成的阶段。
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、微生物发酵法 是20世纪50年代以来生产酶的主要方法。 利用微生物细胞的生命活动合成所需酶的方法称
为发酵法。 酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。 经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞
（包括微生物细胞、动植物细胞）的生命活动， 产生人们所需的酶的过程，称为酶的发酵生产。
PO
LacZ
乳糖结构基因
LacY
Laca
阻遏蛋白 （无活性）
mRNAZ mRNAY mRNAa
基 因
表
达
B、乳糖酶武汉的生物诱工程导学院生物工程系酶工程教研室
2.末端产物阻遏
由某代谢途径末端产物的过 量累积引起的阻遏
A→×E → →→ →B
实验现象： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到