第三章 发酵培养基的制备及灭菌

氨基酸 丝氨酸 苏氨酸
O CH CH3
菌株 嗜甘油棒状杆菌 谷氨酸小球菌
前体物质 甘氨酸 高丝氨酸
OH
＋ NaHSO3
HO
C CH3
OSO2Na
2ADP 2ATP 2ADP 葡萄糖 1.6-二磷酸果糖 3-磷酸甘油醛
2ATP 丙酮酸
NaHSO3 乙醛 Pi 甘油 H 2O 加成物
NAD NADH +H 磷酸二羟丙酮 α-磷酸甘油
配制培养基时注意： （ 1 ） CaCO3 要待培养基 pH 调好后在加入， 将 pH调到中性， CaCO3 起作用，在酸性中， 碳酸钙则失去作用。 （ 2）培养基中钙盐过多时，会引起磷酸钙 沉淀，降低了培养基中可溶性P的含量，因 此，当培养基中磷和钙均要求较高浓度时， 可将二者分别灭菌或逐步补加。 （3）轻质碳酸钙和重质碳酸钙两种规格， 控制其中氧化钙等。
NADH +H NAD
前体物质一般说来，少加可提高产 量，但浓度不可过高，因为：
1、前体物质对产生菌有毒性，不应多加 。 2、微生物对前体有氧化（解毒）作用 ，高浓度时 将其氧化而不能进入产物。因此，多加，不仅成本 高，且无作用。 由于这两个原因，前体与加入应采用少量 多次 或连续滴加（流加），以避免前体物质浓度过大。 如：在青霉素发酵中分5－8次分批加入。
1、Fe
作用：铁是细胞色素细胞色素氧化酶和过氧化 氢酶的组成部分，因此是菌体有氧代谢不可缺 少的元素。 铁对谷氨酸菌有促进生长作用，但培养基中的 铁含量过高，会使发酵单位降低。 在抗生素生产中，培养基中铁含量过高，可能 会抑制抗生素合成。如：
青霉素：培养基中Fe2＋含量 6ug/ml 无影响 60 ug /ml 降低30％ 300 ug /ml 降低90％ 链霉素：铁对灰色链霉菌的生长影响较 小但对其合成影响较大，浓度增大，显著 抑制链合成，其最适浓度为1－2ppm 除 Fe2＋ 的 方法：对于新制或搁置多日的 铁罐须先用 硫酸氨 或 稀硫酸 洗涤后，再以 不接种的培养基空转几天，进行预处理， 以消除Fe2+的影响，然后再投入正式生产， 有条件的单位可采用不锈钢罐。
花生饼
黄豆饼
菜籽饼
棉籽粕
缺点：大多为天然原料加工制作的天然化合物， 成分比较复杂不稳定。产地不同、加工方法不 同和储存时间等都会影响发酵水平。 如抗生素生产：（麦白霉素）黄豆饼粉质量 要求：黄色粉末霉变虫蛀（热榨） 。
四、无机盐及微量元素：
作用： 微量元素常作为一些酶的辅基或激活剂。如 Mg、S 、P、 Fe、 K、 Na、 Mn、 Co、 Zn 等。
酰胺酶活力 N－甲基乙酰胺（非基质、诱导物）
乙酰胺 （基质、诱导物） 酰胺诱导物浓度（mm）
②另一类是产物而非基质为酶的诱导物。
酶 葡萄糖淀粉酶 淀粉酶 葡聚碳酶 微生物 黑曲霉 基质 淀粉 产物诱导物 麦芽糖 异麦芽糖 麦芽 糊精 异麦芽糖
嗜热芽孢杆菌 淀粉 青霉菌 葡聚糖
(2)、抑制剂
添加到发酵液中可增加所需代谢产物的浓度 而抑制副产物的产生 。 例1：四环素发酵采用金色链霉菌 通过添加溴化物竞争性抑氯剂和其它抑氯剂 （巯基抑氯剂、M-促进剂）,抑制氯原子进入四 环素的分子结构中，而使7-氯四环素（金霉素， 氯化物为金霉素合成的前体）产量减到最少， 提高四环素产量。
三、氮源
作用： 构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质， 核酸）和含N代谢物的组分（如含N抗生素， 青霉素）。 常用N源可分为二类： （1） 无机氮源 （2） 有机氮源
1、 无机氮源：
如：氨水，硫酸氨，NaNO3、NH4NO3等 优点：无机N成分稳定，引起生产波动性 小，易吸收。利用快，而蛋白质利用时需 蛋白酶分解成氨基酸后再行利用，在抗生 素生产中无机氮源常作为辅助氮源。 缺点：有些无机氮源利用过程中会使培养 基的pH发生变化。既可以引起pH上升， 也可以引起pH下降。如：
2、 P
作用: 磷酸盐是核酸，核蛋白等重要细胞物 质的组成部分，在糖代谢磷酸化中也需要 P（为高能磷酸键的组成部分），在菌体 生长，繁殖和代谢活动中起着及其重要的 作用。 P含量的控制： 在抗生素生产中特别注意：
生长期： 微生物经糖代谢，产生大量菌丝， P有刺激生长作用。 生产期： 产物合成，此阶段 P 含量较低， 不易检测出，磷酸盐如何影响抗生素合成， 有大量文献报道（有关抗生素的生物合成 机制研究）。另外，谷氨酸合成中， P 过 高会抑制6－磷酸葡萄糖脱氢酶活性，使菌 体生长旺盛，而产酸很低。
例2：谷氨酸发酵中使用青霉素
以废糖蜜为原料时，若原料中生物素含量 很高，则无法直接利用（影响产物分泌）。 添加青霉素，可解除生物素过剩的影响而生 成谷氨酸。原因是青霉素使菌体细胞壁的生 物合成受阻，细胞壁失去了保护细胞膜的性 能，又由于膜内外渗透压差引起了二次膜的 变化，而使细胞膜受到机械损伤，失去渗透 障碍物，遂使谷氨酸排出。
2、有机氮源
如：黄豆饼粉，酵母粉，鱼粉，棉籽饼 粉，蛋白胨等。 特点：营养丰富，除含丰富的蛋白胨外， 还含许多游离氨基酸，这些氨基酸直接被 微生物所利用，另外还有一些多肽，生长 素等。有些氨基酸还可作为产物的组成。 如：青霉素，头孢菌素的合成前体α－ 氨基己二酸、半胱氨酸，缬氨酸，使用氮 源的目的除供给菌体生长繁殖的营养外， 还为抗生素合成提供前体物质。
第三节 淀粉水解糖的制备
发酵工业中的生产菌种，有的不能直接利用淀 粉，而只能利用糖类进行发酵，如谷氨酸、啤酒、 酒精生产，必须先将淀粉质原料，如大米，小麦 等制成淀粉水解液（糖），才能供发酵用。即淀 粉水解糖的制备。这成为许多发酵工厂必不可少 的一道生产工序。
（3）、表面活性剂
如：吐温-80（Tween80）等，起分散剂作用， 改善发酵液的传质条件。又如新洁尔灭，在低 浓度时对菌体分散有利。
（4）、缓冲剂
控制培养基的pH，特别是在有机酸发酵中， 产物为酸（如乳酸等），添加CaCO3作为pH缓 冲剂。
（5）、消泡剂
发酵培养基中含丰富的蛋白质，加之通气， 搅拌，因而产生大量泡沫。泡沫过多，一方面 容易造成逃液，另一方面增加染菌机会。因此 培养基中须加消泡剂。加入方式有两种： ① 基础料中添加，防止前期产生泡沫。 ② 有些菌对油敏感，亦可在产生泡沫时加。由 于消泡剂对氧的传递有阻碍作用，故应尽量少 加。
二、碳 源
作用： 用来供给菌种生命活动所需的能量， 构成菌体细胞及代谢产物的 C 架来源。是 培养基中的主要组分之一。 常用的碳源主要有三类： A、 糖类：葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，淀粉， 湖精，乳糖等。 B、脂肪和油 。 C、 有机酸及低碳醇类，烃类物质等其他 。
1、糖 类
如:葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，淀粉，湖精， 乳糖等。 由于微生物所含酶系统并不完全一，乳糖，糊精和淀 粉是霉菌和放线菌容易利用的C源，大部分 细菌不含淀粉酶，不能直接利用淀粉。
淀粉 淀粉酶 液化 糖化酶 葡萄糖
由于大多数细菌，酵母不能直接利用 淀粉，生产中增加－制糖过程，如： 北京棒状杆菌发酵生产味精大米→淀粉 蕃薯淀粉（鲜蕃薯或蕃薯干）→葡萄糖 链霉菌生产螺旋霉素：复合C源→淀粉 ＋葡萄糖
2、脂肪和油
霉菌和放线菌除糖外还可利用油和脂肪 作为C源，因其含脂肪酶。利用过程：
(NH4)2SO4 → 2NH3 + H2SO4 NH3 通过转氨作用被利用，使发酵液 中不存在NH3 生理酸性物质：在微生物作用下，体现 出酸性的无机盐类。 NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH 先还原硝基氮为氨，再利用 生理碱性物质：代谢后能产生碱性物 质的盐类。 所以(NH4)2SO4 ，NaNO3 既可用作氮源， 又可用于调节pH。
第一节
培养基成分
水 碳 源
培养基的五大要素
氮 源 生长因子 无机盐
一、水：
作用： （1）水是组成微生物细胞的主要成分（约 占78％）其余为蛋白质，核酸，脂肪等。 （2）水还是发酵过程中所有生化反应的溶 剂，营养及O2（DO）的吸收，废物的 排泄等均通过水来进行。 （3）分泌的产物也在水相中。水的多少， 影响到传质。
2、代谢调节剂
（1)、促进剂
既不是营养，也不是前体，但加入后可明 显提高产量的物质。例：
L-甲硫氨酸 β－巴比妥
头孢菌素 利福霉素
促进剂在酶制剂生产中用得较广泛，许多酶为 诱导酶，另外为组成酶。酶的诱导物常见有两类：
①、酶的基质（底物）及基质（底物）的结构类似物
酶 β-半乳糖苷酶 纤维素酶 Try酶 青霉素-β-内酰胺酶 葡萄糖氧化酶 基质 类似诱导物 乳糖 异丙基-β-D-硫半乳糖苷 纤维素 2－葡萄糖-β-葡萄糖苷 L－Try D-Try D-苯丙氨酸 苄青霉素 甲霉素 葡萄糖 α-甲基-D-葡萄糖
良好的培养基应该满足下列要求：
1、营养丰富，配比合理：营养全（C、N、 无机盐、生长因子），且比例适当，特别 是C/N. 2、利于产物提取（丰产不丰收，拿不到产 品，利于提炼工艺的收率质量如：残糖低， 油量少，减少乳化，粘度，色素。 3、理化性质稳定：指培养基的各个组分。 4、来源丰富，价格低影响到生产成本。
油脂 脂肪酶 甘油 ＋ 脂肪酸
β-氧化过程分解
有氧代谢
1分子脂肪酸
129个ATP
在某些抗生素（链霉素，青霉素、土霉 素）发酵中，完全用脂肪代替糖，发酵单 位并不比含糖培养基低 。发酵过程中加入 的油脂有消沫和补充C源双重作用。
3、 有机酸、低碳醇类及烃类物质
放线菌和霉菌对许多有机酸（如：乳酸，琥珀 酸，乙酸等）氧化能力很强，有机酸氧化产生能 量可供给菌体使用。石油发酵微生物可利用甲醇 （生产SCP的主要C源），有些菌利用14－18C 烃类物质合成产物。 有机酸及其盐作碳源，同时调节发酵过程中 pH易引起pH升高 。 一般使用有机酸盐，其氧化产生碱性物质： CH3COONa + 2O2 → 2CO2 + H2O + NaOH