流式细胞仪(Flow Cytometer)基础简介
流式细胞术基础知识
讲者：***
目录
1、流式细胞术基本定义 2、流式细胞仪介绍 3、荧光染料介绍 4、不同型号流式细胞仪简介 5、流式细胞仪应用
流式细胞术定义
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、 准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多 项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选
淋巴细胞亚群分析可以了解机体在不同条件下的免疫功能 状态，主要包括细胞免疫功能和体液免疫功能。在临床上，主要用 于对免疫系统造成明显干扰的相关疾病的辅助诊断，分析疾病的发 病机理，监控疾病的病程进展，观测疗效及监测预后等等。
流式细胞仪临床应用
临床意义 CD3+ CD3+ CD4+ CD3+ CD8+ CD4+ / CD8+ B细胞 NK细胞
FITC, PE,ECD,PC5 or PECy5.5,PE-Cy7
APC, APC-Cy7
国食药监械(进)字 2014第2403463号
FITC, PE,ECD,PC5 or PC5.5,PC7
红光:638nm 紫光：405nm
APC，APC-Cy5 or APCAlexa Fluor 700, APC-Cy7 or APCAlexa Fluor
谢谢！
部分演示内容来源于网络，如有侵权，请联系删除！谢谢！
APC, APC-Cy7
浙械注准 20192220121
流式细胞仪应用
临床研究
血液，肿瘤， 药理，免疫…
环境研究
湖泊，海洋 生态研究…
生物学研究
遗传，生殖， 微生物，细胞 生物，毒理， 分子生物…
食品制药工业
食品检测、药物筛 选，疫苗研究…
流式细胞分析仪
流式细胞分析仪流式细胞分析仪是一种高效、精确的生物学实验工具，广泛应用于细胞生物学、免疫学、遗传学等领域。
它的出现极大地促进了细胞研究的进展，为科学家们提供了更多的可能性。
本文将介绍流式细胞分析仪的原理、应用及其在生物科学研究中的重要性。
流式细胞分析仪（flow cytometer）是一种可以对细胞进行流式检测的仪器。
它通过检测光的散射和荧光来分析细胞的形态、大小、浓度和免疫表型等信息。
其原理主要是利用流式细胞术，将细胞通过细长的管道分流，并用激光或光源照射细胞，激发荧光信号并收集散射光信号，从而获得细胞的信息。
这种检测方法既高效又准确，可以同时分析数千个细胞。
而且，流式细胞分析仪具有高通量、高分辨率、快速、灵敏度高等优势，使其成为当前生物学研究中不可或缺的工具之一。
流式细胞分析仪广泛应用于细胞生物学研究。
例如，在肿瘤学研究中，通过流式细胞分析仪可以对肿瘤细胞进行快速、准确的鉴定和分类。
它可以检测肿瘤细胞的大小、形态、染色质含量以及免疫表型等特征，为研究人员提供了丰富的信息，有助于了解肿瘤细胞的发生和发展机制。
此外，流式细胞分析仪还可以用于研究细胞周期、细胞分化和凋亡等过程，为揭示细胞生物学的分子机制提供了有力的工具。
除了肿瘤学研究外，流式细胞分析仪在免疫学中也有重要的应用。
免疫表型是指细胞表面的免疫分子的表达情况。
通过流式细胞分析仪可以获得细胞的免疫表型信息，这有助于识别不同类型的免疫细胞并研究它们在免疫反应中的作用。
例如，在研究自身免疫性疾病时，可以利用流式细胞分析仪对免疫细胞进行免疫表型分析，了解其在疾病发生和发展过程中的变化，从而寻找潜在的治疗靶点。
此外，流式细胞分析仪还可用于细胞遗传学研究。
通过观察细胞的核酸含量和染色体结构等信息，可以识别不同类型的细胞，并对细胞的遗传变异进行分析。
例如，在遗传疾病研究中，可以利用流式细胞分析仪对细胞进行染色体异常的检测，对疾病相关的基因突变进行鉴定。
流式细胞仪原理及应用 简介
构造模式图
光学系统
流动室及液流驱动系统
激光光源及光束形成系统
1、 Fluidics Subsystem 流动室与液流驱动系统
• 流动室：核心部件，样品在此与激光相交； • 液流层流原理：鞘液（PBS或去离子水），使流动细胞拉开 距离，单个细胞通过； • 要求分辨率高的样品（DNA）应用低速：周期
分选指标：效率、纯度和得率
三、实验中注意事项
1、样品准备 1）原代细胞（骨髓、血液）；2）培养的细胞 单细胞悬液：上机前过膜 2、染色 1）荧光染料的选择：荧光强弱 2）多色搭配：激发光和发射光谱 3）染色条件：抗体浓度、冰上/4度，避光 4）同型对照，阴性对照，单阳管
非常用组合 • PE-texas red/PI PE • PE-Cy5 Percp-Cy5.5/Percp • PE-Cy5 APC
流式细胞术（Flow cytometry，FCM）
以流式细胞仪为主要工具，对处在快速直线流动状态中 的细胞或生物颗粒细胞的各种成分进行多参数、快速的和优势
特点:
单细胞，也能区分群体细胞 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、单细胞克隆等； 定量的 多参数测量和分析（散射光和荧光，可多达27色） 快速测量和分析（每秒可达1000-10000个细胞） 分选细胞的高纯度（可达99%）；
基本构造
1） Fluidics Subsystem ——保证细胞单个通过检测区 2）Optics Subsystem: excitation components ——使检测细胞发出继发荧光 Optics subsystem: collection components ——规范散射光、继发荧光 3）Electronics subsystem ——将光信号转化为电信号，使检测结果完 美的表达出来 4）Sorting subsystem ——保证细胞的分选功能
流式细胞仪
流式细胞仪的机型
1. 台式机 检测和分析 B.D. : FACSCalibur; LSRII; LSRI
2. 大型机 分选细胞 B.D. : FACSVantage ；FACSAria Beckman Coulter: MoFlo （DAKO）
荧光抗体的搭配
理论上，不同通道检测的参数可以同时进 行检测。但是如果进行3个荧光参数的检测， 尽可能的选择只需要调节一对参数之间的 补偿的荧光。 如，FL1+FL2+FL4; FL1+FL3+FL4; 注意：PE-Cy5和APC不能同时检测。
流式细胞仪的数据显示和分析
一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。 1．单参数数据显示和分析— 一维直方图
90 Degree Light Scatter
Laser
FALS Sensor
SSC 与入射光成 90 ° 的光，与 细胞内部复杂度 相关，颗粒密度
90LS Sensor
根据FSC/SSC可以将全血中的淋巴细胞，单核 细胞和粒细胞分开
荧光参数 自发荧光：未经荧光染色，细胞内部的荧
光分子经激光照射后发出的荧光信号。 自发荧光的细胞成分： 核黄素，细胞色素等。 死亡细胞的自发荧光较高 需要设置阴性对照。
F/P FITC, PerCP: 2-9; APC, PE: 1; PE-Cy7, APC-Cy7: 1, N;
抗原密度 高丰度抗原：任何荧光素；低丰度抗原：PE，APC
染色指数 自发荧光
高：APC； 低：FITC 非特异形结合
FcR; 荧光自身
直接标记
流式细胞仪
1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
目录* 1 原理* 2 流式细胞仪(flow cytometer)* 3 应用* 4 参见原理一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。
若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直在线（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。
当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。
这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。
前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度）。
可以检测的参数有：细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA（细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等）、RNA 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染）、蛋白质、细胞表面抗原（CD标记）、胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等）、核抗原、酶活性、pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)（定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化）、细胞存活能力、监测细胞电通透性、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽、各种组合（DNA/表面抗原等等）流式细胞仪(flow cytometer)流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。
现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。
自己总结：流式细胞仪的原理和用途
流式细胞仪（Flow Cytometry）1 流式细胞仪的概念及其发展历史1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。
流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。
流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。
其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。
1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。
1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。
其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。
近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。
宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。
这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。
由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。
此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。
流式细胞仪(检验仪器)
流式细胞仪flow cytometer;FCM定义：将流体喷射技术、激光技术、空气技术、γ射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器。
通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度，来快速分析颗粒的物理或化学性质，并可以对细胞进行分类收集，可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。
流式细胞仪流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。
它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。
多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。
也就是说，它的细节分辨率为零。
•查看精彩图册组成流式细胞仪主要由四部分组成。
它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。
上图为其结构示意图。
流动室和液流系统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。
设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。
样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。
为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。
由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。
流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
激光源和光学系统经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。
常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。
光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。
汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300～400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。
氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。
简介流式细胞仪
一、简介流式细胞仪（一）流式细胞仪概念流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒（如细菌）逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。
简言之，流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的高技术，FCM以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。
（二）原理待测样本的细胞悬液，在鞘液的包围和约束下，细胞排成单列高速由流动室喷嘴喷出，形成细胞液柱。
当液柱通过检测区，在入射的激光束照射下产生前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），它们分别反映细胞大小和颗粒度，根据这些特性可以将细胞分类。
经一种或几种特殊荧光标记的样本，在激光束的激发下所产生的特定荧光，可被光学系统检测并输送到计算机进行分析，得到细胞相应的各种特性。
（三）流式细胞仪检测的细胞特性细胞结构组成 细胞功能大小 细胞表面、胞浆、核特异性抗原粒度 细胞活性DNA、RNA含量 胞内细胞因子蛋白质含量 激素结合位点钙离子、pH值、膜电位 酶活性二、流式细胞仪的临床检验项目目前在国内最常见的临床应用有两大类：一为肿瘤细胞的DNA含量析； 另一为细胞表面的表型测定，包括淋巴细胞亚型分析、免疫功能监测、白血病和淋巴瘤免疫分型、残余白血病检测、以及HLA-B27组织抗原检测等等。
1、淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析可以通过相对计数、绝对计数与率的变化监控疾病状态下的免疫状况（如肿瘤、感染性疾病、免疫性疾病等），以此辅助诊断、追踪病情发展及决定用药时机。
检测原理：利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合多色荧光染料，即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。