流式细胞仪(Flow_Cytometer)基础简介
流式细胞术基础知识
讲者：***
目录
1、流式细胞术基本定义 2、流式细胞仪介绍 3、荧光染料介绍 4、不同型号流式细胞仪简介 5、流式细胞仪应用
流式细胞术定义
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、 准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多 项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选
淋巴细胞亚群分析可以了解机体在不同条件下的免疫功能 状态，主要包括细胞免疫功能和体液免疫功能。在临床上，主要用 于对免疫系统造成明显干扰的相关疾病的辅助诊断，分析疾病的发 病机理，监控疾病的病程进展，观测疗效及监测预后等等。
流式细胞仪临床应用
临床意义 CD3+ CD3+ CD4+ CD3+ CD8+ CD4+ / CD8+ B细胞 NK细胞
FITC, PE,ECD,PC5 or PECy5.5,PE-Cy7
APC, APC-Cy7
国食药监械(进)字 2014第2403463号
FITC, PE,ECD,PC5 or PC5.5,PC7
红光:638nm 紫光：405nm
APC，APC-Cy5 or APCAlexa Fluor 700, APC-Cy7 or APCAlexa Fluor
谢谢！
部分演示内容来源于网络，如有侵权，请联系删除！谢谢！
APC, APC-Cy7
浙械注准 20192220121
流式细胞仪应用
临床研究
血液，肿瘤， 药理，免疫…
环境研究
湖泊，海洋 生态研究…
生物学研究
遗传，生殖， 微生物，细胞 生物，毒理， 分子生物…
食品制药工业
食品检测、药物筛 选，疫苗研究…
1流式细胞仪基础知识介绍
FL2 1
2
3 4 FL1
FL
2
12
34
FL1
未补偿
补偿合适
补偿过度
谢谢！
谢谢！
48 53 58 0 50
48 53 58 0 50
530长 通
530短 通
48 53 58 0 50
530/30带通
电子系统 ✓ 主要作用：接收、处理光信号；将光信号转变为电信号，再将电信号数字化； ✓主要部件：光电二极管（PD)、光电倍增管（PMT）、信号处理板
信号检测原理
✓信号检测器
•光电二极管 无电流放大作用 信噪低
流式细胞仪的结构域原理 目 录
流式样本的前处理
流式数据的获取和分析
流式细胞仪实验流程
全血抗凝血 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋组织 体液
单细胞悬液
✓酶消化法 ✓机械法 ✓化学处理法
荧光抗体标记
上机检测
✓细胞膜抗原标记 ✓细胞浆抗原标记 ✓膜浆抗原同时标记 ✓单色标记 ✓多色标记
流式细胞仪的定义和分类
✓ 主要作用：数据分析、显示 ✓ 主要部件：电脑工作站
图 门 数据统计
•图—类型
直方图 密度图
三维立体图
散点图 等高线图
•图——坐标轴显示
线性
对数
线性坐标：将数据均匀的映射到各个像素点；一般用于显示FSC和SSC数据
对数坐标：数据做对数变换后均匀的映射到各个像素点 可以将大数据在坐标轴上压缩，小数据在坐标轴上拉伸 可用于阳性标定范围广、但阴性标定信号低，线性坐标不易于分辨的情况
光信号 单细胞悬液或生物 颗粒
分析速度高 多参数
精度高
当代最先进的细胞定量分析技 术
BD流式细胞仪全面介绍
Detector Parameter
FL1 FL2 FL3 FL4
Filter
530/30 585/42 670LP 661/16
FCM测量数据的显示与分析
几个概念： —%Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中
阳性细胞的数量。 —脉冲宽度（pulse width）表示细胞的粘连情
况 —脉冲面积（pulse area）主要用于DNA的含
流式细胞仪可检测到的细胞参数
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
= 前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积 = 侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相
对复杂性
前向角散射光 ——FSC
Laser
FALS Sensor
侧向角散射光——SSC
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
参与信号处理的光学元件
—光电倍增管（PMT），用来检测从细胞发出 的不同颜色的荧光信号
—双色反光镜，通过反射一定范围的光，透过其 余光来实现分离作用
—滤光片，能透过一定波长的光，但是没有反射 功能，放着角度是与光束成90度。
—散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态 上的差异
- 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的 数据
荧光信号
— 荧光强度（FL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发 射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。 – 有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳） – 高FL细胞与低FL细胞区分开来（强弱）
滤光片
Longpass
流式细胞仪及流式细胞术
流式细胞仪及流式细胞术流式细胞仪技术流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。
它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。
其优点如下：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
基本流程原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定的角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
2、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管接收。
散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数或固有参数，散射光有包括前向角散射和侧向叫散射，前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信号。
荧光信号也有两种，一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。
流式细胞仪
流式细胞仪的机型
1. 台式机 检测和分析 B.D. : FACSCalibur; LSRII; LSRI
2. 大型机 分选细胞 B.D. : FACSVantage ；FACSAria Beckman Coulter: MoFlo （DAKO）
荧光抗体的搭配
理论上，不同通道检测的参数可以同时进 行检测。但是如果进行3个荧光参数的检测， 尽可能的选择只需要调节一对参数之间的 补偿的荧光。 如，FL1+FL2+FL4; FL1+FL3+FL4; 注意：PE-Cy5和APC不能同时检测。
流式细胞仪的数据显示和分析
一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。 1．单参数数据显示和分析— 一维直方图
90 Degree Light Scatter
Laser
FALS Sensor
SSC 与入射光成 90 ° 的光，与 细胞内部复杂度 相关，颗粒密度
90LS Sensor
根据FSC/SSC可以将全血中的淋巴细胞，单核 细胞和粒细胞分开
荧光参数 自发荧光：未经荧光染色，细胞内部的荧
光分子经激光照射后发出的荧光信号。 自发荧光的细胞成分： 核黄素，细胞色素等。 死亡细胞的自发荧光较高 需要设置阴性对照。
F/P FITC, PerCP: 2-9; APC, PE: 1; PE-Cy7, APC-Cy7: 1, N;
抗原密度 高丰度抗原：任何荧光素；低丰度抗原：PE，APC
染色指数 自发荧光
高：APC； 低：FITC 非特异形结合
FcR; 荧光自身
直接标记
流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
FL1
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
常用荧光素
<499nm ：蓝色荧光（Blue）；
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
流式细胞仪(flowcytometer)基本原理
流式细胞仪(flowcytometer)基本原理，详细流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种用于细胞计数、细胞分类和细胞特性分析的重要实验室装置。
它能够快速地对成千上万的细胞进行分析，并且可以同时对多种细胞特性进行检测。
流式细胞仪的基本原理涉及到光学和流体力学的结合，这里是一个详细的解释：流体系统（Fluidics）流式细胞仪的流体系统负责将样本中的细胞悬液通过一个狭窄的管道（通常称为流室或喷嘴）输送，使细胞单个通过。
为了实现单个细胞的流动，采用了水力聚焦技术（hydrodynamic focusing），即使用一个不含细胞的剪切流（通常为盐溶液）将细胞流包围起来，迫使它们以单列的形式通过检测区。
光学系统（Optics）当细胞单个通过检测区时，流式细胞仪的光学系统开始发挥作用。
它通常包含一个或多个激光，激光束照射穿过流室的细胞。
细胞对光的散射和吸收会产生前向散射光（Forward Scatter, FSC）和侧向散射光（Side Scatter, SSC），分别与细胞的大小和内部复杂性（如颗粒性或结构）相关。
荧光检测（Fluorescence Detection）除了散射光，如果细胞被荧光标记，那么激光也会激发荧光染料，细胞将发出荧光信号。
不同的染料可以被激发并发出不同波长的荧光，这些荧光通过光学滤镜和分光器被检测，使得可以同时检测多个不同的荧光标记。
数据采集与分析（Data Acquisition and Analysis）每个通过检测区的细胞都会产生散射光和荧光信号，这些信号被光电管或光电倍增管（PMTs）检测，并转换为电信号。
这些电信号随后被数字化，并由计算机软件分析。
软件可以根据用户的需要进行细胞的分类、计数以及各种参数的量化，如细胞大小、颗粒性、荧光强度等。
通过流式细胞仪，研究人员可以进行多种分析，包括但不限于细胞周期分析、活细胞和死细胞的鉴别、细胞亚群的鉴定以及细胞内信号传导的研究。
流式细胞仪分类
流式细胞仪分类1. 简介流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种常用的生物学实验仪器，用于对细胞进行分类和分析。
它通过将细胞悬浮液注入仪器中，利用激光束照射细胞，测量细胞在不同参数上的散射和荧光信号，从而对细胞进行分类和计数。
流式细胞仪广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
2. 流式细胞仪的分类方式根据不同的参数和功能，流式细胞仪可以分为以下几种类型：2.1. 基础型流式细胞仪基础型流式细胞仪是最常见的类型，它可以测量细胞在不同波长的激光照射下的散射和荧光信号。
基础型流式细胞仪通常具有多个激光器和多个探测器，可以同时测量多个参数。
常见的参数包括细胞大小、形态、颜色、荧光标记物等。
2.2. 高通量流式细胞仪高通量流式细胞仪是一种能够快速处理大量样本的流式细胞仪。
它通常具有多个样本载体和多个样本接口，可以同时处理多个样本，提高实验效率。
高通量流式细胞仪广泛应用于大规模细胞筛选、细胞库构建和高通量药物筛选等领域。
2.3. 分选型流式细胞仪分选型流式细胞仪是一种能够根据细胞的特定特征进行分选的流式细胞仪。
它通常具有一个或多个分选器，可以根据预设的分选条件将特定类型的细胞分选出来。
分选型流式细胞仪广泛应用于细胞克隆、单细胞测序和细胞治疗等领域。
2.4. 成像型流式细胞仪成像型流式细胞仪是一种能够对细胞进行高分辨率成像的流式细胞仪。
它通常具有高倍率物镜和高灵敏度的相机，可以对细胞进行三维成像和时间序列成像。
成像型流式细胞仪广泛应用于细胞动力学研究、细胞迁移和细胞内信号传导等领域。
3. 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理包括激光照射、散射信号检测和荧光信号检测三个步骤。
3.1. 激光照射流式细胞仪通过激光器产生高能量的激光束，将激光束聚焦到细胞悬浮液中的单个细胞上。
激光束的波长和功率可以根据需要进行选择，常用的波长包括488nm、532nm和633nm等。
3.2. 散射信号检测当激光束照射到细胞上时，细胞会发生散射现象。
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●
FCM的定义
流式细胞仪是指，使细胞（或其 他粒子）以单个方式依次高速通过激 发光束，采集细胞被光照时产生的各 种信号，对信号进行处理，幵对各参 数进行关联分析的一种仪器。
对比
流式细胞仪是一种特殊的显微镜
流式细胞仪
流动的细胞
数量大 高速分选
显微镜
静止的细胞样本
数量少 样本难以再利用
细胞群体特征量分布
流式细胞仪（Flow Cytometer) 基础简介
中科院生物物理研究所 中国科学院蛋白质科学研究平台 2005年3月 刘春春
Hale Waihona Puke 主要内容
流式细胞仪概要 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪测量的对象
什么是流式细胞仪
●
流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
流式细胞仪基本结构
非荧光信号
颗粒度
细胞大小
散射光信号区分裂解后的外周血细胞群
荧光信号
荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色 荧光信号大小 被标记组分含量的定量
多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量
PI＋Annexin－V细胞凋亡检测
DNA 含 量 -PI Annexin-V
PE＋FITC荧光标记检测外周 血裂解后细胞群
光信号收集
光信号分离，导向，各探测通道PMT 接收幵转化为电信号。
激光束
侧向散射 光，荧光
1
二色镜 2
3
细胞
前向 散射 光
收集透镜
带通滤波片 光电倍增管
数据处理
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
脉冲处理，模数转换
（面积，峰高，宽度）
记录数据，显示结果
流式细胞仪产生的信号
侧向散射光(linear)
CD14 PE (log) 前向散射光 (linear) CD45 FITC (log)
R1=单核细胞 (CD14+ve) R2=淋巴细胞 (CD45>单核细胞) R3=中性粒细胞 (CD45<单核细胞)
细胞分选
流式细胞仪的测量对象
大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围：0.2uM-300uM。 对象类型 细胞类型： （1） 高等真核细胞； （2）酵母； （3）细菌； （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。
G1
G2
1 DNA含量
2
1
S
G2/M
细胞周期时相
染色体组型测定
2
1
白血病患者 1/3
4
5
3
Hoechst 33258 （AT）
6 X 13 8 Y 18 21 20 19 Ph 22
14 15 16 17
7 recip 9-22 9-12
Chromomycin A3
（GC）
生物物理所现有流式细胞仪
型号：BD FACSVantage SE 参数：分析10，000个/ 秒，分选7，000个/秒； 激光：488nm，UV；四 色荧光通道。 地点：1406 联系方式：电话 64839306 或 ： 64862503 电子邮件 lcc@
可以揭示细胞内部结构信息
流式细胞仪 多参数 量化的分布
蛋白胶 单参数 平均值
容易检测各个参数间的相关性
不容易
功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞；
（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
流式细胞仪能够检测的细胞属性和组分举例 1）不需染色： 大小，胞浆颗粒度，细胞自发荧光，色素，细胞精确计数。 2）需染色或标记： 细胞组分： 细胞膜：流动性，通透性，膜电位 细胞内离子：H+（可检测PH值），Na+，K+，Ca2+（结合的和 自由 的）。
核酸：DNA含量，DNA成分，DNA合成，RNA，染色质结构等
应用领域 疾病诊断 生物学基础研究 环境监测 海洋微生物研究 农业领域应用 等等
70年代美国为攻克癌症 而建造。 厂商：
Becton-Dickson
Coulter-Beckman DOCytomation
已成为一个几十亿美金 的产业
流式细胞仪工作原理
液流与光源
流动室
流体动力学聚焦
激光聚焦
探测光路聚焦
总蛋白质 蛋白质分子间相互作用 抗原 细胞骨架成分 受体
功能属性： 酶活性 细胞凋亡 细胞坏死 细胞活性 氢硫基 凝血素结合位点
经验之谈：凡细胞内能进 行荧光标记的成分或者某 种变化，都可用流式细胞 仪进行检测。
药物动力学 ……………………..
细胞数
细胞周期分析
G1 S phase M
DNA 含量 G0/1