贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍.
流式细胞仪原理深度讲解，文末赠书
流式细胞仪原理深度讲解，文末赠书流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。
它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。
一、流式细胞技术的应用1.其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2%以下；2.能准确地进行DNA倍体分析；3.借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；4.快速进行细胞分选和细胞收集；5.医学应用：免疫功能研究各种干细胞的检测，癌症病人的多药耐药性，细胞功能及代谢动力学研究，血小板分析（心血管疾病），流式细胞术与分子生物学研究；6 应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。
二、流式细胞仪的结构流式细胞仪（FCM）结构一般分为5部分：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学系统；信号检测、存贮、显示、分析系统；细胞分选系统。
01流动室及液流驱动系统流动室（Flow chamber）是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。
流动室充满鞘液，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等。
图：FCM的流动室和液流系统02激光光源与光束成形系统目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。
激光是一种相干光源，提供单波长、高强度、稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。
激光光束在达到流动室前，先经过透镜聚焦，形成稍大于细胞直径的光斑。
03光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。
在FCM的光学系统中主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成3类：长通滤片（long-pass filter，LP）、短通滤片（short-pass filter，SP）及带通滤片（band-pass filter，BP）。
长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。
美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪
美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪（Beckman coulter cell）产品型号：Cell Lab Quanta SC当前价格：0.00元产品数量：0新旧程度：全新有效期至：0000-00-00所在地：产品简介：仪器简介：T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；阵发性血红蛋白尿（PNH）检测的CD55、CD59；血小板无力症（GT）检测的CD41、CD61等等详细信息仪器简介：T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；阵发性血红蛋白尿（PNH）检测的CD55、CD59；血小板无力症（GT）检测的CD41、CD61等等。
但对于白血病/淋巴瘤免疫分型，国际上迄今为止也没有统一的抗体组合。
在2000年国际细胞分析学会（ISAC）大会上，临床血细胞计数协会组织了一次国际专家会议，以期对检测血液淋巴系统肿瘤所需最少、最有效的单抗数达成共识。
75%与会者一致认为，对于慢性淋巴系统增殖性疾病（CLD）有9种单抗：CD5,CD19,κ,λ,CD3,CD20,CD23,CD10,CD45对初诊来说是最基本的。
淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16种单抗。
对于急性白血病（AL），75%的与会者认为大约13-15种单抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO，CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，对初步鉴别白血病系列是必需的。
其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能对某些病例有用。
几乎所有的投票者都认为，要对急性白血病完善分类所需单抗的恰当数量平均为20-24种。
但这些抗体之间组合也是一大难题，目前也无统一规定（如表二）。
大会多数发言者(11/13)指出，对已确诊病人的监护和分期来说，仅需较少单抗。
抗体的质量控制是实验的关键环节。
抗体的质量包括其特异性、灵敏度、精密度。
贝克曼免疫 方法学
贝克曼免疫方法学
贝克曼免疫方法学是一种用于研究免疫系统的方法学，它主要
用于分析和测定细胞表面分子的表达情况、细胞的功能状态以及免
疫细胞的亚群。
贝克曼免疫方法学主要包括流式细胞仪和细胞分选
技术，它们通过利用荧光标记的抗体与细胞表面特异性抗原结合，
然后通过激光激发荧光信号，从而实现对细胞的分析和分选。
在流式细胞仪中，细胞通过流式细胞仪的流动系统单个通过激
光光束，荧光标记的抗体与细胞表面特异性抗原结合后产生荧光信号，流式细胞仪通过检测这些荧光信号来分析细胞表面分子的表达
情况，细胞的功能状态以及免疫细胞的亚群。
而细胞分选技术则是
在流式细胞仪的基础上，通过激光束的定向和细胞排序系统，实现
对特定类型的细胞进行单个分选和分离。
贝克曼免疫方法学在免疫学研究、临床诊断和治疗等领域具有
广泛的应用。
在免疫学研究中，可以通过贝克曼免疫方法学对免疫
细胞的表面标记物进行分析，从而研究免疫细胞的功能和特性；在
临床诊断中，可以利用流式细胞仪对患者的免疫细胞进行表型分析，帮助医生诊断疾病；在治疗方面，贝克曼免疫方法学也可以用于监
测患者接受免疫治疗后免疫细胞的变化情况，指导治疗方案的调整。
总之，贝克曼免疫方法学作为一种重要的免疫学研究工具，在免疫学研究、临床诊断和治疗等领域发挥着重要作用，为我们深入了解免疫系统、诊断和治疗疾病提供了有力的技术支持。
流式细胞技术基本原理及应用
LASER FITC PE
ECD PI PC5 PC7
488 520
575
615 620 665 770
<390 l 400-450 l 450-500 l
500-570 l 570-590 l 590-620 l
620-750 l
>750 l
violet
bluegreຫໍສະໝຸດ nyellow orange
Beckman Coulter：世界上最主要的高端流式细胞仪技术制造商
贝克曼库尔特细胞组学产品线
Gallios™科研型 CyAn ADP（科研型）
临床型Navios
2009年12月份上市
MoFlo Astrios 高端分选
5色数字化分析型流式 FC500
4 色数字化分析型流式 Epcis XL
Z1/Z2细胞分析计数仪
FC500的光源和光路 先进的单激光激发5色系统
单激光 就能激发5色荧光 20mW @ 488 nm Blue air-cooled argon (氩离子激光)
单激光同时激发5色荧光，确保信号来源于 同一个细胞，结果准确可靠
其它公司同档机器单激光只能激发4色，第5色需要 安装第二根激光激发。由于有两个检测点，在鞘液 压力变化、样品浓度、样品大小不均、转换采样速 度时不能确保信号来源于同一个细胞而是两个细胞 ，信号收集发生错误
(550SP)
<550 nm >550 nm
(550LP)
>550 nm <550 nm
FC500 的光路——固定光路，互换式滤片
矩形反射光路，光路短，能量损失小，易于低强度荧光检测， 并且组合滤片能保证荧光检测的特异性 完全光学线路免校正 客户可自由更换的滤片组合，且无须校正光路，可方便新荧光 染料的使用，扩展机器的功能；
FC500流式细胞仪培训教程
单细胞悬液
106/ml 正常全血
抗凝剂
取 100ul 100ul
EDTA3K （15%）约 10 微升抗凝 1 毫升全血 肝素 若抗凝不佳，有凝块，则不可检测
红细胞裂解
裂解液的选择： 保持细胞形态 红细胞裂解完全
反应温度
抗原抗体结合的最佳温度为 26~27ºC。避光。
- 21 -
FC500 培训教程
- 12 -
FC500 培训教程
- 13 -
FC500 培训教程
原理：
Hale Waihona Puke 免疫荧光分析细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合， 形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光 量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。
意义： 流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗
原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验的一项 重要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗原位点的细 胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。对于造血系 统疾病、免疫功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评估都 起了重要作用。
第五课时
7，免疫荧光(三标记)，示范及练习(1~2hr)
第六课时 9，质控品、自动质控程序及质控数据库介绍：
FlowCheck，FlowSet，CytoTrol，ImmunoTrol， FlowCount，StemTrol
利用 FlowCheck 演示 QC 数据库 10，总结及试剂介绍
第七~第八课时 11，DNA 检测及分析： 检测原理 方案设计：阈值，PEAK 峰的概念，RATIO，设计一个 DNA 数据
能高效校正光谱重叠，从而获得更准确的结果。应用 ADC 技术，生物样品的测定可获得自 动的颜色补偿，并不受乳胶微珠的限制。只有 Beckman Coulter 流式细胞仪提供了享有专利 权的数字信号处理系统（DSP），故能达到最佳的线性效应、无漂移的放大作用和颜色补偿。
流式细胞仪的原理介绍
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个 参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计 分析精确性。
1.流式细胞仪的基本结构
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
（1）液 流 系 统
由样本和鞘液组成
流式细胞仪的原理及应用
马黎明 生命科学与技术学院
流式细胞术的基本概念
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以 流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精 确的对单个细胞理化特性（如大小、内部 结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行 多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞 及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状 态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上 获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分 选。
细胞结构 • 细胞大小 • 细胞颗粒度 • DNA含量与细胞周期 • RNA含量 • 蛋白质含量 • ……
细胞功能 · 细胞表面/胞浆/核的特异 性抗原 · 细胞活性 · 细胞内/外的细胞因子 · 激素结合位点 · 细胞受体 · 钙离子浓度 · 线粒体膜电位
· ……
一、流式细胞仪的工作原理
采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与 激发效率；
吸取100ul的细胞(1 x 105)至试管中。 加进适量的荧光标记的annexin-V试剂和PI。 混匀后避光室温下孵育15分钟。（必须在室温
下进行） 孵育后加进400ul染色缓冲液，立即上流式细
胞仪分析。
Annexin-V和PI双染的特点和注意事项
单参数直方图
量细 胞 相 对 数
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种常用的细胞分析和排序工具，它能够对单个细胞进行高速、高精度的检测和分析。
它的工作原理基于光学和电子技术，结合了细胞生物学和物理学的原理。
流式细胞仪的工作原理可以分为以下几个步骤：1. 细胞样品的准备在使用流式细胞仪之前，需要对细胞样品进行准备。
通常，细胞样品会被染色或标记上特定的荧光染料，以便在流式细胞仪中进行检测和分析。
染色的方式可以根据需要选择，常见的有荧光染料和荧光标记抗体。
2. 样品注射和聚焦细胞样品被注入到流式细胞仪的流体系统中。
流体系统中的压力将样品推动到聚焦点处。
在聚焦点处，细胞样品会形成一个细胞流，每个细胞都会被单独通过激光束进行检测。
3. 激光照射流式细胞仪使用激光器产生高强度的激光束。
这束激光经过透镜和反射镜的调节，最终照射到聚焦点上的细胞流中。
激光的颜色和功率可以根据实验需要进行选择。
4. 细胞信号检测当激光束照射到细胞流中的细胞时，细胞会发出散射光和荧光信号。
流式细胞仪会收集这些信号，并将其转化为电信号进行处理。
常见的检测信号有前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）和荧光信号。
5. 信号处理和分析流式细胞仪会将收集到的电信号转换为数字信号，并通过计算机进行处理和分析。
计算机可以根据预先设定的参数来分析细胞的大小、形状、荧光强度等特征。
这些参数可以帮助研究者了解细胞的状态和功能。
6. 数据展示和结果分析流式细胞仪会将处理后的数据以图形或表格的形式展示出来。
研究者可以根据需要对数据进行进一步的分析和解读。
通过对细胞的特征进行比较和统计，可以得出一些有关细胞群体的信息，如细胞表型、细胞周期、细胞凋亡等。
流式细胞仪的工作原理基于细胞的散射和荧光特性，通过对细胞的特征进行检测和分析，可以帮助研究者了解细胞的生物学特性和功能。
它在生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域发挥着重要的作用。
美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪
美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪（Beckman coulter cell）产品型号：Cell Lab Quanta SC当前价格：0.00元产品数量：0新旧程度：全新有效期至：0000-00-00所在地：产品简介：仪器简介：T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；阵发性血红蛋白尿（PNH）检测的CD55、CD59；血小板无力症（GT）检测的CD41、CD61等等详细信息仪器简介：T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；阵发性血红蛋白尿（PNH）检测的CD55、CD59；血小板无力症（GT）检测的CD41、CD61等等。
但对于白血病/淋巴瘤免疫分型，国际上迄今为止也没有统一的抗体组合。
在2000年国际细胞分析学会（ISAC）大会上，临床血细胞计数协会组织了一次国际专家会议，以期对检测血液淋巴系统肿瘤所需最少、最有效的单抗数达成共识。
75%与会者一致认为，对于慢性淋巴系统增殖性疾病（CLD）有9种单抗：CD5,CD19,κ,λ,CD3,CD20,CD23,CD10,CD45对初诊来说是最基本的。
淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16种单抗。
对于急性白血病（AL），75%的与会者认为大约13-15种单抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO，CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，对初步鉴别白血病系列是必需的。
其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能对某些病例有用。
几乎所有的投票者都认为，要对急性白血病完善分类所需单抗的恰当数量平均为20-24种。
但这些抗体之间组合也是一大难题，目前也无统一规定（如表二）。
大会多数发言者(11/13)指出，对已确诊病人的监护和分期来说，仅需较少单抗。
抗体的质量控制是实验的关键环节。
抗体的质量包括其特异性、灵敏度、精密度。
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90 Degree Scatter
Forward Scatter Projection
Neutrophils
Forw ard Scatter
800
光路-荧光信号
每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会 有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射 波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些 光学信号
Beckman Coulter Celllab Family
EPICS XL-ADC
QUANTA SC
Gallios/Navios MoFlo XDP
Cytomics FC500
Cyan ADP
FC500硬件
What is flow cytometry?
流式细胞术是单个细 胞/颗粒流过检测装置 过程中，检测到的物 理和/或化学的特性。 Howard Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd Edition
长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过
短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 – 允许一定带宽的波长通过
光路 - 滤片特性
当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波 长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光
这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter)
A/D转换
分析系统：计算机
流路构造
流
路
单细胞悬液
大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中,将细 胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦
FLOW CELL
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
流式细胞仪 FLOW CYTOMETER
原理及软件介绍
Beckman Coulter流式细胞仪发展史
年Wallace Coulter发明了库尔特原理，用于血细胞分析 1953年推出了世界上第一台流式细胞分析仪Coulter Counter Model A 1972年推出世界上第一台激光流式细胞仪EPICS II 1975年研制出世界上第一台带计算机的流式细胞仪 1997年推出世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪EPICS XL/MCL 2000年首先将高精度数字化颜色补偿技术ADC（Advanced Digital Compensation）应用于流式平台，引领流式进入全新的全矩阵补偿、全自动 补偿和脱机补偿时代 2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细胞仪FC500/MCL，2005年升级 为FC500/MPL 2006年推出世界上第一台具有EV参数同时进行无成本绝对计数的多功能细胞 分析系统Quanta SC， 将流式细胞术与库尔特原理完美结合，2007年推出 MPL进样系统 2007年收购Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成为高端流式市场的 领导者 2009年，推出世界是第一台三激光十色的分析型流式细胞仪Gallios/Navios
分类
分析型：只能分析用，液流进入废液筒 分选型：回收目标细胞，用于后续实验。要求管 道绝对无菌。
基本原理
流路（液流系统）
流动室
鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
光路（光学系统）
光源 滤片 光电倍增管PMT HV
电路（电路系统）
放大电路HV及GAIN 增益
前向散射光
Laser
FALS Sensor
前向散射光
散射光信号 – 侧向散射光
SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称 为90度散射光检测器
SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比
侧向散射光
Laser
FALS Sensor
620
675 620 755 670
免疫荧光
免疫荧光 DNA染色 免疫荧光
橙红
红 橙红 深红
APC
633
670
5 Color Single Laser (488nm)
FITC/PE/ECD/PC5/PC7
荧光染料比较(平均荧光强度)
Q-Prep / ImmunoPrep 试剂系统
CD8-FITC
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING)
•发射波长(EMISSION)
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm)
FITC PE(RD1) 488 488 525 575
用途
免疫荧光 免疫荧光
颜色
绿色 橙色
ECD
PeCy5 PI PECy7 PerCP
488
488 488 488 488
光路构造
光
光源
路
检测信号 散射光信号 FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光)
荧光信号 荧光染料 光学滤片
光
路
光源 与通过的细胞聚焦在同一点上 激光
空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 空冷/水冷 Enterprise II 水冷 Innova300系列 Innova70系列
CD8-PE
CD8-ECD
CD8-PC5
CD8-PerCP
CD8-APC
PerCP < APC < FITC < ECD < PC5 < PE
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)
光路 - 滤片特性
90LS Sensor
侧向散射光
Light Scatter Gating
Side Scatter Projection
1000
Scale
1000 200 50 40 20 15 8
200 400
600
100
30
Monocytes Lymphocytes
0
0 200 400 600 800 1000
常用激光器及其通道分配表
检测信号
散射光信号—前向散射光(FS)
FS----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小