转录组分析_R
转录组分析流程范文
转录组分析流程范文转录组分析是一种用于研究特定生物体或组织中的全部转录本的方法。
它通过测量RNA分子在特定时间点和条件下的表达水平，揭示了基因转录的调控机制，功能注释和转录本的表达图谱，并为找到新的基因和功能注释提供了线索。
下面是一个常用的转录组分析流程，包含预处理、质控、序列比对、表达定量和差异分析等步骤。
1.数据预处理：数据预处理主要包括质量控制和去除低质量序列。
在高通量测序中，原始的测序数据通常包含低质量碱基、接头序列和多聚A/T等噪声。
质控工具如FastQC可以用于评估测序数据的质量，根据其结果，采用切割、修剪、过滤和去除低质量序列来提高数据质量。
2.序列比对：序列比对是将预处理后的测序数据与参考基因组进行比对的过程。
常用的比对工具包括Bowtie、BWA和STAR等。
这一步的目的是将测序数据映射到参考基因组上，以确定每个读取序列的起始位置。
3.表达定量：表达定量是将比对得到的序列转化为表达量的过程，它衡量了每个转录本的相对丰度。
常用的表达定量工具包括HTSeq、Cufflinks和Salmon 等。
这些工具通过计算每个转录本对应的读取数来估计其表达水平，并生成基因表达矩阵。
4.差异表达分析：差异表达分析是比较不同条件下的基因表达量，以确定哪些基因在不同条件下的表达水平发生了显著变化。
常用的差异表达分析工具包括DESeq2、edgeR和limma等。
这些工具通过统计学方法来鉴定不同条件之间的显著差异，并生成差异表达基因列表。
5.功能注释：功能注释是对差异表达基因进行生物学功能注释的过程。
常用的功能注释工具包括DAVID、GOseq和KEGG等。
这些工具通过富集分析、与已知数据库的比对和基因网络分析等方法，帮助研究人员了解差异表达基因的功能和参与的生物学过程。
6.结果可视化：结果可视化是将转录组分析结果以图形化的形式呈现，以帮助研究人员理解和解释数据。
常见的结果可视化工具包括Heatmap、Venn图、火山图和基因网络图等。
转录组分析流程
转录组分析流程转录组学是研究生物体在特定时期或环境中所有mRNA的总体，通过对转录组的分析可以揭示基因的表达模式、功能及调控机制，对于疾病的诊断、治疗及基因工程等领域具有重要意义。
转录组分析流程是对转录组数据进行处理和解读的过程，下面将介绍转录组分析的一般流程。
1. 数据获取。
转录组数据通常来源于高通量测序技术，包括RNA-seq和单细胞RNA-seq等。
首先需要进行样本采集和RNA提取，然后进行测序实验，获取原始的测序数据。
2. 数据预处理。
原始测序数据通常包含低质量序列、接头序列和重复序列等，需要进行质量控制和过滤，包括去除接头序列、低质量序列和重复序列，得到高质量的测序数据。
3. 序列比对。
将高质量的测序数据与参考基因组进行比对，确定每个序列在基因组中的位置，得到比对结果，为后续的基因表达定量和差异表达分析奠定基础。
4. 基因表达定量。
通过对比对结果进行基因表达定量，包括计算基因的读数、FPKM（每百万读数下的每个基因的预期碱基数）或TPM（每百万读数下的每个基因的转录本数），得到每个基因在不同条件下的表达水平。
5. 差异表达分析。
对不同条件下的基因表达水平进行比较，筛选出差异表达的基因，通过统计学方法进行显著性分析，找出在不同条件下表达水平显著变化的基因。
6. 功能注释。
对差异表达的基因进行功能注释，包括GO（Gene Ontology）富集分析、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析等，确定差异表达基因的功能和通路富集情况。
7. 数据可视化。
通过绘制热图、火山图、基因表达曲线等图表，直观展示转录组数据的分析结果，帮助研究人员更好地理解和解释数据。
8. 结果解释。
最后根据分析结果，解释不同条件下的基因表达模式和功能富集情况，为后续的生物学实验和功能研究提供重要参考。
总结，转录组分析流程是一个系统的、复杂的过程，需要对原始数据进行处理、分析和解释，通过转录组分析可以揭示基因的表达模式和功能，为生物学研究和应用提供重要信息。
转录组分析报告
转录组分析报告介绍转录组分析是研究基因组中转录过程的研究领域。
通过转录组分析，我们可以了解到在特定条件下细胞中正在转录的所有基因。
这些信息对于理解细胞功能、疾病发展以及生物技术的开发都非常重要。
本报告将介绍转录组分析的一般步骤和常用方法。
步骤一：实验设计转录组分析的第一步是设计实验。
在这个步骤中，我们需要确定要研究的样本类型、实验条件和重复次数。
合理的实验设计可以最大程度地减少误差，并提高结果的可靠性。
步骤二：RNA提取在转录组分析中，我们需要从样本中提取RNA。
RNA是细胞中转录的产物，它可以反映细胞中正在表达的基因信息。
RNA提取的质量和纯度对后续的转录组分析非常重要。
常用的提取方法包括酚氯仿法、磁珠法和硅胶膜法等。
步骤三：RNA测序RNA测序是转录组分析的核心步骤之一。
通过RNA测序，我们可以将RNA样本转化为对应的DNA序列，并确定每个基因的表达水平。
常见的RNA测序技术包括Sanger测序、二代测序和三代测序等。
二代测序技术如Illumina和Ion Torrent等已经成为转录组分析的主流技术。
步骤四：数据预处理RNA测序会产生大量的原始数据，这些数据需要进行预处理以去除噪音和提高数据质量。
数据预处理包括去除低质量的reads、去除接头序列、去除重复序列和过滤低表达基因等。
预处理后的数据可以为后续的分析提供可靠的基础。
步骤五：差异表达基因分析差异表达基因分析是转录组分析的重要环节之一。
通过比较不同条件下基因的表达水平，我们可以找到与特定条件相关的差异表达基因。
常用的差异表达基因分析方法包括DESeq、edgeR和limma等。
这些方法可以帮助我们发现与特定条件相关的生物学过程和信号通路。
步骤六：功能注释和富集分析一旦确定了差异表达基因，我们可以对这些基因进行功能注释和富集分析。
功能注释可以帮助我们了解差异表达基因的功能和参与的生物学过程。
而富集分析可以帮助我们发现差异表达基因在特定功能和通路中的富集情况。
TCGA（转录组）差异分析三大R包及其结果对比
TCGA（转录组）差异分析三大R包及其结果对比最近我们最优秀的R语言讲师小洁也开启了TCGA知识库打卡之旅，分享一下她其中一个学习成果，TCGA（转录组）差异分析三大R包及其结果对比。
如果你跟着她的教程学会了相关分析，可以尝试完成一个学徒作业：理解RNA-seq表达矩阵的两个形式众所周知,TCGA数据库是目前最综合最全面的癌症病人相关组学数据库，包括：•DNA Sequencing•miRNA Sequencing•Protein Expression array•mRNA Sequencing•Total RNA Sequencing•Array-based Expression•DNA Methylation•Copy Number array知名的肿瘤研究机构都有着自己的TCGA数据库探索工具，比如：•Broad Institute FireBrowse portal, The Broad Institute•cBioPortal for Cancer Genomics, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center所以我挑选了部分，写了6个数据下载系列教程：•TCGA的28篇教程- 使用R语言的cgdsr包获取TCGA数据（cBioPortal）•TCGA的28篇教程- 使用R语言的RTCGA包获取TCGA数据（离线打包版本）•TCGA的28篇教程-使用R语言的RTCGAToolbox包获取TCGA 数据（FireBrowse portal）•TCGA的28篇教程- 批量下载TCGA所有数据（UCSC的XENA）•TCGA的28篇教程-数据下载就到此为止吧•TCGA的28篇教程-整理GDC下载的xml格式的临床资料虽然说，教程是关于TCGA数据库的不同数据的下载，实际上是希望可以帮助大家认识TCGA数据库的全貌，然后根据大家的提问，我也扩充了部分常见的TCGA数据库用法：•TCGA的28篇教程-免疫全景图•TCGA的28篇教程-指定癌症查看感兴趣基因的表达量•TCGA的28篇教程-对TCGA数据库的任意癌症中任意基因做生存分析•TCGA的28篇教程-风险因子关联图-一个价值1000但是迟到的答案•TCGA的28篇教程-数据挖掘三板斧之ceRNA•TCGA的28篇教程-所有癌症的突变全景图•TCGA的28篇教程-早期泛癌研究•TCGA的28篇教程-CNV全攻略•TCGA的28篇教程-GTEx数据库-TCGA数据挖掘的好帮手下面开始小洁的表演1.准备R包if(!require(stringr))install.packages('stringr')if(!require(ggplotify))install.packages("ggplotify")if(!require(patchwork))install.packages("patchwork")if(!require(cowplot))install.packages("cowplot")if(!require(DESeq2))install.packages('DESeq2')if(!require(edgeR))install.packages('edgeR')if(!require(limma))install.packages('limma')## 点评：这样的R包安装方法是有问题,大家自行思考一下2.准备数据本示例的数据是TCGA-KIRC的miRNA表达矩阵。
转录组数据分析
转录组数据分析引言：转录组数据分析是研究生物体在特定条件下细胞内mRNA的表达情况的一种方法。
转录组数据分析的目的是识别差异表达的基因，揭示其在生物学过程中的功能和调控机制。
随着高通量测序技术的发展，转录组数据的获取变得更加容易和可行，因此转录组数据分析也成为生命科学研究中的重要工具之一。
本文将介绍转录组数据分析的基本流程和常用的分析方法。
一、转录组数据的获取转录组数据的获取通常使用高通量测序技术，例如RNA-Seq和microarray。
RNA-Seq是一种基于测序的转录组分析技术，可以直接测定细胞或组织中的mRNA的序列，无需参考基因组序列，因此能够检测到新的转录本和未注释的基因。
Microarray是一种基于杂交的转录组分析技术，通过固定的探针阵列检测RNA样本中的mRNA的水平。
两种技术各有优劣，研究人员可以根据自己的研究目的选择适合的方法。
二、转录组数据分析的基本流程转录组数据分析的基本流程包括数据预处理、差异表达分析和功能注释。
数据预处理是对原始转录组数据进行筛选、过滤和归一化处理，以得到可靠的表达量信息。
差异表达分析通过统计学方法找出在不同条件下差异表达的基因。
功能注释则针对差异表达基因进行功能分析，识别其参与的生物学过程和通路。
三、数据预处理数据预处理是转录组数据分析的第一步，其目的是筛选和过滤掉噪声数据，并对数据进行归一化处理。
常见的数据预处理步骤包括：读取原始数据、去除低质量读段、去除接头序列和低质量碱基、去除rRNA序列、对碱基进行质量修剪、进行序列比对和表达量计算、基因表达量归一化等。
数据预处理的目的是为后续的差异表达分析做好准备。
四、差异表达分析差异表达分析是转录组数据分析的核心步骤，它通过统计学方法找出在不同条件下差异表达的基因。
常见的差异表达分析方法有DESeq2、edgeR和limma等。
这些方法利用统计学模型和假设检验来计算基因表达的显著性差异，并生成差异表达基因列表。
转录组学 r语言代码
转录组学 r语言代码转录组学是一项重要的研究方法，它可以帮助我们理解基因在转录过程中的表达模式和功能。
而在转录组学研究中，R语言是一个十分强大且广泛使用的工具。
本文将介绍一些常见的转录组学分析任务，并提供相应的R语言代码示例。
1. 数据预处理在转录组学研究中，首先需要对原始测序数据进行预处理。
这包括去除低质量的读取、去除接头序列、去除rRNA序列等。
R语言提供了许多用于处理测序数据的包，例如`Bioconductor`中的`ShortRead`和`FastqPuri`包。
以下是一个示例代码，展示了如何使用`FastqPuri`包对原始测序数据进行质量控制和过滤：```R library(FastqPuri)# 读取FASTQ文件 fastq <-readFastq('raw_data.fastq')# 进行质量控制和过滤 fastq_filtered <- fastqFilter(fastq, minQual = 20, maxN = 0)# 将过滤后的数据保存到新的FASTQ文件writeFastq(fastq_filtered, 'filtered_data.fastq') ```2. 差异表达分析差异表达分析是转录组学研究的关键任务之一，它可以帮助我们寻找在不同生物样本中表达差异显著的基因。
在R语言中，`DESeq2`包是一个常用的差异表达分析工具。
以下是一个示例代码，展示了如何使用`DESeq2`包对差异表达进行分析：```R library(DESeq2)# 读取基因表达矩阵 counts <-read.table('expression_matrix.txt', header = TRUE,s = 1)# 创建DESeq2对象 dds <-DESeqDataSetFromMatrix(countData = counts, colData = colData,design = ~ group)# 进行差异表达分析 dds <- DESeq(dds)# 提取差异表达基因 results <- results(dds,contrast = c('group', 'treatment', 'control')) ```3. 功能富集分析功能富集分析可以帮助我们了解差异表达基因的生物学功能和通路富集情况。
转录组分析(RNA-Seq)-PPT文档资料
Random hexamer primed cDNA synthesis
Paired-end
Solexa Sequencing
-6- dT微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片 段两端
转录组分析（RNA-Seq）
• 李江攀
RNA-Seq 的技术背景 RNA-Seq 的应用领域 RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
数字表达谱与芯片的比较
特点
数字化信号 高通量 可重复性高 无需重复实验 检测低丰度基因 检测新转录本 检测反义链转录本
数字表达谱
√ √ √ √ √ √ √
芯片
√
Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双 重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。Βιβλιοθήκη RNA-Seq 的发展前景
转录组学分析流程及常用软件介绍
转录组学分析流程及常用软件介绍转录组学是研究在特定条件下生物体内转录的所有RNA分子的总体，包括信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）和小核RNA（snRNA）等。
转录组学研究可以通过分析转录组中的基因表达水平和调控机制，揭示基因功能和调控网络，从而深入了解生物体的生命活动和适应能力。
转录组学分析流程包括实验设计、RNA提取、RNA测序、数据分析和结果解释等环节，并依赖于一系列的软件工具来完成。
下面将介绍转录组学分析的流程以及常用的软件。
1.实验设计：确定研究目的和假设，设计实验方案，包括样本的选择和处理方式等。
2.RNA提取：从样本中提取总RNA，并进行纯化和富集，去除DNA和其他杂质。
3. RNA测序：将提取得到的RNA反转录成cDNA，然后通过高通量测序技术进行测序。
常用的测序技术包括Illumina HiSeq、Ion Torrent Proton等。
4.数据分析：对测序得到的数据进行质控、比对和定量等处理。
这一步通常需要使用一系列的转录组学分析软件。
5.结果解释：根据数据分析的结果，进行差异表达基因的筛选、基因富集分析和信号通路分析，以探索转录组的生物学意义。
常用的转录组学分析软件包括：1. 基因表达微阵列分析：在早期的转录组学研究中，基因表达微阵列是常用的分析方法。
常用的分析软件有Affymetrix Expression Console、Partek Genomics Suite等。
2. RNA测序数据分析：随着高通量测序技术的发展，RNA测序已成为转录组学研究的主要方法。
RNA测序数据的分析可以分为质控、比对和定量等环节。
常用的软件工具有Trimmomatic、FastQC、STAR、HISAT等。
3. 差异表达基因分析：差异表达基因是通过比较不同样本之间的基因表达水平而筛选出来的。
常用的软件包括DESeq2、edgeR、limma等。
4. 基因富集分析：基因富集分析可以帮助我们了解不同基因集之间的功能和通路差异，从而揭示转录组的生物学意义。
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• 基因功能注释 • 基因结构分析 • 鉴定出大量新转录本 • 可变剪接鉴定 • 基因融合鉴定
Genome Res 2010
无参考基因组生物信息分析
• Unigene功能注释 • Unigene的GO分类 • Unigene代谢通路分析 • 预测编码蛋白框（CDS） • Unigene表达差异分析 • Unigene在样品间的差异GO分类和Pathway
有参考基因组序列生物信息分析
• 基因结构优化 • 鉴定基因可变剪接 • 预测新转录本 • SNP 分析 • 基因融合鉴定
有参考基因组序列信息分析流程
Reads 在基因组上的分布
基因结构优化
通过转录组测序鉴定出酵母3’ 和5’ UTR区域 (Nagalakshmi, U. et al.,2008)
富集性分析
De novo reads组装流程
Unigene GO 分类
Unigene COG 功能分类
基因表达差异分析
N1:total tag Number in sample A N2:total tag Number in sample B X :Gene expression level in sample A y :Gene expression level in sample B Reference: Audic S. et al. The significance of
3’-
…-5’
5’-
GTATTTTC GGC AC AG
A
G
A
C
T C
T TG
Cycle 1:按顺序加入反应试剂
合成第一个碱基
清除未反应的碱基和试剂
激发碱基荧光并收集荧光信号
去除阻断基团和荧光基团
Cycle 2-n:
重复前面的步骤
Cluster station
• 剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另
Genomic intergenic region
SNP分析
N Eng J Med 2009
Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptome
Rice Transcriptome
基因组表达
测序数据分析
• 1991年Adams开创了EST测序，对每个转录本测定 400-据已经成为数量最多， 涉及物种最广的转录组数据。NCBI设立了专门的数 据库dbEST来存放这些数据。
• 1995年Velculescu建立了短标签来标识法SAGE测序方 法，利用转录本3’端第一个CATG位点下游14p长的短 标签来标识相应的转录本。SAGE方法相比EST测序通量大大提高。 但是由于SAGE标签仅14bp，很难唯一注释到相应转 录本，大量实验得到的SAGE标签无法定位到基因。
mRNA反转录
• 纯化过的mRNA样品加 入1 µl的fragment buffer 70℃作用1.5min。
• 加入1µl的stop buffer终止 反应。
• 入沉淀剂（NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀酶切产 物。
• 末端修复 • cDNA 3′末端加A • Adapter连接
不同方法比较
Total RNA样品检测
Agilent 2100 检测
• OD260/280:1.8~2.2 • RNA 28S:18S ≥ 1.0; RImRNA的分离
↓
mRNA的打断
↓
cDNA的合成
末端修复
↓
3’端↓加A
↓
加接头
↓
胶回收
PCR
↓
PCR胶回收
真核mRNA的纯化
Material
callus root at seedling stage（14d） shoot at seedling stage（14d） flag leaves（2 stages） panicle（3 stages）
Methods
RNASeq（paired-end & single end） DGE small RNA（18-30 nt）
• mRNA的纯化主要通过磁 珠吸附原理从而分离纯化
• Oligo（dT）25磁珠纯化原 理主要是mRNA的3′的poly A与磁珠在bindingbuffer的 作用下相结合。磁珠通过 MPC（磁分离器）从溶液 中分离出来。
• mRNA与磁珠结合后，再 用Tris-HCL在加热条件下 解离洗脱到溶液中。
新一代测序技术
Read Length 1×35 bp 2×35 bp 2×100 bp
Run Time ~1.5 days ~4 days ~8 days
Throughput : up to 25 Gb per day
Output 26-35 Gb 75-100 Gb 150-200 Gb
基于SBS测序技术
鉴定基因可变剪接
exon1
exon2
common reads
exon3
mRNA
junction reads
exon1
exon3
exon1
exon2
exon3
鉴定融合基因
Paired Reads distribution
Reads cluster
新转录本预测
Paired-End (PE) Reads
digital gene expression profiles. Genome Res. 1997 7(10):986-995
Alternative splicing and isoform
Unigene pathway 富集性分析
Pathway富集性分析列表
外一端随机和附近的另外一个引物互补，被 “固定”住，形成“桥”(bridge)。
• 形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，
在芯片表面进行扩增，形成双链。
• 双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下
一轮扩增的模板继续扩增反应。
• 反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩
增，成为单克隆“DNA簇群”。
生物信息分析
• 之后Saha提出了LongSAGE方法，将SAGE标签长度增 加到21bp，使得直接基因组注释成为可能。
• 衍生了一系列基于21bp标签的测序方法，如CAGE， MPSS，PET等，但是21bp的短标签注释仍然存在很 多问题，目前实验得到的标签约有一半无法注释到 基因组。
• Illumina Sequencing • 生物信息分析