转录组学研究方法
转录组学研究方法
In Situ Hybridization
原位杂交3
Moroz LL, 2006
逆转录(Reverse transcription)
逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚
合酶。这种酶是 1970 年美国科学 家特明 (H. M. Temin) 和巴尔的摩 (D. Baltimore) 分别于动物致癌 RNA 病毒中发现，他们并因此获 得 1975 年度诺贝尔生理学或医学 奖。
RT-PCR
RT-PCR是将RNA的 反转录（RT）和cDNA 的聚合酶链式扩增 （PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作 用从RNA合成 cDNA， 再以cDNA为模板，扩 增合成目的片段。
3’ RACE
以mRNA的
polyA为锚定
5’ RACE
原理上比3’RACE要
稍微复杂 要点: 逆转录酶 MMLV合成cDNA具 有加尾特性，即在合 成的cDNA链3’加上 3-4个dCTP，而且当 存在帽子结构时该酶 的加尾活性最高 然后以这段polyC为 锚定
上堂课内容
• mRNA检测技术 – 核酸杂交技术 – 原位杂交 – 逆转录PCR (Reverse transcription PCR，RT-Fra bibliotek核酸杂交
northern blot
探针制备
放射性同位素标记物 α-32P-dCTP 灵敏度达0.01pg
转录组学技术的研究方法
转录组学技术的研究方法随着科技的不断发展，生物学研究也逐渐向着高通量、大数据的方向发展。
其中，转录组学技术是一个非常重要的研究领域。
简单来说，转录组学是指在细胞或组织中进行的整个基因组的RNA表达分析。
通过分析RNA的表达和调控，可以对基因的功能和调控机制有更深入的了解。
本文将探讨转录组学技术的主要研究方法，包括RNA测序、芯片技术和实时荧光定量PCR技术等。
一、RNA测序技术RNA测序技术是目前转录组学研究中最常用的技术之一。
RNA测序的方法可以区分为两种：第一种是全转录组测序（RNA-Seq），第二种是比较转录组测序（differential RNA-Seq）。
1.全转录组测序全转录组测序（RNA-Seq）是指测序所有的RNA分子。
这种方法能够检测到所有的转录本，可以用来进行基因表达定量、新转录本检测、异戊二烯修饰（m6A）检测等。
RNA-Seq的步骤主要包括：RNA提取、RNA质量检测、RNA分离、RNA逆转录、文库建立、高通量测序等。
RNA测序技术使用高通量测序仪，将逆转录后的cDNA片段进行测序。
测序产生的读段需要进行比对到基因组上，最后利用软件生产基因组表达矩阵，来帮助定量基因表达。
2.比较转录组测序比较转录组测序（differential RNA-Seq）是对不同样品之间RNA分子水平表达的差异进行比较分析。
这种技术可以帮助研究人员识别哪些基因在不同样品中表达差异较大，并且可以检测到转录后的剪切变异、可变剪接、新基因的出现和长非编码RNA等。
比较转录组测序的步骤与RNA-Seq类似，不同的是比较转录组测序需要在一定数量的样本间做比较，这样才能找到不同样品之间的差异。
二、芯片技术芯片技术是转录组研究中常用的技术之一。
它可以在一个芯片上检测成百上千种基因，并且还可以检测基因表达的定量。
芯片技术已经被广泛用于人类疾病的研究，如癌症、心血管疾病等。
芯片技术的方法也比较简单，首先是设计芯片的探针并且将它们固定在一个固体载体上。
转录组学的定义
转录组学的定义
转录组学是一门研究基因组中转录过程的学科，它关注的是细胞中基因转录所产生的所有RNA分子，即转录组。
通过对转录组的研究，可以了解到细胞内基因的表达情况和调控机制，从而揭示生物体在不同状态下的功能和特征。
转录组学的研究方法主要包括两个方面：转录组测序和数据分析。
转录组测序可以通过高通量测序技术，如RNA-seq，来获得细胞中所有转录产物的序列信息。
这些序列信息可以用来分析基因的表达水平、剪接变体、RNA修饰等信息。
数据分析则是对转录组测序产生的大量数据进行处理和解读，通过比对序列到基因组或参考序列数据库，来鉴定基因的表达水平和变异情况。
转录组学的研究应用广泛。
在医学领域，转录组学可以用来研究疾病的发病机制和诊断标志物。
通过比较疾病组织和正常组织的转录组差异，可以找到与疾病相关的基因和通路，为疾病的早期诊断和治疗提供依据。
在农业领域，转录组学可以帮助改良作物的品质和抗逆性，通过分析转录组差异，筛选出与优良性状相关的基因，为作物育种提供理论依据。
此外，转录组学还可以应用于生态学、微生物学等领域的研究。
转录组学的发展给我们提供了深入了解基因表达调控和功能的机会，为解决生命科学中的许多问题提供了新的思路和方法。
然而，转录组学研究也面临着一些挑战，如数据分析的复杂性、样本量的选择
和RNA质量的保证等。
因此，未来需要不断发展和改进转录组学的技术和方法，以更好地应用于各个领域的研究。
转录组学微生物
转录组学微生物转录组学微生物是一门研究微生物基因表达的学科，通过对微生物转录组的分析，可以深入了解微生物在不同环境中的基因表达模式，揭示微生物的生理特性和生物功能。
本文将从转录组学的基本原理、研究方法和应用领域等方面进行介绍。
一、转录组学基本原理转录组是指一个生物体在某个时刻的所有基因的转录产物，即所有mRNA的总和。
转录组学研究的主要目标是通过高通量测序技术，对微生物的转录产物进行全面和系统地分析，以获得微生物在特定环境中的基因表达谱。
转录组学的研究基于以下两个基本原理：1. 基因表达的可变性：微生物在不同环境中的基因表达模式会发生变化，这种变化可以通过转录组学的分析来揭示。
通过比较不同条件下的转录组数据，可以了解微生物对环境的适应机制，以及其在不同生长阶段或不同环境中的适应策略。
2. 基因调控网络：微生物的基因表达受到复杂的调控网络控制，包括转录因子、信号传导通路和代谢途径等。
转录组学可以揭示这些调控网络的结构和功能，帮助我们理解微生物的生物学过程和生物功能。
二、转录组学研究方法转录组学的研究方法主要包括以下几个步骤：1. RNA提取：从微生物样品中提取RNA，包括mRNA和非编码RNA等。
2. RNA测序：使用高通量测序技术对RNA样品进行测序，得到大量的短序列数据。
3. 数据分析：对测序数据进行质控、比对和注释等分析，得到基因表达谱和差异表达基因。
4. 功能注释：对差异表达基因进行功能注释和富集分析，了解微生物的生物学功能和代谢途径等。
5. 转录因子预测：通过分析转录因子结合位点和转录因子基因的表达数据，预测微生物的转录因子和调控网络。
三、转录组学在微生物研究中的应用转录组学在微生物研究中有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 研究微生物的适应机制：通过比较不同环境下的转录组数据，可以了解微生物对环境的适应机制和适应策略。
例如，研究细菌在不同营养条件下的基因表达模式，可以揭示其对不同营养物质的利用方式和代谢途径。
转录组学主要技术与应用研究
转录组学主要技术与应用研究转录组学是一种研究生物体转录组的学科，它主要通过采用高通量测序技术，对细胞中所有基因的RNA表达进行全面和系统地研究。
通过对转录组的研究，我们可以全面了解基因在特定组织、特定时期和特定环境下的表达情况，可以揭示基因在生物体发育、生理活动和适应环境等方面的机制，以及与疾病发生发展相关的分子基础。
下面将对转录组学的主要技术和应用研究进行详细介绍。
一、转录组学的主要技术1. RNA测序技术（RNA-Seq）：RNA测序是转录组学研究的核心技术，它通过将RNA反转录成DNA，并进行文库构建和测序，得到RNA的全长序列信息。
RNA-Seq技术相比传统的Microarray技术，具有更高的灵敏度和准确性，可实现低丰度基因的检测和定量，同时可以鉴定新转录物和变异。
2.转录组组装和注释：对RNA测序得到的序列进行数据处理，包括序列质量控制、去除低质量序列、去除污染序列等，然后对测序得到的短序列进行组装和注释，得到基因的表达信息和基因的结构信息。
3.管理基因和差异表达基因分析：将样品的RNA序列比对到参考基因组或转录组，利用比对结果和参考基因组的注释信息，挖掘出差异表达的基因，进而进行差异表达基因的验证和功能解析。
4. 其他技术：包括RNA亚转录组测序（sub-transcriptome sequencing）、全长转录组测序（full-length transcriptome sequencing）、单细胞转录组测序（single-cell transcriptome sequencing）等技术。
二、转录组学的应用研究1.基因功能解析：通过分析转录组数据，可以研究基因的表达模式、调控网络和与其他基因的相互作用，进而揭示基因在生物体发育、生理功能和适应环境等方面的作用和机制。
2.疾病诊断和预测：转录组学可以揭示疾病发生和发展的分子基础。
通过比较疾病组织和正常组织的转录组差异，可以鉴定与疾病相关的基因和通路，为疾病的早期诊断和治疗提供新的靶点和策略。
生物信息学中的转录组学分析技术研究
生物信息学中的转录组学分析技术研究随着基因芯片、高通量测序技术等生物技术的飞速发展，转录组学成为生命科学研究中的热点领域。
转录组学是指对细胞或组织中所有mRNA的表达进行全面测定，并对不同的生物过程和环境因素对各mRNA表达的影响进行研究。
近年来，转录组学研究的技术不断更新和完善，尤其是高通量测序技术的出现，为转录组学的研究提供了更多的数据和方法。
1. 转录组测定技术转录组测定主要有两种方法：基于基因芯片的转录组测定和RNA测序。
基因芯片技术是通过已经设计好的微阵列芯片上序列标记的探针，对靶组织的mRNA样本进行同步分析。
而RNA测序是通过RNA转录的高通量测序技术对所有基因表达水平的分析，可以捕获到基因组区域的差异表达。
基于基因芯片的转录组测定技术在外显子基因的表达测定方面具有一定的优势，因为基因芯片上的基因片段是经过筛选和设计后的，比较准确。
而基于RNA测序的技术则可以获得不同位点全部的信息，不论是转录本还是外显子基因。
同时，RNA测序的数据质量比较高，能够获得较高的发现率和警戒率。
2. 转录本定量转录本是指DNA序列通过RNA的翻译过程所产生的基因表达产物。
在转录组分析中，转录本定量是评估基因表达水平的关键环节，可以有效地从全转录组的角度分析人类基因表达水平的变化。
转录本定量比较准确的方法是使用qPCR（实时荧光定量PCR）。
qPCR能够测定基因表达，具有高灵敏度和特异性。
另一种流行的转录本定量方法是RNA-seq，它使用高通量测序技术直接确定在样品中存在的个体转录本的数量和补充器。
3. 转录本定量分析转录本定量分析是通过基因芯片或RNA测序数据获得的数据量选择，计算基因的表达水平以及进一步分析差异表达。
目前，有许多工具可以计算定量表达值，例如Cufflinks，eXpress和RSEM都能够使用RNA-Seq数据来计算基因表达值。
在基因芯片上，我们可以使用MAS5，RMA和dChip等软件来做微阵列数据的预加工和信号调整。
转录组学的研究内容
转录组学的研究内容一、引言转录组学是指对一个生物体内所有基因在特定时期、特定条件下的转录情况进行系统性研究的一种方法。
随着高通量测序技术的发展，转录组学已经成为了生命科学中最重要的研究领域之一。
本文将介绍转录组学的研究内容。
二、转录组测序1. RNA提取：RNA提取是进行转录组测序的第一步，通常采用TRIzol法或者RNAeasy Mini Kit等商业试剂盒进行。
2. RNA质量检测：RNA质量检测可以通过琼脂糖凝胶电泳、NanoDrop等方法进行。
3. RNA文库构建：RNA文库构建是指将RNA样品经过反转录、PCR 扩增等步骤制备成适合于高通量测序的DNA文库。
4. 高通量测序：高通量测序技术包括Illumina HiSeq、Ion Torrent PGM等，可以对RNA样品进行高效准确地测序。
三、差异表达基因分析差异表达基因分析是指对不同条件下两个或多个样品中基因表达水平的差异进行比较和分析。
这种分析可以帮助我们找到与某种生物学现象相关的基因，从而深入研究其作用机制。
1. 数据预处理：数据预处理包括去除低质量序列、过滤低质量序列、去除接头序列等步骤。
2. 序列比对：将测序得到的reads与参考基因组进行比对，可以使用Bowtie、Tophat等软件进行。
3. 基因表达水平计算：根据比对结果，可以通过RSEM、Cufflinks等软件计算每个基因在不同样品中的表达水平。
4. 差异分析：差异分析通常使用DESeq2、edgeR等软件进行。
这些软件可以帮助我们找到在不同样品中表达水平有显著差异的基因。
四、功能富集分析功能富集分析是指将差异表达基因进行注释和分类，并将其与已知的生物学过程和信号通路联系起来，以便更深入地理解其生物学意义。
这种分析可以通过GO注释、KEGG通路分析等方法进行。
1. GO注释：GO注释是指将差异表达基因按照其生物学功能分类，并将其归入三个主要类别：细胞组成、分子功能和生物过程。
转录组学研究方法
转录组学研究方法转录组学是研究细胞、组织或生物体在特定条件下的全部转录产物的方法。
它通过对RNA序列的定量和定性分析，揭示了基因表达的状态和调控机制，为生物体的发育、生长和适应环境等生物学过程提供了重要的信息。
本文将介绍转录组学的主要研究方法。
1. RNA测序（RNA-Seq）RNA测序是转录组学研究中最常用的方法之一、它通过对RNA样品进行逆转录、建库、测序等步骤，获得RNA序列信息，并通过生物信息学分析来确定转录本的表达水平、剪接异构体和单核苷酸变异等。
RNA测序技术可以全面地分析转录本的全集，不受参考基因组限制，并可以检测新的转录本和非编码RNA。
2.差异表达基因分析差异表达基因分析用于确定在不同组织、时间点或处理条件下表达量发生变化的基因。
通过比较不同样品中的转录组数据，可以鉴定出差异表达的基因，并进行进一步的功能注释和富集分析。
差异表达基因分析可以帮助我们确定与特定生物过程相关的基因。
3.转录因子结合位点分析转录因子结合位点分析可以鉴定转录因子结合到基因组DNA上的位点，从而揭示基因转录的调控网络。
这个方法基于转录因子的特异性结合序列（转录因子结合位点，TFBS）的预测模型，通过对转录组数据进行生物信息学分析，可以预测出可能的转录因子结合位点。
4.全基因组的基因表达谱研究全基因组的基因表达谱研究可以同时分析细胞或组织中所有基因的表达水平，在不同条件下对比不同样品的表达谱，可以鉴定出哪些基因在不同条件下具有相似或相反的表达模式。
这种方法可以帮助我们理解基因调控网络和准确鉴定基因功能。
5.基于蛋白质-RNA相互作用的研究基于蛋白质-RNA相互作用的研究可以揭示转录后调控的机制。
这种方法通过分析RNA与蛋白质之间的相互作用，鉴定RNA结合蛋白质的结合位点和关键蛋白质，从而确定蛋白质对转录后调控的功能。
总结起来，转录组学的研究方法包括RNA测序、差异表达基因分析、转录因子结合位点分析、全基因组的基因表达谱研究和基于蛋白质-RNA 相互作用的研究。
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◆ STACK (http://www.sanbi.ac.za/Dbases.html)
EST的应用 1： EST与基因识别
EST已经被广泛的应用于基因识别，因为EST的数目比 GenBank中其它的核苷酸序列多，研究人员更容易在EST库中 搜寻到新的基因(Boguski et al., 1994).
RT-PCR
RT-PCR是将RNA的反 转录（RT）和cDNA的 聚合酶链式扩增（PCR ）相结合的技术。首 先经反转录酶的作用 从RNA合成 cDNA，再 以cDNA为模板，扩增 合成目的片段。
3’ RACE
• 以mRNA的 polyA为锚定
5’ RACE
• 原理上比3’RACE要 稍微复杂 • 要点: 逆转录酶 MMLV合成cDNA具 有加尾特性，即在 合成的cDNA链3’加 上3-4个dCTP，而且 当存在帽子结构时 该酶的加尾活性最 高 • 然后以这段polyC为 锚定
完成注释
续 分
无理想匹配
InterproScan
较好匹配
域的注释
析
无理想匹配
New seque工分类
大部分以Adams 95年的文章中的采用分类体系为标准。
【Adams. MD, et al. Initial assessment of human gene diversity and expression patterns based upon 83 million nucleotides of cDNA sequence. Nature. 1995 377(6547 Suppl):3-174 】
◆
两端测序 获得更全面的信息。
基因注释及功能分类
注释：
◆ 序列联配
Blastn， Blastx
◆ 蛋白质功能域搜索(二结构比对) Pfam Interproscan
EST sequences
常 用 的 基 因 注 释 流 程
Nr Blastx
无理想匹配
较好匹配
完成注释
后
较好匹配
Nt Blastn
二、序列测定及数据分析
随机挑取克隆进行5’或3’端测序
序列前处理
聚类和拼接
基因注释及功能分类
后续分析
EST软件平台
EST序列
库/序列的质量检查
测序量监控
全长ORF寻找
发现全长基因
聚类和拼接检查 （借助于基因组信息）
交替剪接检测
EST特有信息
表达量分析
功能分类
研究表达基因概况的主要实验手段 （DNA chip、proteomics的先驱）
转录组学的研交：cDNA芯片（GeneChip，microarr 呈互补的碱基序列的单链 DNA即complementary DNA之缩写。
• 以mRNA为模板，经反转录 酶在体外反转录成cDNA， 与适当的载体（常用噬菌体 或质粒载体）连接后转化受 体菌，则每个细菌含有一段 cDNA，并能繁殖扩增，这 样包含着细胞全部mRNA信 息的cDNA克隆集合称为该 组织细胞的cDNA。◆计算机批量处理
利用标准基因词汇体系Gene Ontology，进行近似的分类(分 子功能、生物学过程、分子组分)。 (/) 基因产物直系同源簇的分析（COG：Cluster of Orthologous Groups of proteins ）
Integrated Chips
Ø
整合型芯片
Integrated uF, microarray and detection chips with PCR, fluorescence or e-detection
基因芯片的探针
基因芯片的杂交实验
Year
● 1993年前EST数据收录于GenBank， EBI和DDBJ。 ● 1993年NCBI(National Center of Biotechnology Information)建立了一 个专门的EST数据库dbEST来保存和收集所有的EST数据。 ● 95年中期GenBank 中EST的数目超过了非EST的数目。 ● 现在GenBank中EST的数目已经超过了三千五百万，约占GenBank中 序列数的60%.
转录组学基本研究方法
陈军 chenjun@ 2011.5.10
上堂课内容
• mRNA检测技术
– 核酸杂交技术 – 原位杂交 – 逆转录PCR (Reverse transcription PCR，RT-◆
(/COG/)
表1：家猪脂肪组织的已知基因功能分类
表2：猪脂肪组织与猪胚胎胸腺组织和猪甲状腺组织表达谱的比较
参考文献：1、猪脂肪组织表达序列标签（ESTs）大规模测序及分析 邓亚军等，遗传学报，Vol.31, NO.11, 2004 2、两种家猪心脏组织基因表达谱的分析 曾燕舞等，遗传学报，Vol.31, No.6, 2004
EST的代谢途径分析(KEGG)
http://www.genome.ad.jp/kegg/
后续分析
◆ ◆ ◆ ◆ ◆
比较基因组学分析
基因表达谱分析
新基因研究 基因可变剪切分析 实验验证
►
MicroArray
►
► ►
GeneChip
RT－PCR Northern blotting
EST数据的不足
◆ EST很短，没有给出完整的表达序列； ◆ 低丰度表达基因不易获得； ◆ 由于只是一轮测序结果，出错率达2%-5%； ◆ 有时有外源的mRNA污染或是基因组DNA的污染； ◆ 有时出现镶嵌克隆； ◆ 序列的冗余，导致所需要处理的数据量很大。
基因芯片
不同的生物芯片技术平台
Spotted Microarrays
28S rRNA 18S rRNA
B. WITEK-ZAWADA,2003
原位杂交1
• FISH：Fluorescence In Situ Hybridization
原位杂交3
Moroz LL, 2006
逆转录(Reverse transcription)
• 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚 合酶。这种酶是 1970 年美国科 学家特明 (H. M. Temin) 和巴尔的 摩 (D. Baltimore) 分别于动物致癌 RNA 病毒中发现，他们并因此获 得 1975 年度诺贝尔生理学或医 学奖。
全长 cDNA文 库构建
EST
• 90年代初Craig Venter 提出了EST的概念，并测 定了609条人脑组织的EST，宣布了cDNA大规模 测序的时代的开始 (Adams et al., 1991)。
• EST（Expressed Sequence tags，表达序列标 签 ）是从已建好的cDNA库中随机抽取克隆，从5’ 末端或3’末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自 动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。
● 在同一物种中搜寻基因家族的新成员(paralogs)。 ● 在不同物种间搜寻功能相同的基因(orthologs)。 ● 已知基因的不同剪切模式的搜寻。【注：不过很难确 定一个新的序列是由于交替剪切产生的或是由于cDNA文 库中污染了基因组DNA序列(Wolfsberg et al., 1997)】
核酸杂交
northern blot
探针制备
• 放射性同位素标记物
α-32P-dCTP 灵敏度达0.01pg
• 非放射性标记物
地高辛 灵敏度达0.1pg DIG-dUTP-----通过酶促反应掺入到DNA/RNA中去 制成探针----杂交----加抗地高辛-酶的复合物— 加底物—显色
探测不同条件下的基因表达变化
SAGE的先驱
测序方向的选择
根据不同的实验目的选择不同的测序方向：
◆
5 ’端
5’上游非翻译区较短且含有较多的调控信息。一般在寻找新基 因或研究基因差异表达时用5’端EST较好，大部分EST计划都是选 用5’端进行测序的，而且从5’端测序有利于将EST拼接成较长的基 因序列。
◆
3 ’端
3’端mRNA有一20－200bp的plyA结构，同时靠近plyA又有特异性 的非编码区，所以从3’端测得EST含有编码的信息较少．但研究也 表明，10％的mRNA3’端有重复序列，这可以作为SSR标记；非编码 区有品种的特异性，可以作为STS标记．
Growth of dbEST 40
Number of ESTs (millions)
35 30 25 20 15 10 5 0
19 93 19 94 19 95 19 96 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01 20 02 20 03 20 04 2 1- 0 05 Ju n06
EST相关数据库
储存EST原始数据的一级数据库
◆ EMBL ◆ GenBank (dbEST) ◆ DDBJ
对EST进行聚类拼接的二级数据库
◆ UniGene (/UniGene) ◆ TIGR Gene Indices (/tdb/tgi/)
● Digital Gene Expression Displayer (DGED)
● cDNA xProfil规模分析基因表达水平
因为EST序列是从某特定组织的cDNA中随机测序而得到，所以可以用利 用未经标GAP 为研究癌症的分子机理，美国国家癌症研究所NCI的癌症基因组解析计 划(Cancer Genome Anatomy Project , CGAP)构建了很多正常的或容
• Real-time PCR • 转录组学基本研究方法
– 概念 – 基于测序的转录组学的转录组学方法
• 基因芯片 • 生物信息学分析
Real-time PCR 基本原理
• Ct：threshold cycle
SYBR-Green荧光染料标定dsDNA