转录组分析(RNA-Seq)
转录组测序
转录组测序（RNA-seq）是指利用高通量测序技术对cDNA进行测序从而获取不同mRNA 片段在特定样本里的含量。
通过统计相关读段(reads)数计算出不同RNA的表达量，发现新的转录本；如果有基因组参考序列，可以把转录本映射回基因组，确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息。
RNA-seq广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等。
在功能基因组学方面的应用：基因（转录本）精细结构，各种器官表达模式，不同发育阶段的表达模式；在癌症和疾病方面：SNPs，选择性剪切，可选启动子，等位基因差异表达，RNA编辑，融合基因；农业和微生物方面：动植物疾病，微生物致病机理，分子育种，作物抗性研究；等等。
服务内容
RNA测序
客户提供
足够的组织材料或者RNA样品。
我们提供
测序结果、报告。
RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理
RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤：1.建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。
2.测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。
深度为10-30 Million reads。
）3.分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。
大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。
我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。
这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。
首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。
接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。
再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。
然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。
再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。
对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对）在双链cDNA的两端加分别上Y型接头再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。
这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。
也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。
因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。
RNA-SEQ原理及应用
差异表达基因的鉴定
差异表达基因的鉴定是指通过比较不同条件或状态下基因的表达水平，找出表达有显著差异的基因。
这些差异表达基因可能涉及到特定的生理或病理过程，通过对这些基因的深入研究，有助于发现新的 药物靶点或疾病标记物。
疾病预后评估与预测
预后评估
通过rna-seq技术对患者的基因表达谱进行分析，可 以评估疾病的预后情况，为临床医生制定治疗方案提 供参考。
预测复发风险
rna-seq技术可以预测肿瘤等疾病的复发风险，有助 于临床医生制定更加合理的随访计划和干预措施。
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转录本组装
将测序得到的短读段组装成完整的转录本序 列，有助于理解基因的表达和调控机制。
基因结构变异分析
基因结构变异
rna-seq可以检测到基因结构变异， 包括基因融合、倒位、易位等。
变异分析
通过对测序数据的深度分析，可以鉴 定出基因结构变异，并研究其对基因 表达和功能的影响。
基因融合检测
基因融合
该技术利用了下一代测序技术，将RNA样本进行逆转录处理，生成cDNA，再通过测序获得每个基因的 序列信息。
rna-seq技术可以检测到低丰度的转录本，并且能够精确地定量基因表达水平，为研究基因的表达调控 提供了有力工具。
rna-seq技术流程
逆转录
将RNA信息。
样本准备
提取样本中的RNA、 PCR扩增等步骤，构建测序文 库。
数据处理
对测序数据进行质量控制、序 列比对、基因表达量计算等处 理。
rna-seq技术的优势与局限性
转录组分析(RNA-Seq)-PPT文档资料
Random hexamer primed cDNA synthesis
Paired-end
Solexa Sequencing
-6- dT微珠纯化mRNA ������ mRNA片段化处理 ������ 反转录反应合成合成双链cDNA ������ 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’ ������ 使用特定的测序接头连接DNA片 段两端
转录组分析（RNA-Seq）
• 李江攀
RNA-Seq 的技术背景 RNA-Seq 的应用领域 RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
数字表达谱与芯片的比较
特点
数字化信号 高通量 可重复性高 无需重复实验 检测低丰度基因 检测新转录本 检测反义链转录本
数字表达谱
√ √ √ √ √ √ √
芯片
√
Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双 重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。Βιβλιοθήκη RNA-Seq 的发展前景
rnaseq数据分析流程
rnaseq数据分析流程RNA-seq数据分析流程。
RNA测序（RNA-seq）是一种用于研究转录组的高通量测序技术，它可以帮助科研人员了解基因表达和转录本结构。
在本文中，我们将介绍RNA-seq数据分析的一般流程，包括数据预处理、基因表达分析和功能注释等步骤。
1. 数据预处理。
首先，我们需要对原始的RNA-seq数据进行质量控制（QC）。
这包括使用软件如FastQC来评估测序数据的质量，检测是否存在低质量的碱基或测序错误。
接下来，我们需要对数据进行去除接头（adapter trimming）和过滤低质量读（quality filtering）。
这些步骤可以使用工具如Trimmomatic或Cutadapt来完成。
最后，我们需要对清洗后的数据进行比对到参考基因组（alignment），这可以使用软件如HISAT2或STAR来完成。
2. 基因表达分析。
一旦我们获得了比对到参考基因组的数据，我们就可以开始进行基因表达分析。
首先，我们需要对比对结果进行计数，这可以使用软件如featureCounts或HTSeq来完成。
然后，我们需要对表达数据进行标准化，例如使用DESeq2或edgeR来进行基因表达的差异分析。
最后，我们可以使用一些可视化工具如ggplot2或heatmap 来展示基因表达的模式和差异。
3. 功能注释。
最后，我们可以对不同表达的基因进行功能注释。
这包括对差异表达基因进行富集分析（enrichment analysis），例如富集在特定的通路（pathway）或生物学过程（biological process）中。
这可以使用工具如DAVID或Enrichr来完成。
此外，我们还可以对差异表达基因进行蛋白质-蛋白质相互作用分析（protein-protein interaction analysis），例如使用STRING数据库来预测蛋白质之间的相互作用网络。
总结。
综上所述，RNA-seq数据分析是一个复杂的过程，涉及到数据预处理、基因表达分析和功能注释等多个步骤。
rnaseq 转录组测序实验方案
rnaseq 转录组测序实验方案RNA测序（RNA-Seq）是一种新兴的高通量测序技术，可用于研究转录组的整体表达特征和mRNA表达数量的变化。
本文将讨论RNA 测序实验方案，包括样品处理、测序方法和数据分析。
一、样品处理在进行RNA测序实验之前，需要注意以下几个步骤：1. 样品收集：从研究对象中收集组织样品或细胞，注意采集得到的RNA是代表性的并且不受任何处理的影响。
2. RNA提取：使用合适的方法提取总RNA或mRNA。
总RNA适用于研究全转录组表达水平的变化，而mRNA主要用于研究特定基因的表达。
二、测序方法RNA测序通常分为以下几个步骤：1. 文库制备：将RNA样品转录为cDNA，进行文库建立。
可以使用聚合酶链反应（PCR）扩增cDNA，以增加测序信号。
2. 测序平台选择：根据实验需求和预算，选择合适的测序平台，如Illumina HiSeq、Ion Torrent或PacBio等。
3. 测序深度：根据样品复杂度和研究目的，确定所需的测序深度。
较低的深度适用于检测高表达基因，而较高的深度适用于检测低表达基因或罕见突变。
三、数据分析RNA测序数据分析是整个实验的重要环节，以下是常用的数据分析步骤：1. 数据质控：使用质控工具（如FastQC）对测序数据进行质量评估，去除低质量的reads和接头序列。
2. 游离核酸去除：使用工具（如Trimmomatic）去除rRNA或tRNA 等非编码RNA。
3. 序列比对：使用参考基因组进行序列比对，如使用Bowtie、BWA等工具。
对于未知基因组，可选择进行de novo组装。
4. 表达差异分析：通过比较每个基因在不同样品中的表达量，确定差异表达基因。
常用的工具包括DESeq、edgeR等。
5. 功能注释：将差异表达基因进行功能注释，了解其在生物学过程中的作用。
可以使用GO、KEGG等数据库进行注释。
6. 数据可视化：将分析结果通过图表或热图进行可视化，更直观地展示差异表达基因和通路的变化。
rna-seq转录组的测序技术
RNA-seq转录组的测序技术一、概述1. RNA-seq技术简介在过去的几十年中，研究人员利用转录组学技术对生物体中的RNA 进行研究，以揭示基因表达调控和基因功能等方面的信息。
而RNA-seq技术则是近年来兴起的一种高通量测序技术，逐渐替代了传统的microarray技术，成为了研究转录组学的主流方法之一。
二、RNA-seq的原理1. 测序库构建在进行RNA-seq实验之前，首先需要构建测序库。
通常采用聚合酶链式反应(PCR)或者DNA和RNA的逆转录(Reverse Transcription)来将RNA转录成双链DNA，并添加barcode标签，最后形成文库。
2. 高通量测序完成测序库的构建后，需要使用高通量测序技术对文库中的DNA 进行测序。
目前常用的测序评台包括Illumina、Ion Torrent、PacBio 等公司的测序仪器。
高通量测序技术能够快速、高效地获取大量的基因序列信息。
三、RNA-seq的优势1. 高灵敏度与传统的microarray技术相比，RNA-seq能够提供更高的灵敏度和动态范围，能够检测到低表达水平的基因，同时也能够覆盖更广泛的基因组区域。
2. 高分辨率RNA-seq能够提供单个碱基的分辨率，帮助研究人员更准确地识别基因的外显子、内含子和剪切异构体。
3. 无需先验信息相比于microarray技术需要先知道待检测基因的序列信息，RNA-seq技术能够在不依赖已知基因组信息的情况下进行测序。
四、RNA-seq的应用1. 基因表达水平分析RNA-seq能够帮助科研人员进行基因表达水平的定量和定性分析，揭示基因在不同组织、不同环境条件下的表达规律。
2. 剪切异构体分析通过RNA-seq技术可以发现和识别基因的各种剪切异构体，帮助了解基因的调控机制。
3. RNA编辑和融合蛋白质的细致分析RNA-seq技术也被广泛应用于RNA编辑和融合蛋白质的研究，为研究人员提供了一种便捷的方法。
转录组测序名词解释
转录组测序，也被称为RNA-Seq，是一种高通量的测序技术，用于研究细胞中所有转录本的表达情况。
这项技术可以提供关于基因表达、基因变异、基因调控等重要生物学过程的信息。
在转录组测序中，首先从细胞中提取RNA，然后将其转化为测序文库。
这个文库包含从RNA中提取的基因序列信息，这些信息随后被大规模并行测序。
每个测序读段代表一个转录本的一部分或全部序列。
通过对这些读段的深度分析，研究人员可以确定哪些基因在特定条件下被表达，哪些基因的表达水平有所改变。
此外，转录组测序还可以揭示基因拼接变异、基因融合以及其他重要的基因结构变异。
转录组测序是基因表达研究的重要工具，因为它提供了定性和定量的基因表达信息。
这项技术已经被广泛应用于各种生物学研究领域，包括疾病机制研究、药物开发、生物进化研究等。
例如，在疾病机制研究中，转录组测序可以帮助科学家了解疾病发生和发展过程中基因表达的变化，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路。
在药物开发中，通过比较药物处理前后的转录组变化，可以确定药物的作用机制和潜在的副作用。
总的来说，转录组测序是一种强大的工具，它让我们能够深入了解细胞的基因表达模式，为生物医学研究提供了重要的信息。