猪瘟检测方法
一、非洲猪瘟现场快速检测实验操作规程
一、非洲猪瘟现场快速检测实验操作规程本规程推荐的检测程序、仪器设备和试剂等可作为非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的一般性指南，用户可根据实验室需求选择仪器设备型号及耗材，优化最佳的检测程序。
1 样品处理1.1试验材料：待检样品为采集的猪全血，非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒（缓冲液B1和缓冲液B2）。
1.2 设备与材料：小型离心机，涡旋振荡器，100μl移液器，吸头，1.5ml离心管。
1.3 操作步骤血液混样操作：可将5份猪全血进行混样，每份血样取10μl于离心管后，涡旋振荡混匀，即为混样。
取10μl单样或混样新鲜抗凝全血加入100μl的缓冲液B1中，室温消化3分钟，涡旋混匀3~5次。
向上述混合液中加入100μl的缓冲液B2（恢复至室温并混匀使用），涡旋混匀，12000转/分钟离心1分钟，上清为PCR待检核酸，取2μl PCR待检核酸进行PCR反应。
如在2小时内检测则PCR待检核酸置于4℃保存，否则置于﹣20ºC以下冰箱保存。
2 PCR反应2.1 试验材料：待检样品为PCR待检核酸，非洲猪瘟病毒荧光定量PCR快速检测试剂盒（PCR反应液、反应阳性对照和阴性对照）2.2 设备与材料：荧光定量PCR仪，掌式离心机，20μl移液器，10μl移液器，吸头，荧光定量PCR反应管，乳胶手套，口罩。
2.3 操作步骤扩增试剂准备：每个反应的体积为20μl。
根据检测样品数量每个反应管加入18μl PCR反应液。
依次取2μl阴性对照、PCR待检核酸、反应阳性对照到PCR反应管中。
PCR反应：加样后，将PCR管置于荧光定量PCR仪内进行如下反应：1）95ºC预变性20秒；2）95℃变性10秒，58℃延伸20秒，共40个循环；设置58℃收集FAM荧光信号。
判定结果的有效性：阳性对照应出现特异性扩增曲线且Ct值＜35，阴性对照无特异性扩增曲线或无Ct值。
当样品的扩增结果有典型的扩增曲线且Ct 值<40时可判定为阳性（强阳性样本的Ct 值<30）。
非洲猪瘟实验室检测流程
非洲猪瘟实验室检测流程非洲猪瘟是一种高度传染性的猪病，严重危害猪类养殖业。
为了及早发现、确诊和控制非洲猪瘟，需要进行实验室检测。
下面是非洲猪瘟实验室检测流程的详细介绍。
1.采集样品：样品采集是非洲猪瘟实验室检测的第一步。
常见的样品包括猪体组织、血液、粪便、呼吸道分泌物等。
采集时需要遵守无菌操作规范，确保样品的纯净度和准确性。
2.样品预处理：采集到的样品通常需要经过预处理，以提取出样品中的病毒或基因组等重要信息。
不同样品的预处理方法可能有所不同。
例如，血液样品通常需要进行离心分离血浆或血清，粪便样品需要进行离心沉淀，猪体组织样品需要进行玻璃化处理等。
3.样品提取：样品提取是为了从复杂的样品中分离出非洲猪瘟病毒或病原体的核酸。
常见的提取方法包括酚-氯仿法、磁珠法、柱子法等。
提取过程中需要注意避免污染和交叉感染，保证提取的纯度和质量。
4.质检：提取的样品需要进行质检，以确保提取效果和所需浓度。
常见的质检方法包括核酸定量、质量评估、纯度检测等。
质检结果必须满足实验要求才能进一步进行后续检测。
5.PCR扩增：PCR（聚合酶链式反应）是非洲猪瘟实验室检测的主要方法之一、通过PCR扩增病毒或病原体的核酸序列，可以高效地检测非洲猪瘟。
PCR扩增反应包括反应液配置、扩增程序设定和实验仪器操作等。
PCR扩增结果可以通过凝胶电泳等方法进行可视化分析。
6.实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR是一种检测非洲猪瘟的快速敏感方法。
其原理是在PCR扩增过程中实时检测荧光信号的增加量，以判断样品中病毒数量的多少。
实时荧光定量PCR需要选择合适的引物和探针，并进行标准曲线建立和结果分析。
7.ELISA检测：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学检测方法。
通过特异性抗体的识别与结合，可以检测非洲猪瘟病毒的抗原或抗体。
ELISA检测方法包括抗原捕获ELISA和抗体间接ELISA等，具体的操作步骤需要根据实验需求进行选择。
8.核酸测序：核酸测序是对非洲猪瘟病毒基因组进行全面分析的方法。
非洲猪瘟病原学检测方法
非洲猪瘟病原学检测方法介绍非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种高致病性的猪病，对于猪养殖业来说是一种严重威胁。
为了及时有效地进行疫情监测和病原学分析，科学家们发展了多种非洲猪瘟病原学检测方法。
本文将对这些检测方法进行详细的探讨。
PCR方法传统PCR1.样品收集：从患病猪只的脾脏、淋巴结或血液中收集样品。
2.DNA提取：使用DNA提取试剂盒将样品中的DNA提取出来。
3.PCR反应体系：设置PCR反应体系，其中包括引物、模板DNA、酶和缓冲液。
4.PCR扩增程序：设定PCR扩增程序，包括一系列不同温度的循环反应。
5.结果分析：利用凝胶电泳的方法，观察PCR产物的大小。
实时定量PCR1.样品收集和DNA提取：与传统PCR相同。
2.PCR反应体系：与传统PCR相同，但引入了荧光探针。
3.实时定量PCR程序：设定实时定量PCR程序，包括多个不同温度的循环反应。
4.数据分析：根据荧光信号的强度和阈值周期数，计算出病毒数量。
优点•灵敏度高：PCR方法能够检测到非洲猪瘟病原体的极低浓度。
•特异性强：引物的设计使得PCR方法能够区分非洲猪瘟病原体和其他相关病原体。
•快速性：PCR方法可以在短时间内得到结果。
缺点•对实验操作要求高：PCR方法需要精确计量样品和试剂。
•易受污染：PCR方法容易受到外部环境中目标DNA的污染。
•不适合现场应用：PCR方法的设备和试剂有一定的成本，不适合一些资源有限的地区。
ELISA方法直接ELISA1.样品准备：从患病猪只的血液中收集样品。
2.酶标板涂层：将非洲猪瘟病毒的抗原涂在酶标板上。
3.样品加入：将已稀释的血清样品加入到酶标板中。
4.洗涤步骤：用洗涤缓冲液洗涤酶标板，去除未结合的抗体。
5.反应步骤：加入与非洲猪瘟病毒抗体标记的酶联二抗。
6.洗涤步骤：洗涤酶标板，去除未结合的酶联二抗。
7.显示步骤：加入底物，使酶与底物反应产生可见的颜色。
8.终止反应：加入终止液停止酶的反应。
非洲猪瘟怎么检测,潜伏几天才发现
非洲猪瘟怎么检测，潜伏几天才发现1、免疫电泳试验：抗原于待检血清间出现白色沉淀线者为阳性。
2、直接免疫荧光试验：在荧光显微镜下观察细胞，若细胞浆内有明亮的荧光团，则为阳性。
3、间接酶联免疫蚀斑试验：直接用肉眼观察蚀斑，若颜色为棕色，则表示为阳性。
4、酶联免疫吸附试验：对照成立后，若待检样品的吸收值大于0.3，则可以判定为阳性。
一、非洲猪瘟怎么检测1、免疫电泳试验若抗原于待检血清间出现白色沉淀线，则为阳性。
2、直接免疫荧光试验在荧光显微镜下观察细胞，如果发现细胞浆内有明亮的荧光团，则表示为阳性。
3、间接酶联免疫蚀斑试验直接用肉眼（或使用显微镜）观察蚀斑，若颜色是棕色，则表示为阳性，没有颜色则表示为阴性。
4、酶联免疫吸附试验对照成立后（阳性血清对照吸收值＞0.3，阴性血清吸收值＜0.1），若待检样品的吸收值＞0.3，则可以判定为阳性。
5、红细胞吸附试验将健康猪的白细胞加上病猪的血液（或组织提取物）放在37°C 的环境中培养，若观察到大量的红细胞吸附于白细胞上面形成玫瑰花状（或桑椹体状），则表示为阳性。
6、间接免疫荧光试验在长满Vero细胞的盖玻片上接种非洲猪瘟病毒，并准备未接种病毒的Vero细胞对照。
试验后若对照正常，待检样品在细胞浆内出现明亮的荧光团和荧光细点，则可以判定为阳性。
二、非洲猪瘟潜伏几天才发现1、非洲猪瘟的潜伏期（1）一般情况下，非洲猪瘟的潜伏期为4-19天左右，潜伏期的长短与病毒的毒力、被感染猪群的抗病能力等因素有关。
（2）非洲猪瘟病毒的毒力可分为3个等级，即低毒力（潜伏期最长，发病最晚，可造成慢性、亚急性或不明显的发病）、中等毒力（潜伏期中等，临床症状有所减轻，会造成慢性或不明显症状）、强毒力（潜伏期较短，临床会表现出急性症状，而且病猪的皮肤上会出现出血点，并伴有厌食或呕吐、体温升高的情况，病死率达到100%）。
2、防控方法（1）避免外来人员、车辆、其他动物进入养殖场，场内的用具、饲料都要严格消毒。
非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法
非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法1、范围本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。
本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。
2、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3、试剂3.1DNA提取试剂DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。
3.2 2 × PCR缓冲液2 × PCR缓冲液的配制见附录A。
3.3引物探针3.3.1采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'3.3.2可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'下游引物ASF-OIE-rPCRR：5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'荧光探针ASF-OIE-Probe：5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'3.3.3使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。
猪瘟传染病实验猪瘟诊断技术
实验任务
每组检测6份血清样品，来自两个不同批次疫苗免疫的同 一ห้องสมุดไป่ตู้群，评价免疫效果。
试验器材：
酶标仪 试剂盒 待测血清 加样器 温箱 去离子水 吸水纸 手套
结果判定
OD450nm≥ 0.15；判定为CSFV-IgG阳性。 OD450nm＜ 0.10；判定为CSFV-IgG阴性。 阴性对照血清A值应小于0.10，阳性对照血清A值应大于
0.70，否则试验不成立。 未感染也未免疫猪瘟疫苗的健康猪瘟为阴性。 该试验CSFV-IgG值，不能区别疫苗接种和野毒感染。
猪瘟诊断技术
家畜疫病学 实验六 2011-12
实验目的
熟练掌握猪瘟抗体ELISA检测方法。 结合临床资料、免疫程序解释ELISA结果。
实验材料
CSFV抗原包被板 酶标记物 样本稀释液 洗涤液 CSFV-IgG阴性对照血清 CSFV-IgG阳性对照血清 显色剂A 显色剂B 终止液 盖板膜
方法步骤
加样：设阴、阳性对照各2孔，分别加入不稀释的阴、阳性对照血清 100μL ,待检样品孔加100μL样本稀释液和10μL血清。
温育：震荡10s，置37℃ 温育30m。 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗涤5次，每次停留1分钟，最后一次
洗后拍干。 加酶：每孔加酶标记物100μL。 温育：置37℃ 温育30m。 洗涤：同上。 显色：每孔加入A/B显色剂各50μL，震荡混匀， 37℃ 避光反应15m。 终止：每孔加入终止液50μL，震荡10s，充分混匀。5m内读数。 读数：酶标仪检测波长设置为450nm。
猪瘟诊断技术
三、病理变化
急性和亚急性猪瘟病变以多发性出血为 特征。淋巴结水肿、出血，呈现大理石 病变。肾脏呈土黄色，皮质表面可见针 尖状出血点。全身浆膜、粘膜和心脏、 膀胱、胆囊均可见出血点和出血斑，脾 脏边缘出现梗死灶。慢性猪瘟在回肠末 端、盲肠和结肠常见特征性的纽扣状溃 疡。
四、实验室诊断
（一）样品采集、包装与运输按照 《兽 医实验室生物安全技术管理规范》执行。 （二）病原分离鉴定
二、临床症状
本病潜伏期一般为3-5天，最长可达30天， 隐性感染可长期带毒。 本病可分为急性、亚急性、慢性和隐性 感染四种类型。
急性猪瘟 发病快，体温通常升至41℃ 以上。结膜炎、厌食、畏寒、先便秘后 腹泻等症状。数天后，腹部皮下、鼻镜、 耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑点， 指压不褪色，眼结膜和口腔粘膜可见出 血点。死亡率高达90%，大多在1-2周内 死亡。
2、猪瘟荧光抗体染色法
荧光抗体染色法快速、特异，可用于检 测扁桃体等组织样品以及细胞培养中的 病毒抗原。操作程序如下：
1 样品的采集和选择 活体采样：利用扁桃体采样器（鼻捻子、 开口器和采样枪）。采样器使用前均须 用 5% 氢氧化钠溶液消毒后经清水冲洗。 首先固定活猪的上唇，用开口器打开口 腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌 牙签挑至灭菌离心管并作标记。 其它样品：剖检时采取的病死猪脏器， 如扁桃体、肾脏、脾脏、淋巴结、肝脏 和肺等脏器，或病毒分离时待检的细胞 玻片。 样品采集、包装与运输按《兽医实验室 生物安全技术管理规范》执行。
亚急性猪瘟 症状类似急性型，但较轻。 慢性猪瘟 主要表现为皮肤出血斑点和 耳尖坏死。病猪食欲减退，生长停滞和 贫血，出现周期性发热和腹泻，病程通 常在1个月以上，病猪难以完全康复，常 成为僵猪。
生猪屠宰检疫中猪瘟检验检疫方式与处理方法
生猪屠宰检疫中猪瘟检验检疫方式与处理方法在生猪屠宰检疫过程中，猪瘟检验检疫是非常重要的环节。
猪瘟是一种由病毒引起的猪类传染病，病死率高，传染性强，对于猪场和养猪业来说，是一种极具威胁性的疾病。
对生猪屠宰检疫中的猪瘟检验和处理方法有着非常严格的要求。
一、猪瘟检验检疫方式1. 临床症状观察：在生猪屠宰检疫过程中，首先要对猪的临床症状进行观察。
猪瘟的临床症状表现为发热、食欲不振、呕吐、腹泻、呼吸困难等，同时还会出现皮肤发绀、眼结膜充血、腹部水肿等症状。
通过对猪的临床症状进行观察，可以初步判断是否存在猪瘟感染。
2. 血清学检测：血清学检测是一种比较常用的猪瘟检验方法。
通过对猪的血清样本进行检测，可以发现猪体内是否存在猪瘟病毒的抗体。
这种方法不仅可以用于早期诊断，还可以用于对猪瘟疫情的监测和控制。
3. 分子生物学检测：分子生物学检测是一种高灵敏度和高特异性的检测方法，可以快速、准确地检测出猪瘟病毒的存在。
通过PCR技术对病毒基因进行检测，可以在短时间内确定猪体内是否存在猪瘟病毒。
这种方法在猪瘟疫情的早期控制和病原学研究中有着非常重要的作用。
1. 隔离治疗：一旦发现猪群中存在疑似猪瘟感染的病例，应立即进行隔离治疗。
将疑似感染猪隔离在专门的隔离病房内，对病猪进行治疗和观察，同时对猪舍和器具进行消毒处理，防止病毒的传播和扩散。
2. 消毒措施：猪瘟病毒对消毒剂有一定的抵抗力，因此在进行消毒处理时要选择合适的消毒剂。
一般来说，酚酞和漂白粉是比较常用的消毒剂，可以有效地杀灭病毒。
在对猪舍和器具进行消毒处理时，要严格按照标准的操作程序进行，确保每个角落都受到消毒。
3. 疫区封锁：一旦发生猪瘟疫情，应立即对疫区进行封锁，禁止疫区内动物和动物产品的流通。
同时要对疫区内的人员、车辆、物品进行严格的消毒处理，防止病毒的传播。
对于疫区外的动物和动物产品，也要进行严格的监测和检疫，以防止病毒的扩散。
4. 紧急扑杀：在疫情严重的情况下，可以采取紧急扑杀措施，对病猪和潜在感染的猪进行集中扑杀，以防止病毒的进一步传播。
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猪瘟检测方法
猪瘟间接血凝试验操作方法
（一）试验材料
1．96孔110~120°V型医用血凝板
2．10~100微升可调微量移液器
3．塑料咀
4．猪瘟间接血凝抗原（猪瘟正向血凝诊断液），每瓶5毫升，可检测血清25~30头份
5．阳性对照血清，每瓶2毫升；阴性对照血清，每瓶2毫升6．稀释液每瓶10毫升
7．待检血清每份0.2~0.5毫升（56℃水浴灭活30分钟）
（二）操作步骤
1．检测前，应将冻干诊断液，每瓶加稀释液5毫升浸泡7~10天后方可应用。
2．稀释待检血清：在血凝板上的第1孔~第6孔各加稀释液50微升。
吸取待检血清50微升加入第1孔，混匀后从中取出50微升加入第2孔，依此类推直至第6孔混匀后丢弃50微升，从第1孔——第6孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64。
3．稀释阴性和阳性对照血清：在血凝板上的第11排第1孔加稀释液60微升，取阴性血清20微升混匀取出30微升丢弃。
此孔即为阴性血清对照孔。
在血凝板上的第12排第1孔加稀释液70微升，第2——7孔各加稀释液50微升，取阳性血清10微升加入第1孔混匀，并从中取出50微升加入第2孔混匀后取出50微升加入第3孔……直到第7孔混匀后弃50微升，该孔的阳性血清稀释度为1：512。
4．在血凝板上的第1排第8孔加稀释液50微升，作为稀释液对照孔。
5．判定方法和标准：先观察阴性血清对照孔和稀释液对照孔，红血球应全部沉入孔底，无凝集现象（—）或呈（+）的轻度凝集为合格；阳性血清对照应呈（+++）凝集为合格。
在以上3孔对照合格的前提下，观察待检血清各孔的凝集程度，以呈“++”凝集的待检血清最大稀释度为其血凝效价（血凝价）。
血清的血凝价达到1：16为免疫合格。
“-”表示红细胞100%沉于孔底，完全不凝集
“+”表示约有25%的红细胞发生凝集
“++”表示50%红细胞出现凝集
“+++”表示75%红细胞凝集
“++++“表示90—100%红细胞凝集
6．注意事项
（1）勿用90°或130°血凝板，以免误判。
（2）污染严重或溶血严重的血清样品不宜检测。
（3）冻干血凝抗原，必须加稀释液浸泡7~10天，方可使用，否则易发生自凝现象。
（4）用过的血凝板，应及时冲冼干净，勿用毛刷或其他硬物刷洗板孔，以免影响孔内光洁度。
（5）使用血凝抗原时，必须充分摇匀，瓶底应无血球沉积。
（6）液体血凝抗原4~8℃贮存有效期四个月，可直接使用。
冻干血凝抗原4~8℃贮存有效期三年。
（7）如来不及判定结果或静置2小时结果不清晰，也可放置第2天判定。
（8）每次检测，只设阴性、阳性血清和稀释液对照各1孔。
（9）稀释不同的试剂要素时，必须更换塑料咀。
（10）血凝板和塑料咀洗净后，自然干燥，可重复使用。
(李树春)
猪瘟病毒强弱毒鉴别诊断ELISA操作方法
（一）试验材料
1．猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原和猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原，分别供检测经猪瘟弱毒疫苗免疫后产生的抗体和感染猪瘟强毒后产生的抗体之用。
2．酶标抗体
3．猪瘟阳性、阴性血清
4．酶联板及其他必要的试剂。
（二）操作步骤
1．用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各作100倍稀释，以100微升分别加入做好标记的酶联板孔中，置湿盒于4℃过夜。
2．弃去孔内液体。
用洗涤液冲洗酶联板3次，每次间隔3~5分钟，拍干。
3．用稀释液将待检血清作400倍稀释，每孔加100微升。
同时，将猪瘟阳性、阴性血清以100稀释作对照，37℃培育1.5~2小时。
4．重复第2步。
5．用稀释液将兔抗猪IgG—辣根过氧化物酶结合物作100倍稀释，每孔加入100微升，37℃培育1.5~2小时。
6．重复第2步。
7．每孔加入底物溶液（每块板所需的底物溶液按邻苯二胺5毫克+底物缓冲液5毫升+30%过氧化氢18.75微升配制）100微升，室温下观察显色反应（一般阴性对照孔略微显色，立即终止反应，并以阴性孔作空白调零）。
8．每孔加入终止液50微升，于酶联读数仪上测定490nm波长的光密度（OD）。
（三）判定标准
在猪瘟弱毒酶联板上：OD>0.2为猪瘟弱毒抗体阳性
OD<0.2为猪瘟弱毒抗体阴性
在猪瘟强毒酶联板上：OD≥0.5为猪瘟强毒抗体阳性
OD<0.5为猪瘟强毒抗体阴性
（四）注意事项
1．运输单抗纯化酶联抗原时，必须使用冰盒低温运输；猪瘟强弱毒单抗纯化酶联抗原在4℃保存6个月，在—18℃保存12个月。
2．配制洗涤液时，应使用新鲜蒸馏水或无离子水，每次洗板后，尽量不使孔中有残余液体，以免影响结果。
3．底物溶液应临用前配制，待邻苯二胺完全溶解于底物缓冲液后再加过氧化氢，混匀后立即加入孔中。
1．终止反应后，应立即读数。
(中国兽药监察所)
猪瘟反转录聚合酶链反应
1．材料准备：待检组织，匀浆器、氯仿、异丙醇、75%乙醇、生理盐水，RNA 提取试剂盒（Omega），RT-PCR试剂盒（TakaRa）等。
引物：扩增猪瘟病毒E2基因中585bp基因片段，由上海生物工程公司合成。
序列为：上游引物P1：5’—CCTGCAAGGAAGATCACACG—3’
下游引物P2：5’—CCGTGTAGGTCACTGGTTCA—3’仪器设备为：PCR扩增仪，电泳仪，凝胶电泳紫外检测仪。
2．操作步骤
2．1 样品采集：动物病死或扑杀后，取扁桃体、淋巴结和脾组织，-20℃冷藏。
2．2 样品处理：所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5生理盐水收集于离心管内，-70℃反复冻融三次，7000r/min，离心5分钟，取上清液。
2．3 RNA提取：依照Omega公司RNA提取试剂盒的操作程序提取总RNA。
2．4 RT-PCR操作程序：依照TakaRa公司的一步法RNA PCR试剂盒操作程序进行。
扩增条件为：50℃，反转录30分钟，94℃变性5分钟，进入循环，94℃ 50秒，72℃ 60秒，40个循环后72℃延伸10分钟。
3．RT-PCR产物检测：扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外光下与标准分子量比较，如见585bp片段，初步诊断为阳性。