非洲猪瘟实验室诊断
猪瘟的诊断与治疗
猪瘟的诊断与治疗猪瘟，又称非洲猪瘟，是一种严重的猪类传染病，由非洲猪瘟病毒引起，具有高度的传染性和致死性。
非洲猪瘟疫情一旦爆发，会给养猪业造成严重的损失，因此及时诊断和治疗非洲猪瘟是至关重要的。
本文将介绍非洲猪瘟的诊断与治疗方法，希望能对疫情的控制和预防提供一定的参考。
一、非洲猪瘟的临床症状非洲猪瘟的临床症状表现为发烧、食欲减退、呼吸急促、咳嗽、粘膜苍白、眼结膜充血、便秘或腹泻、发抖、步态异常、倦怠无力、瘙痒和出现皮肤溃疡等。
在高致病性非洲猪瘟毒株感染的猪场，猪群的致死率很高，可以达到100%，而在亚致病性非洲猪瘟毒株感染的猪场，猪的致死率约为50%左右。
二、非洲猪瘟的实验室诊断诊断非洲猪瘟主要依靠实验室检测。
病毒核酸检测是非洲猪瘟病毒的首选检测方法，包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）。
可通过检测猪血、猪脾、猪肾、猪淋巴结等组织和分泌物中的非洲猪瘟病毒抗原进行诊断。
采用Elisa试剂盒检测方法也可以诊断非洲猪瘟。
还可以通过病理学检查和流行病学调查等方法进行病例诊断。
三、非洲猪瘟的治疗方法目前尚无特效治疗非洲猪瘟的药物。
一旦猪患上非洲猪瘟，往往是病即死亡，因此预防非洲猪瘟的爆发更为重要。
在疫情暴发之前，猪场应加强疫病监测，及时发现问题并采取措施。
在加强猪舍卫生管理的基础上，并定期进行消毒和检疫。
还可使用灭活疫苗和减毒或重组疫苗进行预防性免疫。
在疫情暴发之后，应采取隔离和扑杀的措施，避免非洲猪瘟传播。
四、非洲猪瘟的防控措施对于非洲猪瘟的防控，首先要对猪场进行严密管控，建立猪场的卫生隔离圈。
对于非洲猪瘟高发地区应采取不同的防疫措施，比如封锁疫区、禁止活猪和猪产品交易等。
要提高猪场工作人员的防疫意识，加强技术培训和队伍建设。
对于非洲猪瘟的病死猪，应采取正确的处理方式，包括集中处理、消毒和安全掩埋等。
非洲猪瘟诊断标准
非洲猪瘟（African Swine Fever，简称ASF）是一种严重危害猪类的传染病，由非洲猪瘟病毒引起。
为了及时、准确地诊断和控制ASF，科学界制定了一系列诊断标准。
本文将详细介绍非洲猪瘟的诊断标准，以帮助读者更好地了解和应对该疾病。
一、临床症状非洲猪瘟的临床症状多种多样，但主要包括以下表现：1. 高热：感染猪体温可上升至40℃以上。
2. 精神沉郁：患猪精神状态差，食欲减退。
3. 溃疡性皮肤病变：患猪出现皮肤红肿、水泡、疱疹等溃疡性病变。
4. 出血倾向：眼结膜充血、鼻出血、消化道出血等。
5. 呼吸系统症状：咳嗽、喘息等。
6. 生殖系统症状：流产、胎儿死亡等。
二、实验室检测除了临床症状外，实验室检测也是非洲猪瘟诊断的重要手段。
常用的实验室检测方法有：1. 病毒分离与鉴定：通过采集患猪的组织样本，如脾脏、淋巴结等，利用细胞培养或动物接种等方法将病毒分离出来，并进行鉴定确认。
2. 血清学检测：采集患猪的血清样本，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）、凝集试验等检测猪体内的ASF抗体水平。
3. 分子生物学检测：采集患猪的血液、组织等样本，通过聚合酶链反应（PCR）等方法检测ASF病毒的核酸。
三、病理学改变非洲猪瘟在感染猪体内会引起一系列病理学改变，病理学检查可以提供诊断的重要依据。
主要的病理学改变包括：1. 脾脏肿大：感染后，猪的脾脏会明显增大，质地松软。
2. 淋巴结肿大：感染猪的淋巴结常出现肿大、充血等变化。
3. 出血灶：病理学检查可观察到患猪体内出现不同部位的出血点、出血斑等。
4. 内脏器官损害：感染后，猪的肝脏、肺脏等内脏器官可能发生病理学改变。
四、流行病学调查流行病学调查是了解非洲猪瘟传播情况和追踪病原的重要方法。
调查内容包括：1. 疫情调查：收集疫区的信息，统计患猪数量、死亡情况等。
2. 传播途径分析：调查可能造成病毒传播的因素，如动物运输、人员活动等。
3. 病毒来源追溯：通过流行病学调查，确定病毒的来源和传播途径。
非洲猪瘟检测试剂操作方法
非洲猪瘟检测试剂操作方法非洲猪瘟（African Swine Fever，简称ASF）是一种高度传染性疾病，对猪群健康和养殖业都造成了巨大损失。
为了迅速检测和诊断非洲猪瘟，科学家们开发了多种检测试剂。
下面将详细介绍非洲猪瘟检测试剂（包括PCR、ELISA和纸条快速检测试纸）的操作方法。
1. PCR检测方法：PCR（聚合酶链反应）是一种通过扩增病原体的特定基因片段来检测病原体的方法。
下面是非洲猪瘟PCR检测方法的步骤：a. 实验准备：- 准备PCR试剂盒，包括DNA提取试剂、PCR引物和酶。
- 准备PCR工作站和仪器（如PCR仪）。
- 防止污染，使用无菌器材和顶级实验室规范的操作。
b. 样本提取：- 取非洲猪瘟病畜体、组织或血液样本。
- 使用合适的试剂盒进行DNA提取，按照操作手册中的指示进行。
- 将提取的DNA储存到低温条件下，避免降解。
c. PCR扩增：- 准备PCR反应液，包括DNA模板、引物、dNTPs、酶和缓冲液。
- 按照PCR反应液体积的要求逐一加入反应管中。
- 定量PCR反应溶液，确保所有反应中的成分配比准确。
- 放入PCR仪中，按照所使用的引物设计好的程序运行PCR反应。
d. 结果分析：- 运行PCR反应后，获取PCR反应管。
- 将PCR产物经电泳分离，依据目标基因片段大小来判断是否存在非洲猪瘟病毒。
- 使用显色剂或转印装置对PCR产物进行直接检测。
- 分析PCR结果并记录，确认样本是否为非洲猪瘟阳性。
2. ELISA检测方法：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学检测方法，用于检测非洲猪瘟病毒的抗体或抗原。
下面是非洲猪瘟ELISA检测方法的步骤：a. 实验准备：- 准备ELISA试剂盒，包括抗体/抗原、酶标记物、底物等。
- 准备ELISA板（包括微孔板或膜）和读板机。
- 防止交叉污染，使用不同的器材和操作台进行样本分析。
b. 样本处理：- 取非洲猪瘟血清样本，通过离心等操作去除杂质。
猪瘟诊断技术国标
猪瘟诊断技术国标猪瘟，又称非洲猪瘟，是一种由非洲猪瘟病毒引起的严重传染病，也是目前全球范围内猪类养殖业面临的重大危机之一。
针对猪瘟的诊断技术的国际标准对猪瘟的诊断技术在疫情的控制和防治中起着重要的作用。
为了规范猪瘟的诊断技术，保障猪类养殖业的健康发展，各国在不同国际组织下积极开展了猪瘟诊断技术的标准制定工作。
下面将对猪瘟诊断技术的国际标准进行详细介绍。
1. 诊断样本的采集和处理猪瘟病毒主要存在于病猪的血液、组织和分泌物中，因此对于猪瘟的诊断需要采集患病猪的相关样本。
国际标准中通常规定了猪瘟诊断样本的采集、保存和运输方法，以确保样本的完整性和可靠性。
还包括了对于患病猪的处理要求，防止交叉污染。
2. 实验室诊断技术实验室诊断技术是猪瘟诊断的核心部分，国际标准对于猪瘟的实验室诊断技术进行了详细的规定。
其中包括了对于猪瘟病毒的检测方法、鉴定方法和鉴别方法，以及对于实验室设备和试剂的要求。
国际标准还规定了猪瘟诊断的结果判定准则和结果报告格式，确保诊断结果的准确性和可比性。
3. 质量管理体系为了确保猪瘟诊断技术的可靠性和准确性，国际标准通常还包括了对于实验室质量管理体系的要求。
这些要求包括了实验室设施和设备的管理、人员素质和能力的要求、实验室操作规范等，以确保诊断结果的可信度和稳定性。
4. 样品的保护国家对诊断结果的保护是非常重要的，因为这关系到疫情的控制和防治。
因此在国际标准中对样品的保护也进行了详细的规定，主要包括了样品的运输、保存、处理等要求，以确保样品的完整性和可靠性。
国际标准对猪瘟诊断技术的规范化给猪瘟的诊断技术提供了规范和保障，有助于提高猪瘟的诊断水平，促进猪类养殖业的健康发展。
通过国际标准的制定和执行，能够加强各国之间在猪瘟疫情防控和技术交流的合作，有利于共同应对猪瘟疫情带来的挑战，保障全球猪类养殖业的可持续发展。
非洲猪瘟诊断与检测技术要点
非洲猪瘟检测与诊断技术要点中国农业科学院上海兽医研究所牵头编制2019年9月前言非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病率和死亡率可达100%。
世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
1921年，ASF最初发现于肯尼亚，上世纪五、六十年代在非洲、欧洲、南美洲流行。
2018年8月初我国爆发非洲猪瘟首起疫情以来，该疫病已蔓延全国23个省，给我国生猪养殖业和国民经济带来巨大损失。
由于ASFV感染机制复杂，目前世界范围内至今尚无有效预防用非洲猪瘟疫苗，因此早期发现、精准检测是控制该病传播和发生的关键。
本文参考了OIE关于非洲猪瘟防控的文件、农业农村部发布相关文件和中国动物卫生与流行病学中心、中国动物疫病预防控制中心的相关技术手册，结合我们的研究成果，从非洲猪瘟早期发现、现场排查、精准检测三个方面的技术要点编写而成，主要面向从事非洲猪瘟现场排查和检测的一线防疫人员，提供了简明实用的相关操作技术与方法，为非洲猪瘟现场排查与检测等相关工作提供参考。
编者牵头团队：上海兽医研究所猪呼吸道传染病团队负责人：马志永参加人：魏建超等参加团队：哈尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队负责人：仇华吉参加人：罗玉子等兰州兽医研究所外寄生虫与虫媒疫病团队负责人：刘志杰参加人：林密等兰牧药研究所中兽医与临床团队负责人：李建喜参加人：崔东安目录一、概述 (1)二、早期发现 (4)三、现场排查 (5)（一）准备工作 (6)1.人员准备 (6)2.车辆准备 (6)3.物品准备 (6)（二）进出养殖场要求 (7)1.抵达养殖场 (7)2.穿戴个人防护设备（在清洁区） (8)3.离场前准备 (8)4.离场后 (9)5.消毒剂的选择 (9)（三）临床诊断 (9)1.临床症状 (10)2.剖检病变 (11)3.鉴别诊断 (12)4.发现疑似病例的情况下应立即采取的行动 (13)（四）样品采集、包装与运输 (14)1.采样方法 (14)2.样品的记录、保存、包装和运送 (15)3.废弃物处理 (18)四、实验室诊断与确诊 (19)1.快速精准检测 (19)2.疫情确诊 (19)附件一：非洲猪瘟防治技术规范 (20)附件二：国家非洲猪瘟参考实验室、专业实验室和区域实验室名单 (24)一、概述非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种有囊膜的DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。
非洲猪瘟的诊断和防治
非洲猪瘟的诊断和防治非洲猪瘟是一种极具传染性、致死性极高的猪病，一旦出现会给养猪业带来巨大的经济损失。
以下是非洲猪瘟的诊断和防治方法。
一、非洲猪瘟的临床症状1.高热：非洲猪瘟的患猪体温会急剧升高，甚至可达41℃以上。
2.食欲不振：患猪会出现食欲不振、口渴，甚至拒食现象。
3.呼吸困难：患猪出现呼吸急促、咳嗽、呼吸困难等症状。
4.皮肤出血：患猪体内的血小板数量会急剧下降，出现皮下出血、鼻出血、咳血等症状。
5.全身乏力：患猪会出现全身乏力、行动不便的现象。
1.流行病学调查：由于非洲猪瘟具有极强的传染性，病例多发生在盛行地区，可以通过流行病学的调查提高诊断的准确率。
2.临床症状：非洲猪瘟的临床症状非常明显，可以通过这些临床表现确定病因。
3.实验检测：常用的非洲猪瘟实验检测方法有ELISA、PCR等，在实验室中对病毒进行检测可以明确病因。
4.病理学检测：可以对死亡猪进行尸检，观察猪体内的器官是否出现出血、浑浊等症状特征，以明确病因。
1.加强猪场管理：猪场要进行必要的消毒、清洁工作，卫生条件要严格把控，生物安全措施要得到加强。
2.加强猪只检疫：新引进的猪只或者有病症的猪只，要进行检疫隔离，确保猪场不受病毒的感染。
3.强化疫苗接种：科学选用效果较好的非洲猪瘟疫苗，对猪群进行强制性接种，防止病毒扩散。
4.保持免疫屏障：养猪户若发现猪有非洲猪瘟的症状，要立即隔离，并进行消毒。
另外，要采取严密的防护措施，保持免疫屏障，防止病毒传播。
综上所述，非洲猪瘟是一种非常危险的猪病，诊断和治疗方法也比较困难。
养猪户应当加强对非洲猪瘟的防范意识，认真遵守相关防治措施，减少病毒的传播和扩散，保证猪场生态环境的安全和稳定。
非洲猪瘟的诊断和防治
非洲猪瘟的诊断和防治非洲猪瘟（African Swine Fever，简称ASF）是一种由非洲猪瘟病毒引起的疾病，主要感染猪类动物。
这种疾病对猪类动物的健康和生产都会造成严重影响，因此诊断和防治非洲猪瘟至关重要。
我们来了解一下非洲猪瘟的病原及病因。
非洲猪瘟病毒属于阿病毒科，是一种大型DNA病毒，具有较强的传染性和致死性。
该病毒在不同的温度下可以存活数月甚至数年，能够经过干燥、冷冻和加热等处理而不失活。
病毒主要通过接触感染、空气传播、粪口传播等途径进行传播，对猪的感染力极强。
一旦发生非洲猪瘟疫情，往往会造成严重的猪群感染和大量死亡。
我们来谈谈非洲猪瘟的临床表现。
非洲猪瘟的潜伏期一般为5-21天，发病后猪出现发热、食欲减退、抖动、呼吸急促、排便增多、流涎、皮肤发绀、瘙痒，甚至死亡。
在临床症状上，极易与猪链球菌性疾病、猪呼吸道综合症等疾病混淆，因此需要进行实验室检测以明确诊断。
针对非洲猪瘟的诊断，一般需要依靠实验室检测，主要包括病毒抗原检测、病毒核酸检测和病毒血清学检测等。
病毒抗原检测主要通过血清学试验、免疫组化和免疫荧光等技术来检测病毒抗原的存在。
病毒核酸检测主要通过PCR技术来检测病毒核酸的存在。
病毒血清学检测主要通过ELISA和免疫印迹等技术来检测病毒血清学标记物的存在。
通过这些实验室检测手段，可以明确诊断非洲猪瘟病毒的存在，从而采取相应的防治措施。
在防治非洲猪瘟方面，主要需要采取以下几个方面的措施：加强疫情监测和报告制度。
要做好非洲猪瘟疫情的监测工作，及时发现疫情，做好疫情报告，以便及时采取相应的防治措施。
做好隔离和检疫工作。
一旦发现疫情，要立即对病猪区进行隔离，防止病毒进一步传播。
对患猪和接触猪进行检疫，排除非洲猪瘟病毒的携带者，防止疫情扩散。
加强饲养管理和卫生防疫。
要做好猪圈、饲料、饮水和猪舍的卫生防疫工作，保持环境清洁、通风良好，防止病毒的传播。
做好疫苗接种和免疫工作。
目前虽然没有特效的非洲猪瘟疫苗，但可以通过加强免疫力，提高猪的抵抗力，来减轻非洲猪瘟的感染和影响。
非洲猪瘟诊断标准
非洲猪瘟诊断标准
非洲猪瘟的诊断标准主要包括以下几个方面:
1.流行病学特点:已经规范免疫猪痘、高致病性猪蓝耳病等疫菌，但猪群发病率、病死率仍然较高;饲喂泔水的猪群出现高发病率、高死亡率;调入猪群15天内出现高发病率、高死亡率。
2.临床症状:发病率、死亡率较高，皮肤发红或发累。
高热或结膜炎症状，出现腹泻、运动失调症状等。
3.剖检变化:脾脏异常肿大至两倍甚至以上、易碎，脾脏有出血性梗死，下颌淋巴结出血，腹腔淋巴结出血。
由于非洲猪痘临床症状与古典猪痘、高致病性猪蓝耳病等疫病相似。
确诊必须开展实验室检测进行鉴别诊断，才能确诊。
对疑似非洲猪瘟疫情的，必须送病料经中国动物卫生与流行病学中心(国家外来动物疫病研究中心)或农业部指定实验室检测，结果为阳性的。
判定为确诊疫情。
制表：审核：批准：。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实用文档
实验室诊断
病原学样品
•抗凝血 •淋巴结 •脾脏 •肾脏 •骨髓
实用文档
实验室诊断的安全原则
• 保障人员的安全
– 穿戴：眼罩、手套、实验服、口罩和鞋套等
– 行为：洗手、禁止聊天，实验室内禁止食用食 物和饮料等
– 了解化学试剂的特性和潜在的危险
• 保障样品的安全
– 防止样品交叉污染 – 一次性手套
GLP (good laboratory practice)
• 原则
制定一整套标准以确保质量、可靠性和完整性， 可 核查结论和可追溯性数据的报告。
• 要点
– 资源：组织、人员、设施和设备
– 特征：检测项目和测试系统
– 规则：试验步骤、标准操作程序（SOP）
– 结果：原始数据、最后报告和档案
– 质量保证：独立监测的研究过程
临床诊断
各种毒力的毒株均可导致流产
•胎儿可能全身水肿 •胎盘、皮肤、心肌或肝脏可能有淤血点
实用文档
➢病理诊断
诊断
脾脏 肿大 易碎
暗红色至黑色
实用文档
胃、肝、肾各部位淋巴结肿 大、出血；
实用文档
水肿
➢肺、肝、膀胱 ➢胆囊充盈 ➢结肠系膜
实用文档
出血
➢瘀点 ➢瘀斑
实用文档
肾皮质出血点、出血斑
肺部局部肉芽肿，形成结节
➢ 可疑样品：当样品的Ct值大于35小于37并且扩增曲线 呈指数时被判定为可疑，当扩增曲线呈线性时判为阴 性。可疑样品应当重新提取病毒核酸检测，如仍为可 疑，可判为阳性。
实用文档
实时荧光RPA
• 重组酶聚合酶扩增技术 • 等温扩增（37~42°C） • 用时短：20分钟 • 灵敏度高 • 操作简单，便携式仪器
非洲猪瘟实验室诊断
African Swine Fever, ASF
国家外来动物疫病研究中心 中国动物卫生与流行病学中心
定义
非洲猪瘟是家猪、疣猪、欧洲野猪和美洲野猪的一种传 染性极强的出血性疾病。所有年龄的猪都易感。 ——世界动物卫生组织
实用文档
• 可表现为最急性、急性、亚急性和慢性四 种形式
• 严重程度与毒株、猪种及流行时间的长短 有关
双抗体夹心ELISA测 定ASFV抗原
实验室诊断
血清学
间接ELISA测定ASF 特异性抗体
阻断ELISA检测ASF 特异性抗体
免疫印迹
间接免疫荧光测抗体
唯一确诊单位：国家实外用来文档动物疫病研究中心
实验室诊断
血清样品
×
合 格 血
液 样 品
析 出 的
血
不合格血液样品
清
分离好的血清单独 包装，并一一编号
图9：肾淤斑及出血点（急性） 图10：肾盂及肾乳头部的 出 血斑（急性）
图11：肾盂处散在的出血点（急性ASF ） 图12：肿大、出血的肝胃淋实巴用结文，档 可出见有血凝块。（急性）
图13：肝胃淋巴结切面，肿大并呈暗红色。（急性ASF） 图14：心包积液及心包肌层有散在的出血点。（急性ASF）
图15：胆囊水肿（急性ASF） 图16：肺部可见肉芽肿病变， 实用文档 形成一结节（慢性ASF）
实用文档
口蹄疫病毒原
➢特点之二：基因多变
基因组两端各有一个高变区，基因型多达 22个
实用文档
病原
➢ 特点之三：抵抗力强
温度：
60℃ 20分钟；
56℃ 70分钟
25-37 ℃ 数周
4℃
>1年
冻肉 数年到数十年
乙醚、氯仿等脂溶剂可破坏囊膜使其失活
pH：
4——11.5 无血清 4——13.4 有血清 未熟肉品、腌肉、泔水中可长时间存活
–非洲猪瘟病毒科中唯一成员
– Asfarviridae Asfivirus ASFV
–兼具虹彩病毒和痘病毒的某些特性 –唯一核酸为DNA的虫媒病毒 –只有一个血清型
实用文档
病原
➢ 特点之一：基因组大
蓝耳病病毒 15kb 12 倍
170~190 kb
猪瘟病毒 12kb 15 倍
Genome CSFV
• 将500 µl冲洗缓冲液（蓝盖）加入过滤管，以8000 g进行1分 钟离心操作。
• 扔掉收集管，重复冲洗步骤（500 µl冲洗缓冲液加入过滤管 ，以8000 g进行1分钟离心操作）。
• 扔掉收集管，将过滤管放入干净的收集管中。以13,000 g进 行10s离心操作以去除残余的冲洗缓冲液。
• 扔掉收集管，将过滤管放入实干用文净档的1.5 ml微离心管中。
African swine fever--comparative study of available tests. Virus research 173:150-158.
荧光PCR检测病毒DNA 实用文档
荧光PCR工作单
样品的可追溯性！
2017/5/1 5
实用文档
荧光PCR检测病毒DNA-试剂准备
提取病毒DNA （3）
• 将50 µl—100 µl预热的消毒蒸馏水加入过滤管 （ 注意不要使用试剂盒中Elution buffer），以 8000 g 进行1分钟离心操作。
• 将DNA溶液在<-10ºC温度下储存（有效期：12个 月），备用；如果DNA溶液在1-2小时内用于PCR 操作，在4±3ºC温度下短暂储存，然后冻存。
图17：肺实变区（慢性ASF）
图18：心包脏层附有纤维素， 而且可见出血点（慢性ASF）
实用文档
鉴别诊断
• 高致病性蓝耳病 • 猪皮炎肾炎综合征（PDNS）由PCV-2引起 • 细菌性败血症 • 香豆素中毒 • 真菌毒素中毒 。。。。
2017/5/1 5
实用文档
ASF感染的主要特征
猪 (野猪和家猪) 软蜱
实用文档
临床症状
➢最急性型
➢急性型
➢亚急性型
➢慢性型
2017/5/1 5
实用文档
临床诊断
最急性型
•无临床症状，突然死亡
急性型（强毒株）
• 发烧（41-42°C） • 食欲减退 • 不愿活动 • 局部皮肤变红或变蓝色 • 腹泻 • 呕吐 • 呼吸困难 • 流产 • 死亡率高（10-100%）
实用仔M文i猪tya发档na生, AUSgaFn，d耳a, 、20鼻10、唇、腿发红，神经症状，数小时内死亡。
➢病毒DNA提取试剂盒 ➢非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒
实用文档
荧光PCR检测病毒DNA-试剂制备
➢冻干蛋白酶K: 将蛋白酶K溶解在4.5 ml灭菌后的
蒸馏水中，将溶液以500 µl分装，在 <-10ºC温度下 储存，直到使用。
➢除抑制物缓冲液: 将20
ml无水乙醇加
入原始小瓶 中混匀并进行相应的标记和日期记录。
实用文档
荧光PCR检测病毒DNA—OIE方法
配制反应体系： ➢反应液溶解后，每个反应管中加入18 µl反应液， 然后再加入2 µl模板； ➢每次试验需设立反应阳性对照（R+，绿管中的反 应阳性对照）和反应阴性对照（R-，灭菌水）
实用文档
实用文档
荧光PCR检测
程序设置
实用文档
荧光PCR检测病毒DNA-实验结果 实用文档
感染
表现出临床症状
携带者
Virus A
病毒血症: 感染后2-3天到b8天，持续很长时间（数月） 特异性抗体: 从感染后
的7-11天至数月，甚至数年 排毒:从 感染早期（第2天）以后实持用续文很档长时间。甚至康复后。
实验室诊断
病原学
病毒分离— 血细胞吸附试验 直接免疫荧光法
（FAT）
普通PCR和荧光定量 PCR
荧光PCR检测病毒DNA-结果判定
➢ 有效性：提取阳性对照（E+）和反应阳性对照R+的 Ct值应小于35，且提取阴性对照（E-）和反应阴性对
照（R-）无Ct值，则试验有效。
➢ 阳性和阴性：当样品的扩增结果有典型的扩增曲线且 Ct值小于37时可判定为阳性。当样品的扩增结果在背
景信号之下或Ct值≥37时，判定为阴性结果。
• 急性型以高热、食欲废绝、皮肤发绀、网 状内皮系统出血为特征，发病后2-10天内 死亡，病死率可高达100%
• 临床上，与古典猪瘟非常相似，难以区分 • 目前没有疫苗！！！
2017/5/1 5
实用文档
• 只感染猪 • 家猪和欧亚野猪非常易感
– 感染后存活的猪可能变为无症状的携带者
• 非洲的野生宿主能持续感染很长时间并且 没有临床症状
g或2000 rpm离心10分钟取上清
➢全血（抗凝血）或血清
直接吸取200 µl
实用文档
提取病毒DNA
• 将200 µl结合缓冲液（绿盖）和40 µl蛋白酶K（20 mg/mL）加入到1.5 ml离心管中。 • 加入200 µl样本。每个提取程序都加入E+ 和 E-
(200 µl水)对照。 • 立即混匀并在72±2ºC 温度下孵育10分钟。 • 将1.5 ml微离心管简单离心操作，除去管盖内部的
2017/5/1 5
实用文档
良好的工作区域
• 第一步
– 实验前清洁试验区域（台面、移液器等） – 注意消毒剂的期限
• 第二步划分不同的区域
– 样品处理（BSL-3提取病毒DNA） – PCR检测（Mix配制、加DNA、扩增等） – ELISA检测区域（加血清、洗涤、终止等）
2017/5/1 5
实用文档
水珠。 • 将100 µl异丙醇加入样本试管，混匀。 • 将过滤管放入收集管中，并将样本移入过滤管。
实用文档
提取病毒DNA （2）
• 将过滤管以8000 g离心1分钟。如果样本依然留在过滤管中， 重复离心操作。
• 扔掉收集管，将过滤管加入干净的收集管中。