PCR和RT-PCR(11-12章)

第十一章 PCR扩增产物表达的快速方法 使用 Directional TOPO 表达试剂盒把克隆基因转入到表达载体， 将节省你大量时 间。这些试剂盒具有快速，高效的特点，Directional TOPO 克隆技术结合高效的 pET 和 pcDNA3.1 载体中，使你从 PCR 中立即得到表达结果。 • 成熟的技术 Directional TOPO 克隆技术将平整末端的单向克隆的 PCR 产物转入 pET 或 pcDNA3.1 载体，使用 Directional TOPO 克隆表达试剂盒将使你： 节省时间——TOPO 克隆 PCR 产物只需要 5 分钟。 得到高质量的克隆结果——大于 90%的重组克隆表达出正确的排列。 完成高水平表达——载体携带强大的表达启动子。 • 节省工作时间 Directional TOPO 克隆试剂盒用拓朴异构酶Ⅰ代替了连接酶，传统的限制性内切 酶过夜孵育的克隆方法被只需 5 分钟的拓朴异构酶介质连接的方法代替， 这样大 缩短了你的工作时间。 pET 和 pcDNA3.1 试剂盒和 Directional TOPO 试剂盒提供 了线性的和无需介质就具有活性的拓朴异构酶 I 的载体。Directional TOPO 试剂 盒的全部克隆程序， 只有三步并且 90%以上的重组克隆表达出正确的排列。 省略 了克隆和筛选的步骤，大大加快了实验步伐。 附录B 测定PLATINUMTM pfx DNA聚合酶的保真度 PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶是一种高保真 DNA 聚合酶， 特别适用于克隆和突 变。PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶的保真性有两种分析来确定，rpsL 保真度分 析和 LacZ 保真度分析，并与其它聚合酶相比较。 当测定 DNA 聚合酶的保真度时，保真度数据的变化可能来自不同的分析过程， 由于目标中的潜在的突变热点。当评价保真度数据时，保持相似的不是绝对数值 而是相对比的酶之间的相对关系。这篇文章用两种分析来评价几种酶的保真度。 PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶具有 3’到 5’的校正外切酶活性。与其它 Taq DNA 聚合酶相比具有最低的错误率。 方法： rpsL 保真度分析：pMOL21 质粒 DNA（4kb） ，包含氨苄青霉素抗性（Apr）和 rpsL 基因，用 ScaI 线性化（图 1） 。按照制造商的使用说明。进行 50 微升体积 的标准 PCR 反应，使用 2 单位 Taq DNA 聚合酶或 PLATINUM™ Taq DNA 聚合 酶， 2.5 单位 pfu DNA 聚合酶或 pfu Turbo™ DNA 聚合酶，和 1.25 单位 PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶，使用生物素标记引物 AAA AAC GCG TCA CCA GTC ACA GAA AAG CAT CTT AC-3’（正向序列）和 AAA AAC GCG TCA ACC AAG TCA TTC TGA GAA TAG-3’（反向序列） 。使用 1ng 模板 DNA 时进行 25 个循环， 10ng 时进行 15 个 PCR 循环。 PCR 反应条件， 94℃， 2 分钟， 接 94℃ 15 秒，58℃ 30 秒，68℃ 5 分钟的 25 次或 15 次循环。百分之二十的反应物用于 0.5×TBE 的 0.8%琼脂糖凝胶电泳，并用 0.25μg/ml 的溴化乙锭溶液染色。
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性没有影响。 Enzyme Mutation Frequency(%) Template Doubling(for 25 cycles) Eorror Rate(×10^(-6)) Relative Fidelity Taq DNA Ploymerase 4.00±0.09 11 42±19 1 Platinum Taq DNA Polymerase 3.4±0.5 10 38±5 1.1 Pfu DNA Polymerase 0.3±0.1 10 3±1 14 Pfu Turbo DNA Polymerase 0.27±0.07 11 2.4±0.4 17 Platinum Pfx Polymerase 0.14±0.04 12 1.6±0.5 26 表 1：用 rpsL 分析测定 DNA 聚合酶的保真性。 结果是 5 次独立的 rpsL 分析 （2 次 25 个循环和 3 次 15 个循环） 结果的平均值±SD。 对不同酶的突变克隆和总克隆数分列如下，Taq DNA 聚合酶（1,892/56,455） ， PLATINUMTM Taq DNA 聚 合 酶 （ 2,043/57,695 ）， pfu DNA 聚 合 酶 （1,033/395,469） ， pfu TurboTM DNA 聚合酶 （1,068/395,468） ， PLATINUMTM pfx DNA 聚合酶（960/584,230） 。 用 LacZ 保真性分析获得了相同的保真性数据（表 2） 。在所研究的几种 DNA 聚 合酶中，PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶有最低的错误率。 Enzyme Mutation Frequency(%) Template Doubling(for 25 cycles) Eorror Rate(×10^(-6)) Relative Fidelity Taq DNA Ploymerase 3.1±0.3 14 19±3 1 Pfu DNA Polymerase 0.18±0.03 11 1.1±0.4 15 Platinum Pfx Polymerase 0.09±0.01 11 0.67±0.06 29 表 2：用 LacZ 分析测定 DNA 聚合酶的保真性。 结果是 2 次独立的 LacZ 分析 （1 次 25 个循环和 1 次 15 个循环） 结果的平均值±SD。 对不同酶的突变克隆和总克隆数分列如下， Taq DNA 聚合酶 （2,975/93,688） ， pfu DNA 聚合酶（185/109,289） ，PLATINUMTM pfx DNA 聚合酶（96/107,655） 。所 有突变克隆都重新涂布并在 37℃培养过夜以进行第二次真正突变体确定。 酶的 保真性会被缓冲液或其附加物所影响。PCRx 增强溶液，它是针对高 GC 含量的 模板的 PCR 反应的共溶剂，也在 rpsL 分析中进行了评价。PCRx 增强剂能提高 Taq DNA 聚合酶的保真性 2 倍（图 2） 。PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶的保真性 不被 PCRx 增强剂所影响 （数据未显示） 。 另外， 在扩增反应中， 当多种不同 PCR 缓冲液应用于 pfu DNA 聚合酶或 PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶时保真性没有明 显变化（数据未显示） 。
第十二章 疑难解答
问 题 可能原因 建议解决方法 RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物 RNA 被降 解 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析 RNA 使用良好的无污染技术分离 RNA 在将组织从动物体取出后立刻处理 在 100％甲酰胺中储存 RNA 如果使用胎盘 RNase 抑制剂，不要加热超过 45℃或 pH 超过 8.0，否则抑制剂或释放所有结合的 RNase。而且，在≥0.8mM DTT 时加 入 RNase 抑制剂，一定要存在 DTT。 RNA 中包含逆转录抑制剂 通过乙醇沉淀 RNA 除去抑制剂。 用 70％ （v/v） 乙醇对 RNA 沉淀进行清洗。 可以加入糖元 （0.25μg 到 0.4μg/μl）以帮助小量样品 RNA 的恢复。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。 将对照 RNA 同样品混合，同对照 RNA 反应比较产量以检验抑制剂。 多糖同 RNA 共沉淀 使用氯化锂沉淀 RNA 以除去多糖。 用于合成 cDNA 第一链合成的引物没有很好退火 确定退火温度适合您的引物。 对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在 25℃保温 10 分钟。 对于基因特异性引物（GSP） ，可以试一下其他 GSP，或换用 oligo(dT)或随机六 聚体确定 GSP 是反义序列。 起始 RNA 量不够 增加 RNA 量。 对于＜50ng 的 RNA 样品，可以在第一链 cDNA 合成中使用 0.1μg 到 0.5μg 乙酰 BSA。 RNA 模板二级结构太多 将 RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火 提高逆转录反应温度，对 SuperScriptⅡ可以到 50℃，对 ThermoScript 可以到 65 ℃。 注意： 不要在＞60℃时使用 oligo(dT)引物， 选择一个在反应温度可以退火的 GSP。

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图 2. PCRx 增强溶液对 Taq DNA 聚合酶的保真性的影响。 用 rpsL 分析来确定在扩增反应中含有或不含 PCRx 增强液时 Taq DNA 聚合酶的 错误率。数值是平均值±SD（N=2） 。 附录C 使用一步法RT-PCR从单一细胞中检测基因 方法： 分离单一细胞 在去除了细胞培养基后，COS-7 细胞用不含钙镁的 DPBS（0.20g/L KCl, 0.20g/L KH2PO4, 8.00g/L NaCl, 2.16g/L Na2HPO4·7H2O ） 清 洗 一 次 。 加 入 Trypsin-EDTA(0.25% tryspsin,1mM EDTA·4Na)到细胞中（3ml/75cm2 培养瓶）并 保温至最多 5 分钟。加入 20ml 生长培养基以终止胰蛋白酶的活性。离心收集细 胞。将细胞悬浮到 DPBS 中至大约 1000 个细胞/ml。取 10μl 悬浮液（大约 10 个 细胞）点到清洁的盖玻片表面。用微量移液管在相差显微镜（Nikon Diaphot 倒 置显微镜，200 倍放大）下收集细胞。分离的细胞（在少于 1μl 的 DPBS 中）转 移到 0.2ml 薄壁 PCR 管中。
图 1. 在显微镜下分离单个细胞 一步法 RT-PCR 使用 INVITROGEN 的 SUPERSCRIPT™ One-Step RT-PCR with PLATINUM® Taq System 进行 RT-PCR。
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图 2. 源自 COS-7 细胞的一步法 RT-PCR 产物。 1-3 泳道分别是从 1 个，2 个和 5 个细胞中扩增的人类肌动蛋白，使用的是有意 义引物（CCT CGC CTT TGC CGA TCC）和反义引物（GGA TCT TCA TGA GGT AGT CAG TC） 。C 泳道则是没有加入反转录酶的扩增结果。