体外抗氧化实验方案
紫花地丁黄酮体外抗氧化实验
LI Jing, WANG Qian, LAN Yang, ZHANG Li-ming
( Department of Pharmacy, Ningxia Medical University, Ningxia Yinchuan 750004, China)
A bstract：The flavonoids of Viok yedoensis Makino were extracted by solvent extraction, the anti-oxidant activity of
第 45卷第21期 2017年 11月
广州化工
Guangzhou Chemical Industry
Vol. 4 5 No.21 Nov.2017
紫花地丁黄酮体外抗氧化实验
李 静 ，王 倩 ，兰 杨 ，张立明
( 宁 夏 医 科 大 学 药 学 院 ， 宁 夏 银 川 750004)
DPPH 摘 要 ：运用溶剂提取法提取紫花地丁黄酮类成分，采 用
(芋 ）循环水式真空栗，郑州中天实验仪器有限公司。 1.3试 剂
芦 丁 标 准 品 ，中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 ；A lC l3 . 6 H2O 、 9 5 % 乙醇（A R ) ，天津大茂试剂厂；无 水 乙 醇 （A R ) ，天津市大 茂化学试剂厂；石 油 醚 （60 ~ 9 0 益 ，A R ) ，天津市大茂化学试 剂 厂 ；石油醚(30 ~ 6 0 益 ，A R ) ，天 津 市 大 茂 化 学 试 剂 厂 ；乙 酸乙酯（A R ) ，天津市大茂化学试剂厂；正 己 烷 （A ，上 海 广 诺 化 学 科 技 有 限 公 司 ； 硫 酸 亚 铁 （A R ) ，天 津 市 大 茂 化 学 试 剂 厂 ；3 0 % 过 氧 化 氢 (A R ) ，上海广诺化学科技有限公司；D PP H ，东京化成工业株 式 会 社 ；抗 坏 血 酸 ， W O L S E N 公 司 。
PTIO自由基清除一个新而简单的体外抗氧化分析法
PTIO自由基清除：一个新颖而简单的体外抗氧化分析法
李熙灿（广州中医药大学，2017.10）
目前的体外抗氧化分析方法有数个局限性，经常导致不一致的结果。
本研究通过使用PTIO自由基，建立了一种新的抗氧化实验。
经各种因素的调查后，实验方案的简述如下：在PTIO·和样品溶液中分别加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4，50mM），分别在37°C 温育2小时，然后用分光光度法在557 nm处测定。
基于20个纯化合物和30个冻干水提物的结果表明，PTIO·清除有良好的线性关系，稳定性和重现性。
UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS分析提示，PTIO·遇到L-抗坏血酸时给出m/z 234。
因此, 作为一种抗氧化分析法，PTIO·清除具有四种优点:（1）以氧为中心的自由基为自由基模型；（2）以生理缓冲液为溶液；（3）测量简单且直接；（4）干扰小。
它不仅可以用于评价氧化活性，还可以用于构效关系的分析。
PTIO·清除过程，没有立体选择性，并且至少只涉及H +转移。
[参考文献]
Xican Li. 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3‑Oxide (PTIO•) Radical Scavenging: A New and Simple Antioxidant Assay in Vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2017, 65, 6288−6297.。
体外抗氧化实验操作步骤,包括配制试剂(完整资料).doc
【最新整理，下载后即可编辑】3.2.5 体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。
（1）对超氧阴离子的清除作用 利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。
取50 mmol·L -1的Tris-HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。
以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：()%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10 mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10 mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。
注意事项：1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。
2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。
3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。
4、 测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。
（2）对DPPH ·的清除作用DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。
抗氧化实验
体外抗氧化实验一、溶液配制pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1缓冲液100 ml；8 mol/L HCl，10mmol/L HCl 100 ml；25 mmol/L邻苯三酚溶液（用10 mmol/L HCl作为溶剂）25 ml；1 mg/ml 维生素C 100 ml（用10 mmol/L HCl作为溶剂）。
二、抗氧化实验1.取5.0 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1缓冲液，4.6 mL蒸馏水，混匀，于25℃恒温水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL迅速摇匀后于25℃恒温水浴中反应5 min，加入8 mol/L HCl 1mL 终止反应，于波长320nm处测定吸光度Ac。
以蒸馏水作参比。
2. 取5.0 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1缓冲液，3.6 mL蒸馏水，1 ml枇杷花提取物，混匀，于25℃恒温水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，迅速摇匀后于25℃恒温水浴中反应5 min，加入8 mol/L HCl 1mL 终止反应，于波长320nm处测定吸光度As。
3. 取5.0 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1缓冲液，2.6 mL蒸馏水，2 ml枇杷花提取物，混匀，于25℃恒温水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，迅速摇匀后于25℃恒温水浴中反应5 min，加入8 mol/L HCl 1mL 终止反应，于波长320nm处测定吸光度As。
4. 取5.0 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1缓冲液，1.6 mL蒸馏水，3 ml枇杷花提取物，混匀，于25℃恒温水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，迅速摇匀后于25℃恒温水浴中反应5 min，加入8 mol/L HCl 1mL 终止反应，于波长320nm处测定吸光度As。
体外抗氧化实验操作步骤,包括配制试剂
3.2.5 体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。
（1）对超氧阴离子的清除作用利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。
取50 mmol·L -1的Tris -HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。
以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：()%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。
注意事项：1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。
2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。
3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。
4、测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。
（2）对DPPH ·的清除作用DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。
多肽体外抗氧化
多肽体外抗氧化——铁氰化钾还原法一．实验原理：样品（蝇蛆多肽提取物）将铁氰化钾（K3Fe(CN)6）还原成亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)，亚铁氰化钾再与三氯化铁反应生成普鲁士蓝（亚铁氰化铁Fe4[Fe(CN)6]3），在700nm 测吸光度值，通过测定吸光度来判断受试物还原力的强弱。
铁氰化钾溶液为黄色，猜测用三氯乙酸（CCL3COOH ）与反应剩余的铁氰化钾生成沉淀，离心除去，排除对吸光度数值的影响。
二．试剂的配置V1=0.10005585L V2=0.10003205L三．实验步骤；1ml 样液+2.5ml,0.2mol/l磷酸缓冲液（ph6.6）+2.5ml,1%铁氰化钾2.5ml,10%TCA（三氯乙酸）取1ml 上清液+0.2ml,0.1%三氯化铁+1ml 蒸馏水室温反应10min后在700nm处测吸光度多肽的浓度分别为10,20,30,40,50mg/ml四。
结果与分析以质量浓度为横坐标，吸光度值做纵坐标画图，对多肽的总还原能力与VC的总还原能力进行比较。
From:猪皮胶原多肽的体外抗氧化特性研究注意：配置不同浓度的样品溶液梯度，依次加入一定量磷酸缓冲液（保证溶液反应的PH环境，如2.5ml pH=6.6）、一定量浓度的铁氰化钾溶液（2.5ml 1%），混合均匀，将该体系置于一定温度下（比如：50℃,不能过高，不然会使物质失活，适当加热可以保证反应程度和时间）恒温水浴放置一定时间（如20min，以反应充分为宜），取出加入三氯乙酸溶液混匀，置于离心机内3000转离心10min（离心机使用时一定保证对侧样品等重），取一定量上清液于另一试管中，加入蒸馏水和三氯化铁溶液（3K4Fe(CN)6 + 4FeCl3 →Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl ，黄色晶体亚铁氰化钾放进三氯化铁的溶液中，产生颜色很鲜艳的蓝色沉淀，即普鲁士蓝，测定吸光度时要摇匀，且普鲁士蓝耐热性在140℃，光照下较稳定，不用避光），混匀后用分光光度计在700nm下测定溶液吸光度。
抗氧化能力的测定的实验报告
抗氧化能力的测定的实验报告实验报告：抗氧化能力的测定引言：抗氧化能力是指物质对抗氧化剂的抵抗能力，其重要性在于帮助人体抵御自由基的损害。
本实验旨在通过测定不同样品的抗氧化能力，评估其对人体健康的潜在益处。
材料与方法：1. 样品准备：从市场购买五种常见的食材作为实验样品，包括苹果、橙子、胡萝卜、菠菜和绿茶。
2. 样品提取：将每种食材分别切碎，并用乙醇提取其抗氧化物质。
将每种样品放入研钵中，加入适量的乙醇，搅拌均匀，然后用滤纸过滤提取液。
3. 抗氧化能力测定：采用DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）自由基清除法测定样品的抗氧化能力。
将每种样品提取液和已知浓度的抗氧化剂（例如维生素C）混合，反应一段时间后，测定混合溶液的吸光度。
4. 对照组设置：同时设置维生素C的对照组，以验证实验方法的准确性。
5. 数据处理：计算每种样品的抗氧化能力，以吸光度测定值的降低程度表示。
使用统计学方法进行数据分析。
结果：根据实验数据统计与分析，不同样品的抗氧化能力有所差异。
其中，绿茶和菠菜表现出较高的抗氧化能力，吸光度的降低程度较大，显示出较强的自由基清除能力。
苹果、橙子和胡萝卜的抗氧化能力较低，吸光度的降低程度较小。
讨论：本实验结果表明，绿茶和菠菜具有较强的抗氧化能力，可能对人体健康具有积极的影响。
然而，需要进一步研究以验证这些食材中的具体抗氧化成分，并了解其作用机制。
此外，实验中使用的DPPH自由基清除法仅是众多测定方法之一，其他方法也可以用于评估样品的抗氧化能力。
结论：本实验通过测定不同样品的抗氧化能力，发现绿茶和菠菜具有较强的抗氧化能力，苹果、橙子和胡萝卜的抗氧化能力较低。
这些结果为人们选择健康食材提供了一定的参考依据，但仍需进一步研究来确认这些食材对人体健康的确切益处。
抗氧化测定方法（三种）
实验一超氧阴离子自由基清除能力的测定——抗氧化实验之一一、目的要求通过本实验掌握利用利用植物（或微生物发酵生产的原料）提取物进行超氧阴离子自由基清除能力测定的方法。
二、实验原理超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。
邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02﹣∙，02﹣∙能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30s~45s 与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有色产物在325nm 有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02﹣∙的浓度，清除02﹣∙就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。
三、器材及试剂（一）器材恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。
10ml比色管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。
（二）试剂邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸、BHT等。
（1）pH8.2的Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）：50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与22.9ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。
（2）0.2mmol/L邻苯三酚溶液（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制）四、操作步骤（一）样品的测定（1）先将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度，在10mL的比色管中分别加入4mL（0.05mol/L）pH8.2的Tris-HCl缓冲液，置于25℃水浴中预热20min，然后加入25℃水浴中预热20min不同浓度样品液1mL，再加入在25℃水浴中预热20min的0.2mmol/L邻苯三酚溶液1mL（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制），混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用浓HCl两滴终止反应，并在325nm处测定吸光度（A样）。
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体外抗氧化实验方案
一、DPPH自由基清除法
[原理] DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。
分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。
ON2
NONN2
NO2
当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。
DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。
[实验步骤]
1.1 DPPH测试液的配制 6.25,10ˉ5M
取DPPH 0.0246g溶于约100mL溶剂甲醇中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。
取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A,1.2-1.3之间最佳。
该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。
1.2 样品液的配制 Vc溶液
(0.25mg/ml)
称取Vc 0.01125g 溶于45mL乙醇溶液
1.3 预试
取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色m情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。
此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。
【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则200μL为该样品液的最大用量。
其用量梯度宜设为40、80、 120 、160、
200μL。
浓度梯度mg/ml为
0.0025、0.0050、0.0100、0.0200、0.0400
μg/ml 2.5、5、 10、20、40
1.4 测量
A0值的测量:取DPPH溶液2 mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加95甲醇1mL，充分混合，测A值(517nm)，此A值为A(A0多在0.7-0.9之间)。
0 A值的测量:
取DPPH溶液2mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加样品液xμL (x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量)，再加(1000 -x)μL 甲醇，混合，静置30分钟后，测A值(517nm)。
加样表如下:
表1 加样表
样品液甲醇总体积 DPPH测试液
30μL 970μL 2 mL 3mL
60μL 940μL 2 mL 3mL
120μL 880μL 2 mL 3mL
240μL 760μL 2 mL 3mL
480μL520μL 2 mL 3mL
1.5 正式测量
方法大致与1.4相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。
而且在每测一个用量的三个平行数据后，都要重测一次A. 0
[实验结果]
清除率(抑制率)的计算公式:
AA,0 Inhibition % = 100%，A0
二、FRAP法分析维生素C抗氧化作用实验原理:
3+参照Benzie与Strain的方法，原理为Fe-三吡啶三吖嗪(TPTZ)可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色3并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。
实验试剂
醋酸钠(三水)，冰醋酸，TPTZ，FeCl3•6HO，FeSO4•6HO 22
不同梯度FeSO4溶液配制:称取695mgFeSO•6HO，定容至25ml，即100mM，按梯度配42
制成10、25、100、150、200、400、500μM溶液
TPTZ工作液配制:
(1)称取1.02g乙酸钠(三水)，加4ml冰醋酸，定容至25ml(调整pH=3.6) (2)称取TPTZ粉末 7.8mg(小心腐蚀皮肤)，溶于2.5ml 40mM HCl溶液中，溶液澄清透明。
(3)称取1.35g FeCl3•6HO 溶于25ml水中，取2.5ml溶液定容至25ml，即20mM的FeCl溶23液。
混匀三种溶液(10:1:1)制成TPTZ工作液，现配现用。
不同梯度Vc溶液配制:
取Vc溶于水，配成含Vc5、10、20、30、40、50μg/ml溶液(预实验)
实验步骤
(1)标准曲线的测定:按10:1:1比例，精确量取醋酸钠溶液，TPTZ溶液和不同梯度FeSO溶4液，混匀后于37?反应10min，测定593nm处吸光度，以醋酸钠溶液调零。
以FeSO坐浓度为纵4标(表示为FRAP值)，吸光度为横坐标，绘制FRAP标准曲线。
(2) 取100μL不同浓度的Vc溶液，加入1.9mlTPTZ工作液混匀后37?反应
30min，测定593nm
处吸光度，以醋酸钠溶液调零，样品抗氧化活性(FPAP value)以达到同样吸光度所需的FeSO4
表示。
进行平行实验。
毫摩尔数。