PTIO自由基清除一个新而简单的体外抗氧化分析法
PTIO自由基清除：一个新颖而简单的体外抗氧化分析法
李熙灿（广州中医药大学，2017.10）
目前的体外抗氧化分析方法有数个局限性，经常导致不一致的结果。
本研究通过使用PTIO自由基，建立了一种新的抗氧化实验。
经各种因素的调查后，实验方案的简述如下：在PTIO·和样品溶液中分别加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4，50mM），分别在37°C 温育2小时，然后用分光光度法在557 nm处测定。
基于20个纯化合物和30个冻干水提物的结果表明，PTIO·清除有良好的线性关系，稳定性和重现性。
UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS分析提示，PTIO·遇到L-抗坏血酸时给出m/z 234。
因此, 作为一种抗氧化分析法，PTIO·清除具有四种优点:（1）以氧为中心的自由基为自由基模型；（2）以生理缓冲液为溶液；（3）测量简单且直接；（4）干扰小。
它不仅可以用于评价氧化活性，还可以用于构效关系的分析。
PTIO·清除过程，没有立体选择性，并且至少只涉及H +转移。
[参考文献]
Xican Li. 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3‑Oxide (PTIO•) Radical Scavenging: A New and Simple Antioxidant Assay in Vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2017, 65, 6288−6297.。
体外抗氧化功能评价方法研究进展
体外抗氧化功能评价方法研究进展傅裕【摘要】体外抗氧化功能评价发展至今,已形成一个比较系统的体系.本文概述了一些常见的体外抗氧化功能评价方法和国内外新的研究进展,并对其优点、局限性做了简要归纳总结,同时对抗氧化功能评价未来发展进行展望.以期为抗氧化功能评价研究提供有益参考.【期刊名称】《肉类研究》【年(卷),期】2010(000)011【总页数】6页(P41-46)【关键词】体外抗氧化功能评价;化学评价法;生物活性评价法【作者】傅裕【作者单位】西南大学,食品科学学院,重庆,400715【正文语种】中文【中图分类】TS201一般而言，人体的抗氧化防御系统是平衡的,体内自由基的产生和清除也是平衡的。
然而一旦自由基产生过多或抗氧化防御体系出现故障,体内自由基代谢就会失衡,从而导致脂质过氧化、细胞损伤、DNA断裂等。
现代医学研究表明，衰老、癌症、心血管疾病、炎症的产生与发展等都可由自由基及其代谢产物诱发[1],化妆品中的自由基还会直接攻击人的皮肤，从表皮细胞中抢夺电子，使皮肤失去弹性，粗糙老化[2]，因而研究抗氧化功能评价极其重要。
抗氧化功能评价方法包括了体内评价和体外评价。
但体内抗氧化方法涉及到动物模型和人体实验，费用昂贵、周期过长，不适用于食品或添加剂抗氧化性的初筛工作。
所以，对于样品量很大或只是进行初筛样品的抗氧化功能评价时都采用体外抗氧化功能评价。
体外抗氧化功能评价发展至今，已经形成了一个比较系统的体系了，包括很多评价方法，我们将这些方法划分为两类[3]：即化学评价方法和生物活性评价方法。
其涉及营养学，保健食品，功能食品，药学，毒理学，生物化学等多个学科。
1 化学评价方法1.1 体外总抗氧化能力的测定（TAC测定）体外总抗氧化能力可以通过测定还原力[4，7,8]的大小来表示。
目前已有许多研究证实抗氧化能力同还原力是密切相关的[5]，抗氧化剂通过自身的还原作用提供电子清除自由基，还原力越强，其抗氧化能力也就越强。
抗氧化活性实验方法
抗氧化活性实验方法（体外实验）1、清除DPPH自由基能力的测定称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。
分别取2mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。
取上清液于517nm处测吸光值。
用Vc作为阳性对照。
样品对DPPH 自由基的清除率用以下公式计算：DPPH()121100%A AA-=-⨯清除率A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。
2、总还原能力的测定在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。
取出后加入2.5mL 10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。
取上清液2.5mL，加入2.5mL 蒸馏水和0.5mL FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。
Vc作为阳性对照。
3、对Fe2+离子螯合能力的测定分别取1mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。
EDTA为阳性对照。
样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：Fe2+()121100%A AA-=-⨯螯合率A0—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值；A1—样品溶液反应后的吸光值；A2—0.1mL的蒸馏水代替反应体系中FeCl2溶液后的吸光值。
4、超氧自由基（O2-）清除率的测定采用邻苯三酚自氧化法测定。
取50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）4.5mL，置25℃水浴中保温20min，分别加入1mL样品溶液和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1mL 8mmol/L HCl终止反应，于299nm处测定吸光度（A x），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。
DPPH自由基清除与普用自由基清除实验(水溶液)-实验流程图-操作图解-李熙灿-Xican-Li (1)
水溶液中“普用”自由基清除的实验实验操作图2019.6 【参考文献】Xican Li. 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide (PT IO•) Radical-scavenging: A New and Simple Antioxidant. Journal of Agricultural & Food Chemistry. 2017, 65, 6288−6297.【简介】“普用”自由基，原名是PTIO自由基。
它是一种能溶于水的自由基，所以，可以在水溶液中进行自由基的清除实验。
这比DPPH自由基清除实验，更合理；因为DPPH 自由基清除只能是有机溶剂（如乙醇、甲醇）中进行。
另外，“普用”自由基是以氧原子以中心的自由基，而DPPH自由基是以氮原子为中心的自由基。
所以，“普用”自由基的清除能更好地反映出ROS的清除水平。
更进一步地，“普用”自由基清除也可以在缓冲液中进行。
在pH 4.5缓冲液中，“普用”自由基清除是电子转移（Electron-transfer, ET）机制。
在pH 7.4缓冲液中，如果样口也能清除“普用”自由基清，表明在pH 7.4的生理水溶液下，样品也有抗氧化活性。
如果pH 在pH4.5和pH7.4各溶液中，样品的清除能力不同，表明pH值影响了其抗氧化行为。
由于pH值表征了质子（H+），所以，这差异也表明，样品的抗氧化行为与质子转移(Proton transfer, PT)有关。
所以，一个样品如果在pH 4.5和pH 7.4缓冲液表现不同的IC50值，就提示：样品的抗氧化机制是ET + PT。
总之，“普用”自由基清除的实验即可以用于评价抗氧化活性的强弱（水溶液中），还可以探讨抗氧化机制。
1. 样品溶液配制（1）抗氧化活性评价：宜用蒸馏水作溶剂。
如果蒸馏水不溶，则用醇亦可。
浓度视样品溶解性而定，但宜尽量配浓。
抗氧化活性测定方法
抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法在食品、药物、化妆品以及生物学研究中具有重要的应用价值。
抗氧化活性是指物质对自由基的清除能力，其测定方法可以评估物质的抗氧化性能和保护细胞免受氧化损伤的能力。
本文将介绍一些常用的抗氧化活性测定方法。
一、DPPH自由基清除法DPPH自由基清除法是目前应用最广泛的抗氧化活性测定方法之一、该方法基于DPPH自由基的紫色溶液，在受到氧化损伤时会褪色。
通过测定样品对DPPH自由基的清除能力，可以评估其抗氧化活性。
实验步骤：1.准备0.1mM的DPPH溶液。
2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。
3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的DPPH溶液。
4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。
二、还原能力测定法还原能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。
该方法基于物质对氧化剂的还原能力，通过测定还原剂浓度与吸光度之间的关系，评估样品的抗氧化活性。
实验步骤：1.准备一系列不同浓度的还原剂溶液。
2.取一定量的还原剂溶液，加入适量的氧化剂溶液。
3.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出还原剂的浓度与吸光度之间的关系。
4.根据吸光度与还原剂浓度的关系，评估样品的抗氧化活性。
三、总抗氧化能力测定法总抗氧化能力测定法是一种综合评估样品抗氧化活性的方法。
该方法基于样品的抗氧化剂含量和抗氧化活性，通过测定样品对氧自由基的清除能力，评估其总抗氧化能力。
实验步骤：1.准备一定浓度的氧自由基溶液。
2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。
3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的氧自由基溶液。
4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。
以上是常用的抗氧化活性测定方法，还有其他一些方法如ORAC法、TEAC法等也被广泛应用。
不同的方法适用于不同的样品和测定目的，选择适合的方法进行测定可以更准确地评估样品的抗氧化活性。
3种抗氧化活性测定方法
3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性是指物质对氧化过程的抑制作用，能够减缓或阻断自由基对细胞和组织的损害。
目前，常用的抗氧化活性测定方法主要包括DPPH 自由基清除法、ABTS自由基清除法和铁还原能力测定法。
以下将对这三种方法进行详细介绍。
1.DPPH自由基清除法：DPPH（2,2-二苯基-1-若氧基-苯基-π-苦味噁唑）自由基清除法是一种常用的抗氧化活性测定方法。
该方法是通过测定样品对DPPH自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。
DPPH自由基是一种紫色稳定的自由基，在接触到氢供体（抗氧化剂）后，会发生颜色变化从紫色转变为黄色。
可以通过测定样品溶液的吸光度来评估其抗氧化能力。
吸光度的降低表明样品对DPPH自由基的清除能力较强。
2.ABTS自由基清除法：ABTS（2,2'-联氨基双（3-乙基苯并噻唑））自由基清除法也是一种常用的抗氧化活性测定方法。
ABTS自由基是一种无色可溶性自由基，其生成主要通过氧化剂与ABTS反应而产生。
测定方法是将ABTS与过氧化氢反应，生成蓝色自由基溶液，然后将样品加入到溶液中，通过测定吸光度的变化来评估样品的抗氧化活性。
吸光度的降低表明样品对ABTS自由基的清除能力较强。
3.铁还原能力测定法：铁还原能力测定法是一种评估抗氧化活性的常用方法，通过测定样品对Fe3+还原为Fe2+的能力来评估其抗氧化能力。
在这个方法中，还原剂（如抗氧化剂）会与Fe3+反应，生成Fe2+，并且Fe2+的浓度可以通过测量其吸光度来确定。
浓度越高，吸光度越高，表明样品的抗氧化能力越强。
这三种抗氧化活性测定方法各有其优势和适用范围。
DPPH自由基清除法适用于评估样品对自由基的清除能力，但其结果受其他化合物的影响较大；ABTS自由基清除法对于水溶性和脂溶性样品均适用，但其结果也受其他化合物的影响；铁还原能力测定法适用于样品中还原型物质的测定，可评估样品对金属离子的还原能力。
因此，在实际应用中，可以根据需要选择适合的方法来评估样品的抗氧化活性。
体外抗氧化清除自由基能力测定方法总结
体外抗氧化清除自由基能力测定方法总结1 总还原力的测定采用Lee等[14]方法,略修改.取1.0 mL浓度为25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL, 150μg/mL和200μg/mL的样液,加入2.5 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L,pH 6.6),然后加入2.5 mL 1%六氰合铁酸钾(K3Fe(CN)6), 50℃水浴30 min后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,混匀1 500 g离心10 min,取上清液2.5 mL加2.5 mL水和0.5 mL 0.1%的三氯化铁混匀,于700 nm处比色测定.以25~200μg/mL维生素C为标准溶液做标准曲线,以维生素C相当含量(mg/g)表示样品总还原力.2 DPPH·自由基清除率的测定采用Yamaguchi等[15]方法,取0.2 mL浓度分别为25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL, 150μg/mL和200μg/mL的样液同1.0 mL 95%的DPPH乙醇溶液混匀,于37℃反应60 min后在517 nm处比色.DPPH自由基清除率用以下方程式计算: Y= [(OD517对照-OD517样品)/OD517对照]×100式中:Y为清除率,%;OD517对照为517 nm下对照品的吸光度值;OD517样品为517 nm下不同浓度样品的吸光度值.3 羟基自由基(·OH)清除率的测定桦褐孔菌多酚的羟基自由基(·OH)清除率由改动后的Nicholas Smirnoff[11]法测得。
反应体系(4 mL)包括:1 mL H2O2(8.8 mmol/L),1 mL FeSO4(9 mmol/L),1 mL水杨酸(9 mmol/L),1 mL多酚溶液(0.4mg/mL)。
H2O2最后加入以启动整个反应。
反应体系在37℃条件下温育60 min,在15 000×g条件下离心6 min。
体外自由基清除实验概述
体外自由基清除实验概述（以异补骨脂乙素与异甘草素为例）概述PTIO（2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide radical）是一种与人体自由基相似的自由基，常温下是蓝色晶状固体，化学性质稳定，但对光敏感，易溶于水和大多数有机溶剂,具有良好的稳定性，在560nm下有特征吸收峰，会因为自由基的清除而导致颜色变浅，吸光度值降低。
因此可用于抗氧化实验研究。
图1：PITO自由基图2：PITO自由基模型（球棍模型）图3：PITO自由基模型（棍式模型）异补骨脂乙素( Isobavachalcone，IBC) 最早是由Bhalla 等于1968 年从补骨脂的果实中提取出来的一种活性成分，异补骨脂乙素属黄酮类中的查尔酮类，具有抗炎、抗菌、抗氧化等生物学活性。
补骨脂中黄酮类成分母核不同，是否有羟基和异戊二烯基取代以及取代位置差异，都会影响其对绝经后妇女成骨细胞的增殖、分化活性。
图4：异补骨脂乙素结构式图5：异补骨脂乙素分子模型异甘草素(Isoliquiritigenin，Iso) 是甘草中活性最好的黄酮苷元化合物，在抗肿瘤、抗氧化、解痉、保肝等均具有广泛的药理作用，甘草黄酮具有明显的抗肿瘤、抗艾滋病、抗溃疡、抗炎等作用。
图6：异甘草素结构式图7：异甘草素分子模型两者均有良好的抗氧化能力，故可用于PTIO自由基清除能力教学。
故本实验选取了这两种化合物做PTIO自由基清除能力测定的实验对象。
仪器与试剂1.仪器旋转蒸发仪，紫外分光光度计，电子分析天平（十万分之一），离心机，冰箱，恒温水浴锅，真空冷冻干燥机，旋转蒸发仪，超声清洗器，电热恒温鼓风干燥箱，移液器及枪头；西林瓶、锥形瓶、离心试管等玻璃器皿。
2.试剂PTIO标准品、Na2CO3、蒸馏水，异补骨脂乙素，异甘草素，甲醇等。
实验步骤参考至文献[1],并根据实验的实际情况做了修改。
1.PTIO测试液制备取PTIO固体约1g放于20ml蒸馏水中，超声5min，上下震荡使其混合均匀。
抗氧化能力分析方法
抗氧化能力分析方法抗氧化能力分析方法是评估物质对氧化损伤的抵抗能力的一种方法。
氧化损伤是指由于自由基和其他氧化物质的作用而导致的细胞和组织的损伤，与许多疾病的发展有关。
抗氧化能力分析方法可以帮助我们了解物质的抗氧化能力，进而在食品、医药和化妆品等领域中的应用。
以下是几种常用的抗氧化能力分析方法：1.自由基清除能力分析法：自由基清除能力是物质对自由基的消除能力，常用的分析方法包括DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和超氧阴离子自由基清除法等。
这些方法通过测定物质与自由基反应后的颜色变化来评估其抗氧化能力。
2.还原能力分析法：还原能力是物质还原氧化剂的能力，可以通过测定物质与还原剂反应后的颜色变化来评估。
常用的方法有铁还原能力法、铁螯合能力法和硫酸钼蓝法等。
3.抗氧化酶活性分析法：抗氧化酶是一类能够清除自由基和其他氧化物质的酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽还原酶（GR）等。
通过测定这些酶的活性，可以评估物质对氧化损伤的抵抗能力。
4.氧化指标分析法：氧化指标是反映物质氧化损伤程度的指标，通常通过测定脂质过氧化产物、蛋白质氧化产物和DNA氧化产物等来评估。
常用的方法有TBARS法、氧化还原电位法和免疫学方法等。
5.细胞实验分析法：细胞实验可以模拟体内环境，通过测定细胞对氧化损伤的抵抗能力来评估物质的抗氧化能力。
常用的方法有细胞存活率测定法、DNA损伤测定法和细胞色素C释放法等。
综上所述，抗氧化能力分析方法有多种不同的方法，可以通过测定自由基清除能力、还原能力、抗氧化酶活性、氧化指标和细胞实验等来评估物质的抗氧化能力。
这些方法在食品、医药和化妆品等领域中的应用，有助于筛选和评估具有抗氧化性能的物质，为开发新的抗氧化剂提供科学依据。
中药分子的体外抗氧化活性的对比
中药分子的体外抗氧化活性的对比——以落新妇苷和槲皮苷为例（李春厚）基本原理根据文献[1]可知，PTIO（2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物自由基）是一种化工合成的氧自由基，PTIO清除剂作为一种抗氧化剂检测方法，具有四个优点，即氧中心自由基、生理水溶液、简单直接的测量以及来自被测样品的干扰少。
它还可以令人满意地分析抗氧化结构-活性关系。
PTIO清除没有立体特异性，至少参与H转移。
在557 nm处有特征吸收峰，所以可以用这个特性来检测自由基的清除能力。
落新妇苷（astilbin），(2R,3R）-花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，是1950年由Kozo Hayashi和Kazuhiko Ouchi首次从植物落新妇中提取得到的化合物。
槲皮素，是植物界分布广泛，具有多种生物活性的黄酮醇类化合物。
槲皮素能对抗自由基，络合或捕获自由基防止机体脂质过氧化反应. Trolox，水溶性维生素E，化学名称：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)，为抗氧化实验公认的阳性对照品。
图1：PTIO自由基结构式图2：PITO自由基模型（角度1）图3：PITO自由基模型（角度2）图4：落新妇苷结构式图5：落新妇苷分子模型图6：槲皮素结构式图7：槲皮素分子模型实验方法根据文献[1]方法，实际依照真实情况而变动1.PITO测试液配制取PTIO约3mg溶解于约20ml蒸馏水中，，蒸馏水分别用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成4.0,5.0,6.0,的溶液（检测不同PH值的影响）。
超声5min，上下震荡摇匀，取80μL该测试液和20μL蒸馏水于96孔板中，在560nm处测A值，使得A=0.1±0.01，避光保存，此PITO溶液最好当天用完2.样品溶液配制样品用合适溶液溶解（一般选用95乙醇或者水）配置成1mg/mL的样品液，可适当超声让其完全溶解，混合均匀。
常见体外抗氧化实验方法-抗氧化试验-抗氧化活性实验方法-抗氧化测定法-李熙灿Xican Li
常见体外抗氧化实验方法(含原理、试剂配制、操作流程、实例分析、英文表述)- 2023-3①DPPH·自由基清除法 2 Array②ABTS·+自由基清除法 5③ FRAP法(铁还原法) 811④过氧自由基(超氧自由基，·O2-)清除法(连苯三酚自氧化法)⑤羟基自由基(·OH)清除法(脱氧核糖法) 14⑥PTIO·自由基清除法(水溶液中) 16⑦ CUPRAC法(铜还原法) 18⑧铁络合能力(Ferrozin法) 20⑨脂质过氧化清除法(亚油酸为底物) 23⑩抗氧化产物的预测26①DPPH·自由基清除法/DPPH法原理：DPPH·（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即α, α-二苯基-β-苦基肼基游离基，由于p-π共轭，所以，氮自由基能稳定存在[1]。
当DPPH自由基被某物质清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小；相应地，某物质自由基清除活性增加，其体外抗氧化活性也增加。
实验操作[1]:1.1 DPPH测试液的配置（适用于酶标仪测量，总体积为100μL）取DPPH 2毫克溶于约40mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。
取DPPH溶液80μL加入到96孔板中，加95乙醇（或无水乙醇）20μL，稀释混合，测A值，使A＝0.20±0.01。
该DPPH溶液避光保存，4h内用完。
（注意：如果是用分光光度计．．．．．，则A＝0.6±0.02比较合适）1.2 样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。
溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。
1.3 预试取DPPH溶液80μL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。