趋化信号转导基因_i_cheA__i_突变对_i_Pseudomonas putida__i_ DLL-1甲基对硫磷的趋化性及原位降解的影响

： ： K3 ，-+);&，-+,，$%4，-.0L，"*5，(42M，,%*L： 79E;F;!*： J4，2), 8.66 ，126 $; 1 92A6 ，@（ & I） %6’ &($*( %@ AB&0/<$6’A. #（ 81 I ） # ，%6’3,-E ，<($B ，80$ .6( I ， 2%? I 92A6 ，$;/9 /,"=3%0- )0(%,-%1 )0-. -+% JO6 ./ 2J? &C;! 92A6 ，126 ，12 =%0% )0(%,-%1 )0-. -+% JO6 ./ 2J? &C;! 92A6 ，Q)-+ $;/9 /,"=3%0- )0(%,-%1 )0-. -+% B(2 <R "01 C;% R ()-% ./ 2PJB& 92A6 ，126 ，Q)-+ 12 /,"=3%0- )0(%,-%1 )0-. B5& # ()-% ./ 2PJL
趋化信号转导过程中负责编码组氨酸激酶的基因， 为了研究菌株趋化性在农药原位降解中的作用， 通过基因打靶 的方式使 ! > *$+,%) GHH4’ 染色体上单拷贝的 -.#/ 基因失活， 成功地获得了 IJ 的趋化突变株 ! > *$+,%) GKL， 突变 ， 发现在灭菌与未灭菌土壤中趋化 株与野生菌株生长能力没有显著差异。通过土壤盆钵试验 （IJ 浓度为 5%8M/NM） 说明菌株 GHH4’ 趋化性的丧失会减慢其对农药 突变株对 IJ 的降解能力低于原始出发菌株 GHH4’ 约 $%O ( #%O ， 的降解， 趋化性在农药的原位降解过程中发挥重要作用。 甲基对硫磷 关键词：趋化性；农药降解；!"#$%&’&()" *$+,%) GHH4’；-.#/ 基因； 中图分类号： P’"$ 文献标识码： K 文章编号： %%%’4&$%6（$%%"）%#4%!"’4%&
引物及 %&’ 扩增条件
L00%"$)0= !SX AE @F B5& # 7%3",[( B5& #
!"#$% F 9O7 2,)3%,( "01 9O7 *.01)-).0( （@Z!HZ） 6%Y4%0*%( ./ 2,)3%,( ?%0"-4,"$ !SX L!]L]O!!O]]O]OO]L!]LL]L L]OL!]O!OLL]O]!!LO]OO]O LLLLL]L!O!LOLL!LLLLO!]!O!]O! OOOOL]L!O!O]!OOO]!OLL]!OL]O] BE BE
收稿日期： $%%&4’%4’$；接受日期： $%%&4’’4$’；修回日期： $%%"4%#4%"
EGF 表!
6-,")0( ., 2$"(3)1( 6-,")0( 9: 24-)1" !""; & # : $%&’ ?<@ ! # : $%&’ ?<@ ! 2), " # : $%&’ 6J&D"2), - : A0.’=( ?LK 9$"(3)1( 2J? &C;! 26O&FH 2PJB& 27KADD 2J?L 2J?K 2PJL 2LK 92A6 <)=+ %//)*)%0- 3%-+5$ 2","-+).0 1%=,"1)0= (-,")0
!"(
同源重组打靶载体的构建
参照模式菌株 - : A0.’=( K!FEED 的全基因组序 列， 根据保守序列设计扩增编码组氨酸激酶磷酸化 的基因 （ $;/9 ） 引物 （表 F） ， 扩增目的条带 $;/9 。将 扩增的 $;/9 片段与 2J?&C;! 载体连接获得 2J?L。 以 26O&FH 为模板， 引物 K\ 和 K7 扩增出含启动子 的 K3 抗性基因片段， 两端同时引入 B5& # 酶切位 点， 连接到 2J?&C;! 载体上， 命名为 2J?K。 C;% ’ 和 B(2 <’ 双酶切 2J?L， 将 F[# 左右的 $;/9 大部 分片段连到同样酶切的 2PJB& 质粒载体上， 转化 获得 2PJL。用 B5& # 分别单酶切 # : $%&’ ?<@ ! $A’6 分别回收 &D[# 的 2PJL 线性片段 2PJL 和 2J?K， 和 &[# 的 K3 片段， 将 K3 片段连接到 2PJL 的 B5&
细菌的趋化性 （ @E,8FQ129:） 是细菌响应环境化学物 质梯度的移动， 是细胞对碳源、 能源竞争的一种表 现。近几年来， 细菌趋化性与降解性之间的关系研 究开始受到科研工作者的关注， 许多研究表明细菌 的趋化性和降解特性之间存在密切关系。趋化性可 以使降解菌株有效地感应到污染物， 增加污染物周 围的细菌密度， 提高污染化合物的生物降解性。而 且， 趋化性可以增加细菌寻找合适碳源和氮源的机 会， 使细菌在有限碳、 氮源环境中与土著微生物的竞 争中表现出优势 。 趋化反应过程中负责信号转导的相关基因相对 保守， 研 究 也 比 较 成 熟， 在大肠杆菌 （ 0"-.#1,-.,) 、3)2’&(#22) "#1&4)1 、!"#$%&’&()" )#1$5,(&") 、! > -&2, ） *$+,%)、 6,7&8,$’ 2#5$’,(&")1$’ 和 9.&%&8)-+#1
表#
9,)3%,( 0"3%( $;/9 K3 L\ L7 K\ K7
和 HDX 培养。 !"$ 分子生物学操作 细菌总 ?TL 的制备、 酶切、 酶连、 载体脱磷、 #: 转化、 质粒提取等操作方法见 $%&’ 普通感受态制备、 参考文献 ［B］ ； ?TL 的回收纯化按照试剂盒说明书 实验中所用 进行； ?TL 测序委托 !"K"7" 公司完成； 的引物及 9O7 扩增条件列于表 F。
涤 & 次， 浓缩后按 & ^ & ^ & 混合 H 种菌液于微孔滤膜 （DVFF 上， 过滤除去滤液， 置于不含抗生素的 >’ 3） $ 培养基上 HDX 培养， 直接 FE+ 后用无菌水洗下菌体， 涂布于含 &DD =S3> L32、 @D =S3> K3 和 @D =S3> 6-, $ $ $ 的 >’ 平板上。 !"* 趋化分析方法 游动平板分析法 （ 6Q",3 2$"-% "(("5） ： 取处于对
!" 卷 # 期 $%%" 年 & 月 ! 日
微 生 物 学 报 !"#$ %&"’()&(*(+&"$ ,&-&"$
（#） ：!"’ ( !"& !" ! )*+, $%%"
! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
趋化信号转导基因 "./! 突变对 01/23(4(-$1 52#&3$ !""#$ 甲基 对硫磷的趋化性及原位降解的影响
文 阳，蒋建东，邓海华，蓝 鸿，李顺鹏"
（南京农业大学生命科学学院 农业部农业环境微生物工程重点开放实验室 南京 $’%%65）
摘
要：!"#$%&’&()" *$+,%) GHH4’ 是一株甲基对硫磷 （IJ） 高效降解菌株， 同时对 IJ 具有趋化性。 -.#/ 基因是菌株
微生物对环境污染物的降解效果不仅仅取决于 降解能力本身， 而且依赖于污染物的生物可利用性
［’， $］ 以及降解性细菌与土著微生物之间的竞争能力 。
本文以本实验室分离到的一株高效甲基对硫磷
［3］ （IJ） 的降解菌株 ! > *$+,%) GHH4’ 为研究对象， 通 ［!］ ， 发现该菌株对 IJ 同样具有趋化 过游动平板法 性。通过基因打靶使 GHH4’ 菌株中单拷贝的趋化信
（L32） 为 &DD 卡那霉素 （ K3） 为 @D 链霉 =S3>， =S3>， $ $ ［&D］ 素 （ 6-, ） 为 @D 每升含 =S3>。 % 趋 化 培 养 基 ： $ （T<E ） KF <9UE DVG=， K<F 9UE DVH=， J=6UE F 6UE &VD=， 琼脂糖 DVFW 。& 趋化缓冲 DVF=， T"O$ DV@=， 2< GVD， ［&&］ 液 ：ED33.$S> KH 9UE ，DVD@W 甘 油，&D33.$S> 2<GVD。 M?!L， !"# 细菌培养 # : $%&’ 和 - : A0.’=( 分别于 >’ 培养基中 HGX
［ ，］ "*.)#1&,%#" 等菌属中都进行了许多研究 ! 5 ，其信号 转导的过程主要通过甲基酯酶 （ RE,S） 和甲基转移 ［#］
号转导基因 （ -.#/ ） 失活， 验证该趋化突变株在土壤 原位条件下对 IJ 的降解能力的变化，研究趋化性 和降解性之间的关系， 阐明趋化性在农药原位降解 中的作用。