阿托伐他汀对高同型半胱氨酸血症诱发动脉粥样硬化的干预作用

心 脏 杂 志 （ Chin Heart J） 2015，27（ 1）
·基础研究·
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阿托伐他汀对高同型半胱氨酸血症 诱发动脉粥样硬化的干预作用
鲍晓梅，郑宏超
（ 上海市徐汇区中心医院心内科，上海 200031）
摘要 目的： 观察阿托伐他汀对动脉粥样硬化斑块的影响，并对其作用机制进行初步探讨。方法： 20 g / L L-蛋氨
关键词： 高同型半胱氨酸血症； 动脉粥样硬化； 阿托伐他汀； 凋亡； 活性氧； NADPH 氧化酶
中图分类号： Ｒ972
文献标识码： A
文章编号： 1009-7236（ 2015） 01-001-06
DOI： 10． 13191 / j． chj． 2015． 0001
网络出版时间： 2014-9-18 10： 01
基金项目： 上海市自然科学基金项目资助（ 12ZＲ1429100） 作者简介： 鲍晓梅，副主任医师，博士 Email： baoxiaomei_nt@ sina． cn
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心 脏 杂 志 （ Chin Heart J） 2015，27（ 1）
Key words： hyperhomocysteinemia； atherosclerosis； atorvastatin； apoptosis； oxidative stress； NADPH oxidase
块中的细胞凋亡指数，NBT 及光泽精化学发光法检测血管局部活性氧（ reactive oxygen species，ＲOS） 水平，光泽精
化学发光法检测主动脉血管 NADPH 氧化酶 （ NADPH oxidase，Nox） 活性，Western 印迹法检 测 Nox4 蛋 白 表 达。
结果： ApoE-/ -小鼠蛋氨酸喂养 3 个月后，血浆 Hcy 水平升高，AS 斑块形成。阿托伐他汀治疗 1 个月后，呈剂量依
BAO Xiao-mei，ZHENG Hong-chao （ Department of Cardiology，Central Hospital，Shanghai Xuhui District，Shanghai 200031，China）
Abstract AIM： To study the protective effects of atorvastatin on hyperhomocysteinemia （ HHcy ） induced atherosclerosis and possible mechanisms． METHODS： Seven-week-old male ApoE-/ - mice were fed with 20 g / L L-methionine for 3 months to establish an atherosclerosis plaque model with HHcy． In the divided groups （ without or with atorvastatin pretreatment for 1 month） ，plasma Hcy levels were measured by high-performance liquid chromatography． Aortic roots were isolated for morphologic pathology and immunohistochemistry and TUNEL analysis were conducted to investigate the apoptosis index in the lesion． Aortic ＲOS production was measured by nitroblue tetrazolium （ NBT） formazan and lucigeninenhanced chemiluminescence，aortic NADPH oxidase activity was evaluated with lucigenin-enhanced chemiluminescence，and NADPH oxidase 4 （ Nox4 ） was evaluated with Western blot． ＲESULTS： Three-month high methionine diet induced the formation of atherosclerosis plaque in the aorta of ApoE-/ mice accompanied by an increase of Hcy in plasma． Administration of atorvastatin for 1 month reduced plasma Hcy level，suppressed development of atherosclerosis plaque，inhibited apoptosis in atherosclerosis plaque and NBT formazan deposit，and decreased ＲOS formation，NADPH oxidase activation and Nox4 expression in the vessel wall． CONCLUSION： Atorvastatin attenuates HHcy-induced atherosclerosis in ApoE-/ - mice． Its mechanism may be related to the inhibition of Nox4-derived oxidative stress and the subsequent decrease of apoptosis of endothelial cells．
网络出版地址： http： / / www． cnki． net / kcms / doi /10． 13191 / j． chj． 2015． 0001． html
Protective effects of atorvastatin against hyperhomocysteinemia-induced atherosclerosis
酸灌胃法建立 ApoE 基因敲除小鼠高同型半胱氨酸血症（ hyperhomocysteinemia，HHcy） 模型，按实验分组，给予不同
剂量阿托伐他汀治疗 1 个月后，用高效液相色谱荧光法测定血浆同型半胱氨酸（ Hcy） 水平，相差显微镜下观察小鼠
主动脉根部病理学形态，免疫组织化学法检测主动脉血管平滑肌 SM-α-actin 的表达，TUNEL 法检测小鼠主动脉斑
1 材料和方法 1． 1 材 料 清 洁 级 ApoE-/ -小 鼠 （ 雄 性、6 周、 C57BL /6J 系） ： 北京实验动物中心； L-蛋氨酸、NADPH、光泽精、SM-α-actin，Nox4 单克隆抗体： Sigma 公 司（ 美国） ； 阿托伐他汀钙： 辉瑞公司（ 美国） ； Hcy 检 测试剂盒： Drew Scientific 公司（ 英国） ； 细胞凋亡原 位检测试剂盒（ in situ cell death detection kit，POD） ： Ｒoche 公司（ 美国） ； 苏木素、伊红、多聚甲醛： 上海试 剂二厂； HＲP 标记 的 抗 小 鼠 二 抗： Santa Cruz 公 司 （ 美国） ； 正常山羊血清封闭液、DAB 显色试剂盒： 博 士德公司。 1． 2 动物分组及模型建立 所有小鼠在瑞金医院 动物实验中心适应性饲养 1 周后（ 即 7 周龄） 开始 实验。小鼠共 80 只，随机分为 4 组，分别为： A 组： 对照组 （ 20 只） ，每天 1 ml 生理盐水灌胃，共 4 个 月； B 组： 蛋氨酸组（ 20 只） 每天 1 ml 20 g / L L-蛋氨 酸灌胃，共 4 个月； C 组： 低剂量阿托伐他汀组（ 20 只） 每天 1 ml 20 g / L L-蛋氨酸灌胃 3 个月后，2 mg / （ kg·d） 阿托伐他汀 + 20 g / L L-蛋氨酸，每天 1 ml 灌 胃 1 个月； D 组： 高剂量阿托伐他汀组（ 20 只） 每天 1 ml 20 g / L L-蛋氨酸灌胃 3 个月后，4 mg / （ kg·d）
大量流行病 hyperhomocysteinemia，HHcy） 是动脉粥样硬化（ atherosclerosis，AS） 性心血管疾病 的独立危险因素。同型半胱氨酸（ Hcy） 不仅对血管 内皮有直接的细胞毒作用，还可通过氧化应激导致 内皮功能障碍，AS 斑块形成［2］。近年来，他汀类药 物降低胆固醇以外的作用越来越受到重视。他汀类 药物可阻止低密度脂蛋白（ LDL） 氧化，而且抑制了 平滑肌细胞增殖，使斑块趋于稳定，减少临床心血管 事件的发 生［3］。 有 研 究 证 明 辛 伐 他 汀 不 仅 可 减 低 大鼠的胆固醇。还可作用于血管细胞 NADPH 氧化 酶来增加内皮型一氧化氮合酶表达及 mＲNA 稳定性， 改善血管 内 皮 舒 张 功 能［4］。 阿 托 伐 他 汀 能 通 过 异 戊二烯通路抑制内皮细胞 NADPH 氧化酶（ NADPH oxidase，Nox） 依赖性活性氧（ reactive oxygen species， ＲOS） 形成，这被认为是阿托伐他汀的抗氧化应激的 重要途径之一［5］。本研究通过建立载脂蛋白（ Apo） E 基因敲除小鼠 HHcy 的动物模型，观察阿托伐他汀 干预性治疗，对 AS 斑块的影响； 并对阿托伐他汀的 作用机制进行初步探讨。
阿托伐他汀 + 20 g / L L-蛋氨酸，每天 1 ml 灌胃 1 个 月。各组均以普通饮食饲养，饮水不限。4 个月后 全部处死采血，取材。 1． 3 标本采集 饲养 4 个月后处死动物，摘眼球方 式取血，分离血浆，－ 70℃ 低温保存备用。摘取主动 脉根部，40 g / L 多聚甲醛再固定 24 h 后行石蜡包 埋，以备病理学和免疫组织化学检测。 1． 4 血清总 Hcy 检 测 将 血 清 从 － 70℃ 冰 箱 取 出，采用高效液相色谱法成批 测 定 血 清 总 Hcy 浓 度。取血清 100 μl 加入 100 g / L 三正丁基膦的 N， N-二甲基甲酰胺溶液 10 μl 混匀，冰浴 10 min。加 入 100 g / L 三氯乙酸 100 μl 混匀，室温放置 10 min， 5 000 g 离心 5 min。取上清 25 μl 加入 12. 5 mmol / L 硼酸缓冲液（ pH9. 5） 62. 5 μl、1. 55 mol / L 氢氧化钠 5 μl 和 ABDF 7. 5 μl 混匀后，60℃ 孵育 1 h，冰水终 止反应。3 000 g 离心 3 min，取上清 10 μl 作高效液 相色谱分析。色谱条件： 色谱柱： 惠普公司 ODS C18 5 μm 反相分析柱（ 250 × 4 mm ID） ； 流动相： V（ 0. 1 mol / L 磷酸二氢钾，以正磷酸调至 pH2. 1） ∶ V（ 120 g / L 乙腈 ） = 90 ∶ 10； 流速： 1. 0 ml / min； 柱温： 24℃ ； 检测波长： 激发波长 385 nm，发射波长 515 nm。按 上述条件，将 Hcy 标准样本和血浆样本进行 HPLC 测定。 1． 5 病理形态学观察动脉斑块面积半定量分析 将取下来的血管组织 100 g / L 甲醛固定，石蜡包埋、 切片、苏木精-伊红（ H-E） 染色，封片。放置 Olympus 显微镜下进行形态学观察。在 10 倍物镜下将 完整的动脉横截面 HE 染色图象摄入图象分析软件 Qwin 2. 0，测定血管壁全层厚度、斑块面积并计算斑 块和血管面积的百分比。每只小鼠随机选取 3 张切 片测定，每张切片分别随机测量 4 处数值后取均数。 1． 6 组织免疫化学 石蜡切片以二甲苯脱脂和梯 度乙醇脱水，采用 S-P 法（ 链霉菌抗生物素蛋白-过 氧化 物 酶 连 接 法，Streptavidin Peroxidase conjugate method） ，参照 SM-α-actin 试剂盒说明书进行观察， 磷酸缓冲液代替一抗为阴性对照，显微镜下全自动 图像分析观察 5 个高倍视野，SM-α-actin 阳性表达 呈棕黄色。PCNA 阳性细胞率 = PCNA 阳性细胞数 / 总细胞数。 1． 7 TUNEL 技术检测小鼠主动脉血管组织中的凋 亡细胞 按细胞凋亡原位检测试剂盒（ Ｒoche 公司） 说明书处理石蜡切片，应用 Axioplan 2 imaging 显微