食品微生物能力验证试验中大肠杆菌O157∶H7的检测
大肠埃希氏菌O157H7NM检验(食品微生物学检验)
食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/N M检验1范围本标准规定了食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM(E s c h e r i c h i a c o l i O157:H7/NM)的检验方法㊂本标准适用于食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM的检验㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:36ħʃ1ħ㊂2.2冰箱:2ħ~5ħ㊂2.3恒温水浴箱:46ħʃ1ħ㊂2.4天平:感量0.1g㊁0.01g㊂2.5均质器㊂2.6显微镜:10倍~100倍㊂2.7无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或移液器及吸头㊂2.8无菌均质杯或无菌均质袋:容量500m L㊂2.9无菌培养皿:直径90mm㊂2.10p H计或精密p H试纸㊂2.11长波紫外光灯:365n m,功率ɤ6W㊂2.12微量离心管:1.5m L或2.0m L㊂2.13磁板㊁磁板架㊁样品混合器㊂2.14微生物鉴定系统㊂3培养基和试剂3.1改良E C肉汤(m E C+n):见A.1㊂3.2改良山梨醇麦康凯琼脂(C T-S MA C):见A.2㊂3.3三糖铁琼脂(T S I):见A.3㊂3.4营养琼脂:见A.4㊂3.5半固体琼脂:见A.5㊂3.6月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MU G(MU G-L S T):见A.6㊂3.7氧化酶试剂:见A.7㊂3.8革兰氏染色液:见A.8㊂3.9 P B S-T w e e n20洗液:见A.9㊂3.10亚碲酸钾(A R级)㊂3.11头孢克肟(C e f i x i m e)㊂3.12大肠埃希氏菌O157显色培养基㊂3.13大肠埃希氏菌O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂㊂3.14鉴定试剂盒㊂3.15抗-E.c o l i O157免疫磁珠㊂第一法常规培养法4检验程序大肠埃希氏菌O157:H7/NM常规培养法检验程序见图1㊂图1大肠埃希氏菌O157:H7/N M常规培养法检验程序5操作步骤5.1增菌以无菌操作取检样25g(或25m L)加入到含有225m L m E C+n肉汤的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1m i n~2m i n;或放入盛有225m L m E C+n肉汤的均质杯中,8000r/m i n~ 10000r/m i n均质1m i n~2m i n㊂36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂5.2分离取增菌后的m E C+n肉汤,划线接种于C T-S MA C平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上, 36ħʃ1ħ培养18h~24h,观察菌落形态㊂在C T-S MA C平板上,典型菌落为圆形㊁光滑㊁较小的无色菌落,中心呈现较暗的灰褐色;在大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上的菌落特征按产品说明书进行判定㊂5.3初步生化试验在C T-S MA C和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上分别挑取5个~10个可疑菌落,分别接种T S I琼脂,同时接种MU G-L S T肉汤,并用大肠埃希氏菌株(A T C C25922或等效标准菌株)做阳性对照和大肠埃希氏菌O157:H7(N C T C12900或等效标准菌株)做阴性对照,于36ħʃ1ħ培养18h~ 24h㊂必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色㊂在T S I琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色,产气或不产气,不产生硫化氢(H2S)㊂置MU G-L S T肉汤管于长波紫外灯下观察,MU G阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生,MU G阴性的应无荧光产生,大肠埃希氏菌O157:H7/NM为MU G试验阴性,无荧光㊂挑取可疑菌落,在营养琼脂平板上分纯,于36ħʃ1ħ培养18h~24h,并进行下列鉴定㊂5.4鉴定5.4.1血清学试验在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落,用O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂作玻片凝集试验㊂对于H7因子血清不凝集者,应穿刺接种半固体琼脂,检查动力,经连续传代3次,动力试验均阴性,确定为无动力株㊂如使用不同公司生产的诊断血清或乳胶凝集试剂,应按照产品说明书进行㊂5.4.2生化试验5.4.2.1自营养琼脂平板上挑取菌落,进行生化试验㊂大肠埃希氏菌O157:H7/NM生化反应特征见表1㊂表1大肠埃希氏菌O157:H7/NM生化反应特征生化试验特征反应三糖铁琼脂底层及斜面呈黄色,H2S阴性山梨醇阴性或迟缓发酵靛基质阳性甲基红-伏普试验(M R-V P)M R阳性,V P阴性氧化酶阴性西蒙氏柠檬酸盐阴性赖氨酸脱羧酶阳性(紫色)鸟氨酸脱羧酶阳性(紫色)纤维二糖发酵阴性棉子糖发酵阳性MU G试验阴性(无荧光)动力试验有动力或无动力5.4.2.2如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统,应从营养琼脂平板上挑取菌落,用稀释液制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定㊂5.4.3毒力基因测定(可选项目)样品中检出大肠埃希氏菌O157:H7或O157:NM时,如需要进一步检测V e r o细胞毒素基因的存在,可通过接种V e r o细胞或H e L a细胞,观察细胞病变进行判定;也可使用基因探针检测或聚合酶链反应(P C R)方法进行志贺毒素基因(s t x1㊁s t x2)㊁e a e㊁h l y等基因的检测㊂如使用试剂盒检测上述基因,应按照产品的说明书进行㊂6结果报告综合生化和血清学试验结果,报告25g(或25m L)样品中检出或未检出大肠埃希氏菌O157:H7或大肠埃希氏菌O157:NM㊂第二法免疫磁珠捕获法7检验程序大肠埃希氏菌O157:H7/NM免疫磁珠捕获法检验程序见图2㊂图2大肠埃希氏菌O157:H7/N M免疫磁珠捕获法检验程序8操作步骤8.1增菌同5.1㊂8.2免疫磁珠捕获与分离8.2.1应按照生产商提供的使用说明进行免疫磁珠捕获与分离㊂当生产商的使用说明与下面的描述可能有偏差时,按生产商提供的使用说明进行㊂8.2.2将微量离心管按样品和质控菌株进行编号,每个样品使用1只微量离心管,然后插入到磁板架上㊂在漩涡混合器上轻轻振荡E.c o l i O157免疫磁珠混悬液后,用开盖器打开每个微量离心管的盖子,每管加入20μL E.c o l i O157免疫磁珠悬液㊂8.2.3取m E C+n肉汤增菌培养物1m L,加入到微量离心管中,盖上盖子,然后轻微振荡10s㊂每个样品更换1只加样吸头,质控菌株必须与样品分开进行,避免交叉污染㊂8.2.4结合:在18ħ~30ħ环境中,将上述微量离心管连同磁板架放在样品混合器上转动或用手轻微转动10m i n,使E.c o l i O157与免疫磁珠充分接触㊂8.2.5捕获:将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠㊂在3m i n内不断地倾斜磁板架,确保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来㊂此时,在微量离心管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物㊂8.2.6吸取上清液:取1支无菌加长吸管,从免疫磁珠聚集物对侧深入液面,轻轻吸走上清液㊂当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时,应放慢速度,以确保免疫磁珠不被吸走㊂如吸取的上清液内含有磁珠,则应将其放回到微量离心管中,并重复8.2.5步骤㊂每个样品换用1支无菌加长吸管㊂免疫磁珠的滑落:某些样品特别是那些富含脂肪的样品,其磁珠聚集物易于滑落到管底㊂在吸取上清液时,很难做到不丢失磁珠,在这种情况下,可保留50μL~100μL上清液于微量离心管中㊂如果在后续的洗涤过程中也这样做的话,脂肪的影响将减小,也可达到充分捕获的目的㊂8.2.7洗涤:从磁板架上移走磁板,在每个微量离心管中加入1m LP B S-T w e e n20洗液,放在样品混合器上转动或用手轻微转动3m i n,洗涤免疫磁珠混合物㊂重复上述步骤8.2.5~8.2.7㊂8.2.8重复上述步骤8.2.5~8.2.6㊂8.2.9免疫磁珠悬浮:移走磁板,将免疫磁珠重新悬浮在100μLP B S-T w e e n20洗液中㊂8.2.10涂布平板:将免疫磁珠混匀,各取50μL免疫磁珠悬液分别转移至C T-S MA C平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板一侧,然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半,再用接种环划线接种平板的另一半㊂待琼脂表面水分完全吸收后,翻转平板,于36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂注:若C T-S MA C平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板表面水分过多时,应在36ħʃ1ħ下干燥10m i n~ 20m i n,涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘㊂8.3菌落识别大肠埃希氏菌O157:H7/NM在C T-S MA C平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上的菌落特征同5.2㊂8.4初步生化试验同5.3㊂8.5鉴定同5.4㊂9结果报告同第6章㊂附录A培养基和试剂A.1改良E C肉汤(m E C+n)A.1.1成分胰蛋白胨20.0g3号胆盐1.12g乳糖5.0gK2H P O4㊃7H2O4.0gK H2P O41.5gN a C l5.0g新生霉素钠盐溶液(20m g/m L)1.0m L蒸馏水1000m LA.1.2制法除新生霉素外,所有成分溶解在水中,加热煮沸,在20ħ~25ħ下校正p H至6.9ʃ0.1,分装㊂于121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂制备浓度为20m g/m L的新生霉素储备溶液,过滤法除菌㊂待培养基温度冷至50ħ以下时,按1000m L培养基内加1m L新生霉素储备液,使最终浓度为20m g/L㊂A.2改良山梨醇麦康凯(C T-S M A C)琼脂A.2.1山梨醇麦康凯(S M A C)琼脂A.2.1.1成分蛋白胨20.0g山梨醇10.0g3号胆盐1.5g氯化钠5.0g中性红0.03g结晶紫0.001g琼脂15.0g蒸馏水1000m LA.2.1.2制法除琼脂㊁结晶紫和中性红外,所有成分溶解在蒸馏水中,加热煮沸,在20ħ~25ħ下校正p H至7.2ʃ0.2,加入琼脂㊁结晶紫和中性红,煮沸溶解,分装㊂于121ħ高压灭菌15m i n㊂A.2.2亚碲酸钾溶液A.2.2.1成分亚碲酸钾0.5g蒸馏水200m LA.2.2.2制法将亚碲酸钾溶于水,过滤法除菌㊂A.2.3头孢克肟(C e f i x i m e)溶液A.2.3.1成分头孢克肟1.0m g95%乙醇200m LA.2.3.2制法将头孢克肟溶解于95%乙醇中,静置1h待其充分溶解后过滤除菌㊂分装试管,储存于-20ħ,有效期1年㊂解冻后的头孢克肟溶液不应再冻存,且在2ħ~8ħ下有效期14d㊂A.2.4C T-S M A C制法取1000m L灭菌融化并冷却至46ħʃ1ħ的山梨醇麦康凯(S MA C)琼脂,加入1m L亚碲酸钾溶液和10m L头孢克肟溶液,使亚碲酸钾浓度达到2.5m g/L,头孢克肟浓度达到0.05m g/L,混匀后倾注平板㊂A.3三糖铁琼脂(T S I)A.3.1成分蛋白胨20.0g牛肉浸膏5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亚铁铵[(N H4)2F e(S O4)2㊃6H2O]0.2g氯化钠5.0g硫代硫酸钠0.2g酚红0.025g或5.0g/L溶液5.0m L琼脂12.0g蒸馏水1000m LA.3.2制法除酚红和琼脂外,将其他成分加于400m L蒸馏水中,煮沸溶解,在20ħ~25ħ下校正p H至7.4ʃ0.2㊂另将琼脂加于600m L蒸馏水中,煮沸溶解㊂将上述两溶液混合均匀后,加入5%酚红水溶液5m L,混匀,分装小号试管,每管约2m L~4m L㊂于121ʎC10m i n或115ʎC15m i n,制成高层斜面㊂冷却后呈桔红色㊂如不立即使用,在2ħ~8ħ条件下可储存一个月㊂A.4营养琼脂A.4.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000m LA.4.2制法将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,校正p H至7.4ʃ0.2,分装㊂于121ħ高压灭菌15m i n㊂A.5半固体琼脂A.5.1成分蛋白胨1.0g牛肉膏0.3g氯化钠0.5g琼脂0.3g~0.4g蒸馏水100m LA.5.2制法将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,校正p H至7.4ʃ0.2,分装小试管,于121ħ高压灭菌15m i n㊂直立凝固备用㊂A.6月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤-M U G(L S T-M U G)A.6.1成分胰蛋白胨20.0g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾(K2H P O4)2.75g磷酸二氢钾(K H2P O4)2.75g十二烷基硫酸钠0.1g4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MU G)0.1g蒸馏水1000m LA.6.2制法将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,于20ħ~25ħ下校正p H至6.8ʃ0.2,分装到带有倒管的试管中,每管10m L,于121ħ高压灭菌15m i n㊂A.7氧化酶试剂A.7.1成分N,N'-二甲基对苯二胺盐酸盐或N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g蒸馏水100m LA.7.2制法少量新鲜配制,于冰箱内避光保存,在7d内使用㊂A.7.3试验方法用无菌棉拭子取单个菌落,滴加氧化酶试剂,10s内呈现粉红或紫红色,即为氧化酶试验阳性㊂不变色者为氧化酶试验阴性㊂A.8革兰氏染色液A.8.1结晶紫染色液A.8.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20m L1%草酸铵水溶液80m LA.8.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.8.2革兰氏碘液A.8.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.8.2.2制法将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.8.3沙黄复染液A.8.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0m L蒸馏水90.0m LG B 4789.36 201611 A .8.3.2 制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A .8.4 染色法A .8.4.1 涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1m i n ,水洗㊂A .8.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1m i n ,水洗㊂A .8.4.3 滴加95%乙醇脱色约15s ~30s ,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂A .8.4.4 滴加复染液,复染1m i n,水洗㊁待干㊁镜检㊂A .9 P B S -T w e e n 20洗液按照商品用E .c o l i O 157免疫磁珠的洗液配方进行制备,或按照下列配方制备㊂A .9.1 成分氯化钠8.0g 氯化钾0.2g 磷酸氢二钠(N a 2H P O 41.15g 磷酸二氢钾(K H 2P O 4)0.2g T w e e n200.5g 蒸馏水1000m LA .9.2 制法将上述成分溶解于水中,于20ħ~25ħ下校正p H 至7.3ʃ0.2,分装锥形瓶㊂121ħ高压灭菌15m i n ,备用㊂。
市售生鲜猪肉中大肠杆菌o157∶h7的检出及分析
实验研究2019年10月下市售生鲜猪肉中大肠杆菌O157∶H7的检出及分析段志刚（郑州市动物卫生监督所，河南郑州 450002）摘 要：目的：了解本市市售生鲜猪肉中是否存在大肠杆菌O157：H7，为预防食源性O157：H7的暴发流行提供依据。
方法：采用常规培养法和普通生化实验对猪肉样品进行分离纯化及初筛，采用多重PCR进行检测。
结果：74份样品中有1份检出大肠杆菌O157：H7，检出率为1.3％。
结论：本市市售生鲜猪肉存在大肠杆菌O157：H7的污染情况，肉品质量与安全应引起高度重视。
关键词：大肠杆菌O157：H7；分离纯化；PCR；食品安全随着社会不断进步，畜产品卫生与安全备受关注。
大肠杆菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）是肠出血性大肠杆菌（简称EHEC）的主要血清型，虽是条件致病菌但致病力强，我国自1988年，已有江苏等省市从腹泻病患者分离到O157：H7。
根据大众网济南2017年7月27日讯，济南检验检疫局首次在济南空港口岸从台湾入境中国籍旅客中检出大肠杆菌O157感染病例。
为了解本市市售生鲜猪肉中是否存在O157：H7，我们分别于2017年10～12月，2018年2～3月分两组对郑州市部分市售生鲜肉进行了大肠杆菌的分离鉴定，并采用双重PCR法对分离株进行鉴定，现报告如下。
1 材料与方法1.1 待检样品检测生鲜猪肉样品分别来自俭学街思达超市、俭学街双汇连锁店、信息学院路丹尼斯超市和金城冷鲜肉四个地点，分3个批次，共27份。
1.2 主要的仪器、培养基、试剂仪器：OLYMPUS光学显微镜；Bio-rad PCR扩增仪等。
培养基：亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、伊红美兰琼脂（EMB）、胆硫乳培养基（DHL）、普通肉汤、甘油等。
PCR反应试剂：2×PCR TaqMix；引物的设计与合成：设计大肠杆菌O157：H7的O157菌体抗原rfbE基因和H7鞭毛抗原fliC基因为靶基因对应的引物，由上海博尚生物技术有限公司合成[2，3]。
大肠杆菌O157：H7 sRNA的筛选及鉴定的开题报告
大肠杆菌O157：H7 sRNA的筛选及鉴定的开题报告一、研究背景和意义大肠杆菌O157：H7是食源性病原菌之一，常引起人类感染，导致严重的食物中毒和肠道疾病。
细胞内调控系统的同源比较研究表明，病原性菌株中存在许多非编码RNA（sRNA），目前已经知道在细菌的基因调控和适应性反应中有着重要的作用。
因此，通过筛选和鉴定大肠杆菌O157：H7中的sRNA，可以深入了解其内部调控机制，为进一步防治大肠杆菌O157：H7感染提供理论基础和新思路。
二、研究内容和方法1.研究内容本研究旨在通过高通量测序技术（RNA-seq）筛选和鉴定大肠杆菌O157：H7中的sRNA，进一步探究其基因调控机制及功能。
2.研究方法（1）细菌培养。
采用大肠杆菌O157：H7作为研究对象，选用LB培养基进行预培养和靶菌的增殖。
（2）RNA提取。
选用RNAiso Plus试剂提取大肠杆菌O157：H7总RNA样品，保护RNA完整性。
（3）sRNA富集。
利用RiboMinus™ Transcriptome Isolation Kit （Bacteria）进行sRNA富集，将大肠杆菌O157：H7总RNA中的rRNA和tRNA等非sRNA分子去除。
（4）建立cDNA文库。
sRNA富集产品经过底物端修复和连接接头，并反转录成cDNA，建立大肠杆菌O157：H7的sRNA cDNA文库。
（5）高通量测序。
将建立的sRNA文库进行高通量测序，得到大肠杆菌O157：H7全基因组的sRNA信息，并利用生物信息学方法对其进行分析和注释。
（6）sRNA功能鉴定。
通过对筛选出的大肠杆菌O157：H7 sRNA序列进行反义RNA表达和靶基因分析等实验手段，进一步探究其功能和调控作用。
三、预期结果和意义通过筛选和鉴定大肠杆菌O157：H7中的sRNA，可以揭示其基因调控机制和适应性反应，为防治大肠杆菌O157：H7的感染提供理论基础和新思路。
该研究可以为食源性病原菌的基因调控和功能研究提供重要的参考和指导，同时可以为抗菌药物的研发和临床应用提供新思路。
大肠杆菌O157：H7及其在食品中的检测
大 小为 ｌ １ ～ ５ｍｍ ， 色 半 透 明 。 而 一 般 的 大 无
１ Ｅ ．。ｉＯ１ ７ Ｈ７ 的 来 源 及 其 在 食 ｌ ５ ： 品 中 的存 在 情 况
一
肠杆 菌 的 菌 落 在 此 培 养 基 上则 呈 粉 红 色。 二
斗 营 Ｏ１ ７ Ｈ７ 曲 致 俪 性 ， 化 特 性 、 测 方 应 及 其 在 赍 品 中 出 现 的 隋况 作 了 辱 统 的 舟 绍 ５： 生 橙 关 键 词 走 晒 萤 （ｌ ７ Ｈ７ 鱼 丽 性 ， 化 壮 眭 ， 删 方 法 ． 品 ）５ ： ， 生 检 食
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大 肠 杆 菌 （Ｉ ７ Ｈ７届 １ 肠 升 血 性 大 肠 ）５ ： ： ｛ 埃 希 氏 杆 莆 （ＥＨＥ ｅ ｔｒｈ ｍｏ ｒ ａ ｉ Ｃ ｎｅ ｏ ｅ ｒｈ ｇｃ Ｅ ｄｌ ｉ ｉ 。ｉ） 感 染 后 的 病 人 会 ｍ 现 血 ｓ ￡ Ⅱｆｌ 。 ｒｈ 样 粪 便 ， 泻 等症 状 腹 进 步 发 展 会 引 起 ｆ 『 “【 Ｉ Ｌ 性 结 肠 炎或 死 １ 率 （ （ ） 高 的 并 发 溶 血性 ： ３） 极 ％
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一
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全国肠出血性大肠杆菌O157H7区监测方案(试行)
全国肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻监测方案（试行）肠出血性大肠杆菌（EHEC）是近年来新发现的危害严重的肠道致病菌。
自1982年美国首次发现因该致病菌引起的食物中毒以来，肠出血性大肠杆菌O157:H7疫情开始逐渐扩散和蔓延，相继在英国、加拿大、日本等多个国家引起腹泻暴发和流行。
我国自1997年在一定范围内开展监测工作以来，已陆续有十余个省份从市售食品、进口食品、家畜家禽、腹泻病患者等分离出肠出血性大肠杆菌O157:H7，特别是1999年我国部分地区发生了肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻的暴发，表明肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻已成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。
为确保早期发现、及时报告疫情，以迅速有效控制疫情，制定此监测方案。
一、监测目的1．早期发现疫情；2．动态观察O157:H7大肠杆菌的分布特征及疾病流行趋势；3．评价各项干预措施的实施效果，为制定有效的防治对策提供依据。
二、监测内容与方法（一）病例定义1.疑似病例具有以下表现之一者即为疑似病例：1.1鲜血便或鲜血样便（血便相混）的腹泻病例；1.2腹泻若干天后继发以少尿或无尿为先驱症状的急性肾功能衰竭（附件4）的病例。
2.确诊病例疑似病例或其他腹泻病例，具有以下条件之一者即为确诊病例：2.1用免疫磁珠法从粪便标本中检测出产志贺毒素的肠出血性大肠杆菌O157:H7（附件2）；或恢复期血清O157 脂多糖（LPS）IgG 抗体呈4倍升高；或经蛋白印记试验证实血清标本有与O157 LPS、或肠出血性大肠杆菌溶血素、或志贺毒素分子量一致的特异性抗体（附件3）；2.2在流行区内，经省级专家组确认，与确诊病例流行病学密切相关，并排除其它疾病的疑似病例，为临床符合病例；2.3腹泻病例的粪便中分离出不产志贺毒素1或志贺毒素2及其变种的肠出血性大肠杆菌O157:H7，亦为确诊病例（不产毒）。
3暴发疫情3.1在1个县（区）或相毗邻的县（区）境内，2周内发现不少于10例的具有显著的流行病学联系，且无其它原因可解释的疑似病例；3.2在1个县（区）或相毗邻的县（区）境内，2周内发现不少于3例的确诊病例。
畜禽产品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测
畜禽产品中肠出血性大肠杆菌O157：H7的检测黄梅清;蔡羲;郑敏;吴南洋【摘要】为了解大肠杆菌O157:H7在畜禽产品中的带菌情况,采集2个屠宰场、福州市部分超市及农贸市场上的畜禽产品(猪肉、禽肉、蛋、内脏)631份.采集的样品经改良EC新生霉素增菌肉汤增菌后,增菌液用快速检测试纸条和酶联免疫反应测试盒进行检测;菌液涂抹于山梨醇麦康凯琼脂平板和大肠杆菌O157显色培养基平板,选取可疑菌落用乳胶凝集试剂盒进行检测,结果均未检出大肠杆菌O157:H7.【期刊名称】《福建畜牧兽医》【年(卷),期】2017(039)004【总页数】2页(P19-20)【关键词】大肠杆菌O157:H7;动物产品;检测;分析【作者】黄梅清;蔡羲;郑敏;吴南洋【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州 350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州 350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州 350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州 350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州 350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州 350013【正文语种】中文大肠杆菌O157：H7是肠出血性大肠杆菌（Enterohem-orrhagic Escherichia coli，EHEHC）的一个主要菌型，是一种新型肠道致病菌[1]。
大肠杆菌O157：H7是目前世界公认的引起食源性疾病的重要致病菌和人兽共患病病原微生物，主要通过食物及饮食、肉及肉制品传播。
由于O157：H7大肠杆菌寄生在牛、猪、鸡等动物肠道内，因此，随粪便排出体外后引起周围环境及食物的污染。
为了调查福州和漳州地区部分屠宰场、超市及农贸市场上畜禽产品（猪肉、禽肉、蛋、内脏）O157：H7的污染情况，共采集631份样品并进行检测，现报告如下。
大肠杆菌O157：H7实时荧光PCR快速检测方法的建立
Ａ ｓ ａｔ ［ ｂｅｔ ｅ Ｔ ｓ ｂｉ ｐｄｓｎｉｖ ａｄｓｅｉｃｄｔ ｔｎｍ ｔ ｄｏ Ｅｅｅ ｃｉ ｃｌＯ５ ｂｔ ｃ： Ｏ ｊｃ ｖ ］ ｏｅｔ ｌｈａｒ ｉ ｅｓｉ ｎ ｐｃｉ ｅ ｃｏ ｅ ｏ ｆ ｓ ｒ ｈａ ｏ Ｉ ｒ ｉ ａ ｓ ａ ｔｅ ｆ ｅ ｉ ｈ ｈｉ ｉ ７
： ７ ｉ ａＭ ｎＰ Ｒ ［ ｔｏ ｓ Ｔ ｅｉ ａ ｒ ｅ ｄｐｏｅｄｐｎ ｉｇ ｎｒ Ｅｇｎ ｙ ａ ｆａ－ Ｈ ｔ Ｔｑ ａ Ｃ ． Ｍｅ ｄ ］ ｏ ｓ ｎａ ｉｏ ｐｉ ｒ ａ ｒ ｅｅｄｎ ｂ ｅｅｂ ｙ ｒ ｗｈ ｈ ｄ ｇ ｐ ｒｆ ｍ ｓ ｎ ｂ ｏ ｆ ｗ ｏｔ
ＯｌＨ Ｘ ｅ ｓｕ ， Ｈ Ｎ Ｙ ｅ ｕ ， Ｈ Ｎ 一ｑ ｇ （ ｕｈｕＭｕｉｐ ｌ ｅｔ ｆｒ ｉ ａ ｏｔ ｌ ｎ ５ ７ ＵＤ — ｈ ｎ Ｓ Ｅ ｕ —ｈａ Ｃ Ｅ Ｇ Ｐ， ７ ｉ Ｈ ｚｏ ｎ ｉ ｎ ｒｏ ｓ ｓ Ｃｎｒ ｄ ｎ ｃａ Ｃ ｅ Ｄ ｅｅ ｏａ
ｐ ｎ Ｌ Ｌ ａ ｄ ０． ￣ ｎ Ｌ ． ｓｓ ｓ ｏ ｅ ｈ ｔｔｅ ｐ ｏ ｅ ｗｅ ｅ ｈｇ ｌ ｏ ｓ ｒａｉｅ ａ ｄ ｓ ｅ ｉｉ． Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｆａｌ１ ｊ ｏ ／ ｎ ８ ｏ ／Ｌ Ｔｅ ｔ ｈ ｗ ｄ ｔ ａ ｈ ｒｂ ｒ ｉｈｙ ｃ ｎ ｅｖ ｔｖ ｎ ｐ ｃｆｃ ｈ ｅｕ ｔ ｏ ０ ｓ ｌ
・检 验 技 术 ・
大肠杆菌 ０５： ７ Ｈ 实时荧光 ＰＲ快速检测方法的建立 ７Ｃ
徐德顺 ， 月华 ， 平庆 （ 沈 程 浙江省湖州市疾病预 防控制 中心，浙江 湖州 ３３ ０ ） １００
摘要 ： ［ 目的 ］ 利用特异性荧光探针 为特点的 Ｔ ｑ ｎ荧光定量 Ｐ Ｒ技术 ， ａＭａ Ｃ 建立大肠杆菌 Ｏ Ｈ 污染的快速敏感 ： ， 特异的检测方法。 ［ 方法］ 以大肠杆 菌 Ｏ ： ｒ Ｅ基因作 为靶序列 ， 。 Ｈ的 ｉ ｂ 设计 一对 引物和探针 ， 以大肠杆 菌 Ｏ Ｈ 菌 ： ， 株提取核酸 Ｄ Ａ作为模板 ， 化引物和探针的浓度 比和 Ｍｇ Ｎ 优 “浓度 ， 以大肠杆菌 ０ ： １ 。 Ｈ 和 ０种相关细菌考核检测体 系的 灵敏性、 稳定 性和特异性。 ［ 结果 ］ 建立 的反 应体 系在 引物和探 针 的浓度 为 ０ ６￣ ｏ／ 、 ． ｐａＬ Ｌ Ｍｇ ． ｔｎ Ｌ Ｌ ０ ８ ，ｏ ／ ， ２ ｎ 浓度为 ４ ｍ ｏ／ ｍ Ｌ Ｌ时， 有 良好 的特异性和敏感性。在 １ 具 Ｏ株相关菌株的检 测 中， 除大肠杆菌 ０ ： ， Ｈ 出现很好 的 阳性外 ， 其余 菌株 均为 阴性。在纯菌条件下， 定量检测低 限为１ ｃ ／ Ｌ 同一样品重复检测 ３次 ｃ 值 的变异 系数均小于５ 。 ［ ７ｆ ｍ 。 ｕ ｔ ％ 结论］
大肠杆菌0157h7
大肠杆菌0157：H7综述食品质量与安全07级2班熊政委222007324212112摘要：肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 为的食源性强致病菌，本文主要阐述了大肠杆菌0157：H7的形态学特征，培养特征，生化特性，抗原特性，致病性，对外界环境的抗性，流行病学特征，检测流程以及控制防范措施。
关键词: 大肠杆菌0157：H7, 形态学特征, 培养特征, 生化特性, 抗原特性, 致病性,对外界环境的抗性,, 流行病学特征, 检测流程以及控制防范措施Abstract: Escherichia coli O157 is a Food-borne pathogen stronger. his article mainly expounds the Escherichia coli 0157: H7 morphology, biochemistry, cultivating characteristics, characteristics of pathogenic antigen and the external environment, the resistance and epidemiological characteristics, testing process and control measures.Keywords: Escherichia coli 0157: H7, morphology, biochemistry, cultivating characteristics, characteristics, pathogenic antigen, the resistance of the external environment, the epidemiological characteristics, testing, process and control measures前言大肠杆菌0157：H7 是肠出血性大肠杆菌（EHEC）的一个主要菌型,其致病力强,对人类健康构成重大威胁, 肠出血性大肠杆菌是由Riley等于1982 年首次报告并确认为致病菌以来此菌在世界范围内形成了多次暴发流行尤其是1996年日本发生的大规模暴发流行感染近万例死亡10 余例,造成严重危害#引起国际社会的广泛关注报道。
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０ 引 言
大肠 杆菌 Ｏ １ ５ ７： Ｈ ７是 肠 出血 性 大肠 埃 希 氏菌 （ Ｅ ＨＥ Ｃ） 众 多 血 清 型 中非 常 重 要 的 一 组 。 自 １ ９ ８ ２ 年美 国首 次 发 生 Ｏ１ ５ ７： Ｈ７型 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 Ｏ １ ５ ７ （ Ｅ Ｈ Ｅ Ｃ） 引起 的食 物 中毒 后 ， 该 菌 引起 的食 品
摘
一
要： 探讨 食品微生物能力验证样 品试验 中大肠杆菌 Ｏ １ ５ ７： Ｈ ７的检验 方法及注意事项 。采用 Ｇ Ｂ ／ Ｔ ４ ７ ８ ９ ． ３ ６ — ２ ０ ０ ８第
法常规培养法 ， 同时挑取可疑特征菌落 进血平板培养试 验 ， 通过 生化试 验和 血清试 验 ， 同时采 用 Ａ Ｐ Ｉ ２ ０ Ｅ生 化鉴 定系统 ， 力 ｆ ｌ 强检验 阳性菌株 的准 确性 。将 可疑菌落经过血平板 培养后 ， 使 阳性菌株鞭毛发育更完 全 ， 有助 于判 断阳性样 品动力问题 。
在我 国动物肉制品中检出率较高 ， 在广东 、 北京等省 市 的多种 食 品 中都 检 测 到 了 Ｏ １ ５ ７： Ｈ７ ［ ２ － ３ ］ ． 因此 ．
加强 食 品大肠 杆 菌 Ｏ１ ５ ７： Ｈ ７检 验 工 作 十分 重 要 。
ห้องสมุดไป่ตู้
为了提高实验室对致病菌的检验鉴定 能力 ． 确保检
验结 果 的可 靠 性 。 ２ ０ １ ６年 ９月 份 ， 河 源 出入 境 检 验
１ ． ４ ． ２ 分 离
能 力验 证 组织 方 （ 广 东 出 入境 检 验 检 疫 局 检 验
检疫技术中心提供样品） 。
１ ． ２ 培 养基 及 试剂
Ｅ Ｃ肉 汤 （ 广 东 环 凯 微 生 物 科 技 有 限公 司 ） ， 山
将上述两个样品 Ｐ Ｔ ２ ８ 、 Ｐ Ｔ ９ ４分 别 划 线 接 种 山 梨 醇麦 康 凯 琼 脂 平 板 和 Ｃ ＨＲ ＭＡ Ｇ Ａ Ｒ Ｏ １ ５ ７显 色 平 板， ３ ６ 。 【 ＝ 培养 ２ ４ ｈ 。
梨醇麦康凯琼脂基础 （ 广东环凯微生物科技有 限公 司） ， Ｃ ＨＲ ＭＡ Ｇ Ａ Ｒ Ｏ１ ５ ７显 色 培养 基 （ 上海 欣 中生 物 工程有限公司） ， Ｌ Ｓ Ｔ — Ｍ Ｕ Ｇ （ 广东环凯微生物科技有
关键词 ： 大肠 杆菌 Ｏ１ ５ ７： Ｈ ７ ； 能力验证试 验
中 图分 类号 ： Ｑ ９ ３ ９ ． １ 文献标识码 ： Ａ Ｉ Ｍ ３ Ｉ ： １ ０ ． １ ６ ４ ２ ８ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｃ ｎ ｌ Ｏ － １ ４ ６ ９ ／ ｔ ｂ ． ２ ０ １ ７ ． ０ ６ ． ０ １ ３
诊 断血 清 Ｏ１ ５ ７ （ 宁 波 天 润 生 物 药 业 有 限公 司 ） ， 大 肠 艾 希 氏 菌诊 断血 清 Ｈ ７ （ 宁 波 天 润 生 物 药 业 有 限 公司） ， 磷 酸盐 缓 冲液 （自制 ） 。 １ ． ３ 试验 仪器
Ｌ Ｒ Ｈ一 ２ ５ ０ Ａ生化 培 养 箱 （ 韶关 市泰 宏 医疗 器 械
限公司） ， 血平板 （ 广东环凯微生物科技有 限公 司） ，
革 兰 氏染 色 液 （ 广 东 环 凯 微 生 物科 技 有 限 公 司 ） 半 固体琼 脂 （ 广 东环 凯 微生 物科 技 有 限公 司 ） ， Ａ Ｐ Ｉ
２ ０ Ｅ生化 鉴定 盒 （ 法 国梅里 埃 公 司 ） ， 大 肠 艾 希 氏菌
参 试作 业 指 导 书 的 要 求 ． 在生 物安全柜 内 ， 用 ５ ｍ Ｌ
磷 酸盐 缓 冲液 水 花样 品， 待 溶解 后 ， 吸 出转 入 ２ ２ ５ ｍ Ｌ 改良Ｅ Ｃ肉汤 中， 用１ ７ ． ５ ｍ Ｌ的稀释液分次清
洗西 林瓶 内壁 ， 回收 清洗 液 加 入 至 上述 的 ２ ２ ５ ｍＬ改 良Ｅ Ｃ肉汤 中。然 后 。 再 将 与 西林 瓶 相 同编 码 的基
有 限公 司） 、 生物安全柜（ 苏州安泰空气技术有限公
司） 、 三 目生物 显色 镜 （ 蔡 司 光学 仪 器 国际 贸 易有 限 公司） 、 高压灭菌锅 （ Ｈ ｉ ｒ ａ ｙ ａ ｍａ公 司 ） 及 其 他 微 生 物 常规设 备
１ ． ４ 试验 方 法及 原理
１ ． ４ ． １ 样 品处 理
按照Ｉ Ｑ Ｔ Ｃ１ ６ Ｂ ０ ９食 品 中大 肠 杆菌 Ｏ １ ５ ７的检 验
检疫综合实验室参加 了由广东出入境检验检疫局检 验检疫技术中心组织的食 品中大肠杆菌 Ｏ １ ５ ７ 能力 验证 ， 本文就能力验证检验 中大肠 杆菌 Ｏ １ ５ ７： Ｈ ７
的分 离 鉴定 和结 果 进行 总结 。
中毒 在美 国、 德 国及 澳 大利 亚 等 地方 不 断 发生 ，
Ｏ １ ５ ７：Ｈ ７的 感 染 因具 有 暴 发 流 行 趋 势 、 强 烈 的致 病 性 与致 死性 以及 抗 生 素治疗 可 能会 加剧 病情 等 特 点． 已 成 为 全 球 性 的 公 共 卫 生 问题 ［ １ ］ ． Ｏ１ ５ ７：Ｈ ７ 具 有 很强 感染 性 ， 其感染人 的最低剂量为 １ ０ ｃ ｆ ｕ ／ ｇ 。
２ ０ １ ７年 第 ６期
文章编号 ： １ ０ ０ ５ — ３ ３ ８ ７ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ６ — ０ ０ ３ ８ — ３ ９
食品微生物能 力验 证试验 中大 肠杆菌 Ｏ １ ５ ７： Ｈ ７的检测
江礼华 王 国胜 丁 宁 钟碧旋
５ １ ７ ０ ０ ０ ）
（ 河源 出入 境检 验 检疫 局 ， 河源
质样 品 加入 到上 述 ２ ２ ５ ｍ Ｌ改 良 Ｅ Ｃ 肉汤 巾 ， 充 分 均
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 样 品
质混 匀 。得 到样 品 编号 Ｐ Ｔ ２ ８ 、 Ｐ Ｔ ９ ４两 个 样 舳 原 液 ， ３ ６ ｑ Ｃ 培养 ２ ４ ｈ 。 同时做 阳性 对 照 。 注意 ： 所 有操 作 中 ， 必 须 在无 菌环 境下 完成 。