骨髓基质干细胞成骨的研究进展
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骨髓基质干细胞在骨科应用研究的现状
２ ６ ０ ９．
Hale Waihona Puke ｔ ｎ Ｊ ． ｐ ｅ ２０ ， １ １ ） １９ ｉ ［ ］ Ｓ ｉ ，０ ６ ３ （ ０ ： ０ ４— ｏ ｎ
１９ ． ０ ９
［５ ｒｉ Ｍａｋ ＬｓＨ ｒｓＦ，ｓ ｍ Ｄ，ｔ ［ ０ ｒｂｒ Ｊｈ ｓｎＴＬ，ｅｌ ｅ ａ． ２ ］Ｅ ｗｎＷ ｒ ， ａ ｅａ Ｉｌ ｅ ３ ］Ｇ ｅ Ｅ， ｎｏ ＬｓｅＫ，ｔ １ ａ ｕ Ｈ ｏ ｉ
霞 ， ， 士生 ， 女 硕 主治 医师 ， 主
要从 事 创 伤 骨 科 研 究 ， ． ａｌ Ｅ ｍ ｉ：
ｈ ｇ ｓ ｙ ｋ ＠ ｙ ｈ ｏ Ｃ Ｂ． ａ ｉｈ ｋ ｓ ｙ ａ ｏ．Ｏ ｃ
成活率高 、 可行 自体 移植避 免 免疫 排斥 反应等优势 ； 骨髓采集较容易 ， 对患者损
徐永 清 ， ， 男 教授 ， 主任 ， 士生 科 博
导师 ， 博士后导师 ， 通讯 作者 ， 主要
。 伤小 。这些优点 使 Ｍ Ｃ 有 良好 的临床 液中可被诱导成骨 Ｊ Ｓｓ 组织工程技术修复腔隙性骨缺损 已 应用前景 ， 且移植 ＭＳ ｓ Ｃ 不存在 伦理 、 道
对 因此 ＭＳ ｓ临床应 用 研 获得成功 ， 大 面积骨 缺损 的修 复也 有 Ｃ 从事创伤 骨科 、 显微 外科 、 外科 德和法律 争 议 ， 手
Ａｕｏｏ ｏ ｓｉｔｒｃｔｂ ａ ｉｃ ｃｌ ｍｐａ — ｔｌｇ ｕ ｎｅｖｒｅ ｒ ｄｓ ｅｌｉ ｌｎ ｌ
ｔｔ ｎ： ｄ ｌ ｕ ｉ ｇ Ｐ ａ ａｉ ａ ｍｏ ｅ ｓｎ ｓ ｍｍｏ ｓ ｏ ｅ ｕ ， ｏ ｍｙ ｂ ｓ ｓ
［ ５ Ｏ ｌ ， ｅ ｉ Ｗｉ ｅＨ Ｊ ｅ ３ ］ ｍ ｏ Ｇ Ｗ Ｎ ｒｃ Ａ Ｇ， ｌ ，ｔ ｒ ｌｈ ｋ
骨髓间充质干细胞膜片的体外构建及成骨分化实验研究
骨髓间充质干细胞膜片的体外构建及成骨分化实验研究目的：探索骨髓间充质干细胞膜片的体外构建简便方法，并评估其成骨分化潜能。
方法：将兔骨髓间充质干细胞高密度接种，在成骨诱导条件下连续培养形成细胞膜片。
通过组织学、碱性磷酸酶活性定量检测、透射电镜和扫描电镜等方法，检测细胞膜片的特性。
结果：高密度连续培养及成骨诱导后形成骨髓间充质干细胞膜片。
HE染色证实膜片是一种由多层细胞和细胞外基质组成的聚集体；茜素红染色呈阳性；碱性磷酸酶定量分析含量较高；扫描电镜及透射电镜检查均见基质中大量的矿化结节聚集。
结论：通过体外简单的连续培养和成骨诱导后，可形成具有良好成骨能力的骨髓间充质干细胞膜片。
标签：间充质干细胞；细胞膜片；成骨分化组织工程技术的出现和兴起标志着再造时代的来临，传统的基于细胞的骨组织工程，是利用大量的种子细胞种植在支架材料上，通过活性因子等诱导细胞分化成骨[1]。
但研究发现该方法存在一些缺点，如细胞利用率低、附着效率差；细胞在支架材料上分布不均；常用的蛋白酶消化收集细胞的方法，会改变细胞的表型和生化成分。
并且，培养过程中细胞分泌的细胞外基质及形成的细胞间连接蛋白也常被破坏[2]。
目前这些问题一直未能圆满解决，已成为限制骨组织工程技术应用于临床的瓶颈。
1993年日本学者Okano等[3]首先报道将聚N-异丙基丙烯酰胺应用到细胞培养上，创新性地发明了细胞膜片技术。
应用特殊的外源性温敏聚合物材料提取完整的细胞聚集体，用于组织工程构建。
该技术借助细胞间的连接以片状形式脱附，保留了基质中细胞与细胞间连接、细胞表面蛋白等，细胞生物学行为和功能得以维持[4]。
在本实验中，笔者探讨体外构建骨髓间充质细胞膜片的培养方法并予以改进，试图进一步缩短膜片培养时间，同时增加膜片厚度，以利于构建组织工程骨。
1 材料1.1 实验动物：3月龄成年新西兰大白兔，体重2.5～3.0kg，由乌鲁木齐总医院实验动物中心提供。
1.2 实验仪器设备：倒置相差显微镜及照相系统（Olympas，日本）；酶联免疫检测仪（BIO-RAD680，美国）；JEM-2000EX透射电镜（JEOM Ltd，日本）；S-3400N 扫描电镜（Hitachi，日本）；X-射线能谱分析仪（Oxford，Link ISIS，英国）。
骨髓基质干细胞定向诱导分化成骨的研究进展
２ （ ）３ ４—３６ ３ ６ ：７ ７．
手术置换二尖瓣均使用机械瓣 ， 二次手术后仍需要长
期抗凝 ， 以对 ６ 所 ０岁 以下 病 人 ， Ｒ选 择 中心 血 流 ｒ Ⅳ 型双 叶机械瓣 ，０岁 以上 病 人 ， 择 生物 瓣 。我们 术 ６ 选 后抗凝 指标 的要 求和 二尖瓣 置换术 近 似 ， 并不 需要 特 别增 加抗凝强 度 ， 目前 为止 未 发 现 血 栓 栓塞 、 到 出血 和 与抗凝有关 的并发 症 。
ｏ ｉ ｓｉ ａ ｅｒｐａｅ ｎ［ ］ Ａ ｎＴ ｏ ｃ ｕｇ２０ ， ｆｒ ｕｐｄｖ ｖ ｌｃｍｅｔＪ ． ｎ ｈｒ ｒ，０ ６ ｔｃ ｌ ｅ ａＳ
８（ ） １ １ ２． １ ４ ： ３ ７—１ ３ ３
（ 收稿 日期 ： １ — ２ ０ 修 回日 ： １ — ３ ０ ） ２ ０ ０—２ ０ 期 ２ ０ ０ — ４ ０
择 ： Ｔ Ｒ 中 ， 人 工 瓣 膜 种 类 的选 择 尚有 争 议 。 在 ｖ 对 有学 者 主张 用机械 瓣 ， 有学 者 主张 用 生物 瓣 Ｊ Ｊ也 ，
参
考
文
献
［］ 冯 震， 巍， １ 何 宋之昭 ， 心脏不停跳二尖瓣置换术心肌 等． 保护的系统评价 ［］广西医学， ０ ， （）６１ ６３ Ｊ． ２ ７２ ５ ： — ４． ０ ９ ４
ｇｒｉｔ ｎｏ ｄｌａ ｏ ：ｈｃ ｏｄ ｅ ｅｃｔ ａｆ ｒ — ｕｇ ａｏ ｒ ｉ ｔｉ ｗ ｉ ｓ Ｕ ｂ ｒｅ ｒ ｕｇ ｔ ｉ ａ ｔｎ ｈｈ ｄ ｄ ｉ ｒ ｏｓ ｉ ｉ
更多学者的研究结果显示两种瓣 膜治疗效果差异无 统计 学意义 Ｊ 。一般 而 言 ， 右心 系 统 因压力 低 ， 流 血
近几十年来 ， 骨髓基质干细胞 （ｏｅ ａ ｏ ｒ ａ ｂｎ ｒｗｓｏ ｌ ｍ ｒ ｔｍ ｃｌ，Ｍ Ｃ ） ｅｓＢ Ｓ ｓ因其具有多方向分化的潜能而进行深人 ｌ 研究。上世 纪 ８ ０年代， ｗ ｎ和 Ｐ ｒ ａ等［ Ｏｅ ｉｓ ｅｍ １ 通过 ， ２ 实验 也已经充分证 明 Ｂ Ｓ ｓ 以分化为成多种 细 Ｍ Ｃ可 胞 Ｊ 。这种多潜能的 Ｂ Ｓ ｓ Ｍ Ｃ 的存在为治疗及修复 骨、 软骨、 肉等结缔 组织的损伤提供 了新的方法。 肌 由于其具有多向分化能力以及易于获得、 后期培养方 法较成熟等优点 ， 目前已成为组织工程学种子细胞研
手术置换二尖瓣均使用机械瓣 ， 二次手术后仍需要长
期抗凝 ， 以对 ６ 所 ０岁 以下 病 人 ， Ｒ选 择 中心 血 流 ｒ Ⅳ 型双 叶机械瓣 ，０岁 以上 病 人 ， 择 生物 瓣 。我们 术 ６ 选 后抗凝 指标 的要 求和 二尖瓣 置换术 近 似 ， 并不 需要 特 别增 加抗凝强 度 ， 目前 为止 未 发 现 血 栓 栓塞 、 到 出血 和 与抗凝有关 的并发 症 。
ｏ ｉ ｓｉ ａ ｅｒｐａｅ ｎ［ ］ Ａ ｎＴ ｏ ｃ ｕｇ２０ ， ｆｒ ｕｐｄｖ ｖ ｌｃｍｅｔＪ ． ｎ ｈｒ ｒ，０ ６ ｔｃ ｌ ｅ ａＳ
８（ ） １ １ ２． １ ４ ： ３ ７—１ ３ ３
（ 收稿 日期 ： １ — ２ ０ 修 回日 ： １ — ３ ０ ） ２ ０ ０—２ ０ 期 ２ ０ ０ — ４ ０
择 ： Ｔ Ｒ 中 ， 人 工 瓣 膜 种 类 的选 择 尚有 争 议 。 在 ｖ 对 有学 者 主张 用机械 瓣 ， 有学 者 主张 用 生物 瓣 Ｊ Ｊ也 ，
参
考
文
献
［］ 冯 震， 巍， １ 何 宋之昭 ， 心脏不停跳二尖瓣置换术心肌 等． 保护的系统评价 ［］广西医学， ０ ， （）６１ ６３ Ｊ． ２ ７２ ５ ： — ４． ０ ９ ４
ｇｒｉｔ ｎｏ ｄｌａ ｏ ：ｈｃ ｏｄ ｅ ｅｃｔ ａｆ ｒ — ｕｇ ａｏ ｒ ｉ ｔｉ ｗ ｉ ｓ Ｕ ｂ ｒｅ ｒ ｕｇ ｔ ｉ ａ ｔｎ ｈｈ ｄ ｄ ｉ ｒ ｏｓ ｉ ｉ
更多学者的研究结果显示两种瓣 膜治疗效果差异无 统计 学意义 Ｊ 。一般 而 言 ， 右心 系 统 因压力 低 ， 流 血
近几十年来 ， 骨髓基质干细胞 （ｏｅ ａ ｏ ｒ ａ ｂｎ ｒｗｓｏ ｌ ｍ ｒ ｔｍ ｃｌ，Ｍ Ｃ ） ｅｓＢ Ｓ ｓ因其具有多方向分化的潜能而进行深人 ｌ 研究。上世 纪 ８ ０年代， ｗ ｎ和 Ｐ ｒ ａ等［ Ｏｅ ｉｓ ｅｍ １ 通过 ， ２ 实验 也已经充分证 明 Ｂ Ｓ ｓ 以分化为成多种 细 Ｍ Ｃ可 胞 Ｊ 。这种多潜能的 Ｂ Ｓ ｓ Ｍ Ｃ 的存在为治疗及修复 骨、 软骨、 肉等结缔 组织的损伤提供 了新的方法。 肌 由于其具有多向分化能力以及易于获得、 后期培养方 法较成熟等优点 ， 目前已成为组织工程学种子细胞研
骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞影响因子的研究进展
为 造 血 实 质 ， 持 造 血 ， 可 分 化 为 多 种 造 血 以 外 的 组 织 细 支 还
胞 。在 实 验 条 件 控 制 下 能 分 化 为 成 骨细 胞 、 软 骨 细 胞 、 肪 成 脂 细胞 、 肌细胞 、 皮细胞 、 经细 胞 、 细 胞 、 肌 细胞 、 成 内 神 肝 心 肺
２ １ 普 通 诱 导 剂 ．
Ｂ Ｃ 向成 骨 细 胞 的 诱 导 尚未 形 成 统 一 方 法 。 前常 用 ＭＳ ｓ 目 的 诱 导 液 是 胎 牛 血 清 低 糖 ＤＭＥ 培 养 液 ，加 入 地 塞 米 松 Ｍ （０Ｓ １一 ｍｍｏ Ｌ 。 ｌ ） Ｂ甘 油 磷 酸 钠 （ 一 Ｐ）维 生 素 Ｃ（０ ／ ）其 ／ １Ｇ 、 ３ ５ ｍｇＬ 。 中地 塞米 松 被 认 为 对 Ｂ Ｓ 向成 骨 细 胞 分 化培 养 液 中迅 速 被 ＡＬ Ｐ水 解 ，产 生 大 量 磷 酸 离 子 ，促 进 生 理 性 钙 盐 的沉 积 和 钙 化 ，这 是 成 骨 的 必要 条 件 １ ９ １ 。
２２ 生长 因子 类 ．
力 和 多 向分 化 潜 能 两 个 重 要 特 征 。除 此 之 外还 有 贴 壁 性 、 异
泸 州 医 学 院 学报
２１ ０ ０年
第３ ３卷
第 ４期
４９ ５
Ｊ ｕ ａ ｆ ｕ ｈ ｕ Ｍｅ ｉａ ｌ ｇ Ｖｏ．３ ｏ４ ２ ０ ｏ ｒ ｌ ｏ ｚ ｏ ｄｃ ｌ ｌ ｅ ｎ Ｌ Ｃｏ ｅ １ Ｎ ． ０１ ３
麓 ＿＿
骨 髓 基 质 干 细胞 诱 导 分 化 为成 骨 细 胞 影 响 因子 的研 究 进 展
它可 诱 导 Ｂ Ｃｓ 化 表 达 骨 钙 素 。增 加 骨 桥 素 和 Ｉ 胶 原 ＭＳ 分 型 ｍＲ ＮＡ．提 高 Ｂ Ｓ 对 甲 状 旁 腺 激 素 和 前 列 腺 素 反 应 的 Ｍ Ｃｓ
细胞生长因子诱导骨髓基质干细胞成骨的研究进展
２４４・综述・细胞生长因子诱导骨髓基质干细胞成骨的研究进展刘道华综述，夏德林审校（泸州医学院附属口腔医院口腔颌面外科，四川泸州６４６０００）关键词：骨髓基质干细胞；骨形态发生蛋白；基因修饰；诱导成骨中图分类号：Ｒ３６５．６８１文献标识码：Ａ文章编号：１６７１—８３４８（２０１０）０２—０２４４—０３骨髓基质干细胞（ｂｏｎｅｍｅｓｅｎｅｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣ）被认为是骨组织工程中最有应用前景的理想种子细胞…。
由于ＢＭＳＣｓ具有分化多方向性的特点，而骨组织Ｔ程学要求其向单一方向分化，所以，ＢＭＳＣｓ的定向诱导具有重要作用。
就其成骨方向来说，常用的具有诱导作用牛长因子有骨形态发生蛋白（ＢＭＰ）、碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）、转化生长因子一口（ＴＧＦ—Ｂ）、胰岛素样生长因子（ＩＧＦ）、ｍ管内皮牛长冈子（ＶＥＧＦ）等。
它们不仅可单独作用，相互之间也存在着密切的兰系，可复合使用。
本文就细胞生长因子对ＢＭＳＣｓ分化及增殖的诱导作用作一综述。
１骨形态发生蛋白（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ。
ＢＭＰ）骨形态发生蛋白（ｂｏｎｅｍｏ叩ｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＭＰ）是一组疏水性的酸性糖蛋白，属于转换牛长因子超家族。
ＢＭＰ是一组具有很强骨诱导活性的生长因子，可能足诱导骨髓基质１：细胞向成骨细胞系转化的基本信号因子，其中研究最多也是成骨活性最强的是ＢＭＰ－２和ＢＭＰ－７。
ＢＭＰ－２可明显加速ＢＭ—ＳＣｓ向成骨细胞转化，．日Ｔ促进成骨细胞Ｉｉｉ『体细胞向成骨细胞转化。
研究表明，ＢＭＰ首先与细胞膜上的丝氨酸／苏氨酸激酶受．体相结合，形成Ｉ、Ⅱ型丝氨酸／苏氨酸激酶受体的ｊ聚体，然后将信息转导入细胞内，经第２信使ＭＡＤ（ｍａｔｈｅｒａｇａｉｎｓｔｄｐｐ）的磷酸化，将信息导入细胞核内，从而激活或调整ＤＮＡ的结合活性，使ＢＭＰ活性相关的基因表达，产生相应的牛物效应。
对ＢＭＰ的骨诱导活性人们看法比较一致，其在体内通过募集问充质细胞，并诱导其向成骨细胞或成软骨细胞方向分化，同时协同其他调节因子共同参与诱导骨形成；在体外不仅能够调节成骨细胞的转化，对骨祖细胞以及间充质细胞均具有强烈的骨诱导活性，而且可能使诱导性骨细胞向确定性骨细胞转化。
骨髓基质干细胞临床研究进展
层 分化 。 于不 同胚 层 的 ＭＳ ｓ 前 体 细胞 还 能 分 化成 与 本 属 Ｃ 或
２０ ０ ９年 ２月第 ６卷第 ４期
・
研 究进 展 ・
骨髓基质 干细胞 临床研 究进展
钦 斌 ． 建 平 蔡
（ ． 京 中医药 大 学 ２ ０ １南 ０ ２级 中西 医结 合 七年 制研 究 生 ， 苏 南京 江
２ ０ ２ ； ． 锡市 中医 院 ， １０ ９ ２无 江苏 无锡
２ ４０ ） １００
解决。
１细 胞 形 态
ห้องสมุดไป่ตู้
④ 细胞 融合入或 核融合 。 当人 Ｍ Ｃ 与热 休克损伤 的上 皮 Ｓｓ
细胞 共 同 培 养 时 ， 分 细 胞 直 接 转 化 成 上 皮 细 胞 而 与其 他 部 细胞 或 上 皮 细胞 融 合 变 成 双 核 细 胞且 表 达上 皮 细 胞 表 面 抗
Ｍ Ｃ 具有 ３种细胞形态 ：①梭形细胞 ；② 巨大扁平细 Ｓｓ 胞； ③体积非常小的球形细胞［ ２ １ 。
【 要】 摘 随着 细胞 研究 的发展 ， 骨髓 基 质 干 细胞 的临床 应 用 越来 越 受 到重 视 。本文 对 骨髓 基 质 干 缏胞 的 生物 学 特性 、 取材 、 分离 、 培养 、 临床 前期 研 究 成果 和 面临 的 问题进 行 了综述 。 【 词Ｊ 关键 骨髓基 质 干 细胞 ； 生物 学特 性 ； 材 ； 离； 养 ； 取 分 培 临床 应 用 【 图分 类号】 ３ ． 中 Ｒ ２２ ９ ［ 标 识码ｌＡ 文献 【 编 号】 １７ － ２ ０ ２ ０ ）２ ａ 一 １ － ２ 文章 ６ ３ ７ １ （０ ９ ０ （ ）０ ０ １
１６ ８ ７年 ， ｏ ｒ ｅ 首 先 提 出 了骨 髓 内含 有 骨 髓 基 质 干 Ｃ ｈｔ ｉ ｈｍ 细胞 （ Ｃ ） ＭＳ ｓ 的观点 ； Ｆ ｉ ｅ — ｔｉ 而 ｒ ｄ ｎ ｓｅ ｅ ｎ于 １ ６ ９ ６年 首先 发 现 ． 它
２０ ０ ９年 ２月第 ６卷第 ４期
・
研 究进 展 ・
骨髓基质 干细胞 临床研 究进展
钦 斌 ． 建 平 蔡
（ ． 京 中医药 大 学 ２ ０ １南 ０ ２级 中西 医结 合 七年 制研 究 生 ， 苏 南京 江
２ ０ ２ ； ． 锡市 中医 院 ， １０ ９ ２无 江苏 无锡
２ ４０ ） １００
解决。
１细 胞 形 态
ห้องสมุดไป่ตู้
④ 细胞 融合入或 核融合 。 当人 Ｍ Ｃ 与热 休克损伤 的上 皮 Ｓｓ
细胞 共 同 培 养 时 ， 分 细 胞 直 接 转 化 成 上 皮 细 胞 而 与其 他 部 细胞 或 上 皮 细胞 融 合 变 成 双 核 细 胞且 表 达上 皮 细 胞 表 面 抗
Ｍ Ｃ 具有 ３种细胞形态 ：①梭形细胞 ；② 巨大扁平细 Ｓｓ 胞； ③体积非常小的球形细胞［ ２ １ 。
【 要】 摘 随着 细胞 研究 的发展 ， 骨髓 基 质 干 细胞 的临床 应 用 越来 越 受 到重 视 。本文 对 骨髓 基 质 干 缏胞 的 生物 学 特性 、 取材 、 分离 、 培养 、 临床 前期 研 究 成果 和 面临 的 问题进 行 了综述 。 【 词Ｊ 关键 骨髓基 质 干 细胞 ； 生物 学特 性 ； 材 ； 离； 养 ； 取 分 培 临床 应 用 【 图分 类号】 ３ ． 中 Ｒ ２２ ９ ［ 标 识码ｌＡ 文献 【 编 号】 １７ － ２ ０ ２ ０ ）２ ａ 一 １ － ２ 文章 ６ ３ ７ １ （０ ９ ０ （ ）０ ０ １
１６ ８ ７年 ， ｏ ｒ ｅ 首 先 提 出 了骨 髓 内含 有 骨 髓 基 质 干 Ｃ ｈｔ ｉ ｈｍ 细胞 （ Ｃ ） ＭＳ ｓ 的观点 ； Ｆ ｉ ｅ — ｔｉ 而 ｒ ｄ ｎ ｓｅ ｅ ｎ于 １ ６ ９ ６年 首先 发 现 ． 它
大鼠骨髓基质干细胞在成骨诱导剂条件下的成骨能力
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｓｒ ｃ
ＡⅡ ： Ｔ ｔ ｄ ｈ ｓｅ ｇ ｎ ｃ ａ ｉｉ ｆ ｂ Ｂ ｒｏ ｔ ｍａ ｔ ｍ ｅ ｌ ｏ ｓｕ ｙ ｔ ｅ ｏ ｔ ｏ ｅ ｉ ｂ ｌｔ ｏ ｏ ｅ ｍａ ｒ ｗ ｓｒ ｙ ｏ ｌ ｓｅ ｃ ｌｓ
Ｃ ｉａ ｈｎ
Ｏ 引 言
Ｃｏｒｓｏ ｄ ｎｅｔ： Ｏｉ Ｓ ｕｊ ｎ Ｍａｔｒ Ｐｏｅｓｒ Ｄ ｐｒｍ ｎ ｏ ｒｅｐ ｎ ｅ ｃ ｏ ｎ ｈ —ａ ， ｉ ｓ ， ｒｆ ｏ， ｅ ａｔ ｅｔ ｆ ｅ ｓ
Ａｎ ｔｍｙ ｉｚ ｏ ｄｃ ｌＣｏｌｇ ，Ｊｎ ｈ ｕ １ ０ ， Ｌａ ｎｎ ｏ ｉｃ ， ａｏ ，Ｊｎ ｈ ｕ Ｍｅ ｉａ ｌｅ ｅ ｉｚ ｏ ２１ ０１ ｉｏ ｉｇ Ｐｒｖｎ ｅ
主 题 词 ： 髓 祖 代 细 胞 ； 生 成 ； 塞 米松 ； 坏 血 酸 骨 骨 地 抗
Ｍ ａ Ｙ ｎ ｓ ｅ ｇ★ ，Ｓｕ ｙｎ ｏ ｓｅ ’ ｅ ｒｅ ｕ —ｈ ｎ ｔｄ ｉｇ ｆｒｍａｔｒ ｓｄ ｇｅ ，Ｌｅｔ ｒｒ ｅ ａ ｍｅ ｔｏ ｃｕｅ ，Ｄ ｐ ｒ ｔ ｎ ｆ
Ａｎ ｔｍｙ ｉｚ ｏ ｄｃ ｌＣｏｌｇ ，Ｊｎ ｈ ｕ １ ０ ，Ｌａ ｎｎ ｒ ｖｎ ｅ ａｏ ，Ｊｎ ｈ ｕ Ｍｅ ｉａ ｌｅ ｅ ｉｚ ｏ ２１ ０１ ｉｏ ｉｇ Ｐ ｏ ｉｃ ，
・
Hale Waihona Puke １ １基础 研 究・
大鼠骨髓基质干细胞在成骨诱导剂条件下的成骨能力★
马云 胜 ， 书俭 ， 树 辉 ， 中 伟 ， 秦 刘 曹 罗 美
酸 成 骨 诱 导 剂 的 培 养 基 中 ， 养 ２ 一 ０ ｄ 应 用 倒 置 显 微 镜 观 察 骨 髓 基 培 ｌ ３ 。
锦 州 医 学 院 解剖 教 研 室 ， 宁 省 锦 州 市 ｌ １０ 辽 ２Ｏ ｌ 马云 胜 ★ ， ，９ ６年 生 ， 宁 省 锦 州 市人 ， 族 ， 州 医 学 院在 读 硕 士 ， 男 １７ 辽 满 锦 讲师， 主要 从 事 骨 组 织 损 伤 与 修 复 方 面 的研 究 。 通 讯 作 者 ： 书 俭 ， 士 ， 授 ， 州 医 学 院 解 剖 教 研 室 ， 宁 省 锦 州 市 秦 硕 教 锦 辽
人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞
１材 料 和 方 法
１１材 料 ．
１ ．． ． ２２细胞 碱 性磷 酸 酶（ Ｌ ） 学 染 色 第 ３代 培 养 细 胞 长 ２ Ａ Ｐ化 满 后 ， 酶 消 化制 成 浓 度 为 ｌ ｌ ５ ｅ ｓ 的 细胞 悬 液 ， 种 胰 ｘ ｏ ｌ／ ｃ ｌ ｍｌ 接
于事 先放 入 盖玻 片 的 ２ ４孔板 内 ，加 入定 量 含 １０ｍｌ ０ ／ Ｌ小牛 血 清 的 Ｄ ＥＭ 培 养 液 ，培 养 ３ｄ后 取 出 ，℃生 理 盐水 冲洗 ， Ｍ ４ 置 于 冷丙 酮 中 固定 １ ｎ 而后 用钙 钴 法 染 色测 定 细胞 ＡＬ ５ｍｉ ， Ｐ 活 性 ， 算 阳性 细胞 百 分 比。 计 １ ．． ． ２３ ２ Ｉ型及 Ⅲ型 胶原 抗 体免 疫 组 化染 色 将 ｌ ｌ ｅｌ ｍ ｘ ０ ｃｌ ／ ｌ ｓ 的成 骨 细 胞 和 成 纤 维 细 胞 悬 液 接 种 于 ２ ４孔 板 内 的 盖 玻 片 上 。培养 ３ｄ后 取 出 。０ｇＬ多 聚 甲醛 ４ ４ ／ ℃下 固定 １ ｎ 乙 ５ｍｉ 。 醇 脱 水后 吹 干 。 以兔 抗 人 Ｉ型及 Ⅲ 型胶 原 抗 体 为 一 抗 。 标 按 准 ＡＢ Ｃ检测 试 剂 盒说 明进 行 免疫 组 织 化 学染 色 。阳性 为黄
照 文 献ｐ 无 菌 条 件下 。 调。 以含 ５ｍ 肝 素钠 生理 盐 水（ ＯＵｍ） ， 于骨 不连 患者 （ 前检 查肝 肾功 能正 常 ， 术 无代 谢性骨病 ， 经患 者同意 ） 髂后 上棘 穿刺抽 取骨 髓组织 ５ｍｌ移入 ， 含 ５ｍｌ 肝素钠盐 水的螺 口试管 内 ， 匀 ， 混 加入含 １ ｉｏｌ ０ｍｌ ｃｌ梯 Ｆ 度液的离心管 中， 进行梯度离 心（０ ０＃ ｎ ２ ， ３ ０ ｍｉｘ ０ ｎ 吸管吸取单 ｍｉ） 核细胞部分 雾状层）以 Ｄ ， ＭＥＭ洗涤 两遍ｆ ０ ０ｒ ｎ ５ｍｉ） １ ０ ／ ｘ ｎ ， ｍｉ 按 １ ｌ ５ ｅｌ ｍ 细 胞 数 接 种 于 ２ 培养 瓶 内 ，加 入 ５ｍｌ ｘ ０ ｌ ／ ｌ ｃ ｓ ５ｍｌ 含 １ ０ｍｌ ０ ／ 牛 血清 的 Ｄ Ｍ， ３ ｏ ５ Ｏ 培养 箱 中培 Ｌ小 ＭＥ 在 ７Ｃ、％Ｃ ２ 养 ，４ ｈ换 液 ， 除悬 浮 细 胞 ， ２ 清 而后 隔 日换 液 ， 察 细 胞 生 长 观 情 况 。细胞 长 满 培养 瓶底 ８ ％后 ， ０ 去培 养 液 ， ０２ ％胰蛋 白 加 ．５ 酶 １ｍｌ ，轻 轻 晃 动培 养 皿 ，使 胰 蛋 白酶 覆 盖 整个 皿 底 ，７ ３ ℃ 消化 ３～ ｎ， 下 见 细胞 皱 缩 ， ５ｍｉ 镜 间距 加 大 ， 离 为单 个 小 圆 分 细胞 时 ，滴 加 ＤＭＥ 培养 液 中止 消化 ，然后 吹打 呈 细胞 悬 Ｍ 液 ， 细胞 悬 液 移 入 １ 将 ５ｍｌ离心 管 ， 心 １ ｎ １０ ｍｉ ， 离 ０ｍｉ ，０ ０ｒ ｎ ／
１１材 料 ．
１ ．． ． ２２细胞 碱 性磷 酸 酶（ Ｌ ） 学 染 色 第 ３代 培 养 细 胞 长 ２ Ａ Ｐ化 满 后 ， 酶 消 化制 成 浓 度 为 ｌ ｌ ５ ｅ ｓ 的 细胞 悬 液 ， 种 胰 ｘ ｏ ｌ／ ｃ ｌ ｍｌ 接
于事 先放 入 盖玻 片 的 ２ ４孔板 内 ，加 入定 量 含 １０ｍｌ ０ ／ Ｌ小牛 血 清 的 Ｄ ＥＭ 培 养 液 ，培 养 ３ｄ后 取 出 ，℃生 理 盐水 冲洗 ， Ｍ ４ 置 于 冷丙 酮 中 固定 １ ｎ 而后 用钙 钴 法 染 色测 定 细胞 ＡＬ ５ｍｉ ， Ｐ 活 性 ， 算 阳性 细胞 百 分 比。 计 １ ．． ． ２３ ２ Ｉ型及 Ⅲ型 胶原 抗 体免 疫 组 化染 色 将 ｌ ｌ ｅｌ ｍ ｘ ０ ｃｌ ／ ｌ ｓ 的成 骨 细 胞 和 成 纤 维 细 胞 悬 液 接 种 于 ２ ４孔 板 内 的 盖 玻 片 上 。培养 ３ｄ后 取 出 。０ｇＬ多 聚 甲醛 ４ ４ ／ ℃下 固定 １ ｎ 乙 ５ｍｉ 。 醇 脱 水后 吹 干 。 以兔 抗 人 Ｉ型及 Ⅲ 型胶 原 抗 体 为 一 抗 。 标 按 准 ＡＢ Ｃ检测 试 剂 盒说 明进 行 免疫 组 织 化 学染 色 。阳性 为黄
照 文 献ｐ 无 菌 条 件下 。 调。 以含 ５ｍ 肝 素钠 生理 盐 水（ ＯＵｍ） ， 于骨 不连 患者 （ 前检 查肝 肾功 能正 常 ， 术 无代 谢性骨病 ， 经患 者同意 ） 髂后 上棘 穿刺抽 取骨 髓组织 ５ｍｌ移入 ， 含 ５ｍｌ 肝素钠盐 水的螺 口试管 内 ， 匀 ， 混 加入含 １ ｉｏｌ ０ｍｌ ｃｌ梯 Ｆ 度液的离心管 中， 进行梯度离 心（０ ０＃ ｎ ２ ， ３ ０ ｍｉｘ ０ ｎ 吸管吸取单 ｍｉ） 核细胞部分 雾状层）以 Ｄ ， ＭＥＭ洗涤 两遍ｆ ０ ０ｒ ｎ ５ｍｉ） １ ０ ／ ｘ ｎ ， ｍｉ 按 １ ｌ ５ ｅｌ ｍ 细 胞 数 接 种 于 ２ 培养 瓶 内 ，加 入 ５ｍｌ ｘ ０ ｌ ／ ｌ ｃ ｓ ５ｍｌ 含 １ ０ｍｌ ０ ／ 牛 血清 的 Ｄ Ｍ， ３ ｏ ５ Ｏ 培养 箱 中培 Ｌ小 ＭＥ 在 ７Ｃ、％Ｃ ２ 养 ，４ ｈ换 液 ， 除悬 浮 细 胞 ， ２ 清 而后 隔 日换 液 ， 察 细 胞 生 长 观 情 况 。细胞 长 满 培养 瓶底 ８ ％后 ， ０ 去培 养 液 ， ０２ ％胰蛋 白 加 ．５ 酶 １ｍｌ ，轻 轻 晃 动培 养 皿 ，使 胰 蛋 白酶 覆 盖 整个 皿 底 ，７ ３ ℃ 消化 ３～ ｎ， 下 见 细胞 皱 缩 ， ５ｍｉ 镜 间距 加 大 ， 离 为单 个 小 圆 分 细胞 时 ，滴 加 ＤＭＥ 培养 液 中止 消化 ，然后 吹打 呈 细胞 悬 Ｍ 液 ， 细胞 悬 液 移 入 １ 将 ５ｍｌ离心 管 ， 心 １ ｎ １０ ｍｉ ， 离 ０ｍｉ ，０ ０ｒ ｎ ／
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高， 且细胞 Ａ Ｐ表达也大大增强［ 。 Ｌ ４ 考虑其原因为机体内部 ］
的氧分压明显低于外界（４ ｍ ｇ ， １０ Ｈ ）特别是骨髓内氧分压 ｍ 只为 ３～５ ｍ ｇ 大约相当于外界的 １３因此 Ｂ Ｃ 长 Ｏ ０ Ｈ ， ｍ ／， ＭＳ ｓ 期暴露于高氧分压的状态， 必将导致细胞过度氧化， 功能下
呈梭形，４ 之内没有形成明显钙化结节。 ＭＳ ｓ １ｄ Ｂ Ｃ 经诱导培 养后的形态主要为多角形， 其贴壁率有所下降， 且在 ｌｂ１ ０ ２ ｄ之内形成明显钙化结节。传代细胞和诱导细胞两者的生长 曲线无统计学差异， 倍增时间为 ３． ～３． ， ３６ ４６ｈ 生长高峰均
相对纯化的基质干细胞。赵子义等 研究发现， 利用免疫磁 珠 标记神经生长因子受体 （ｅｖ ｇｏ ｔ ｆ ｔｒ ｅｅｔｒ ｎｒｅ ｒ ｈ ａ ｏ ｒｃ ｏ ， ｗ ｃ ｐ Ｎ Ｆ 抗体分离、 Ｇ Ｒ） 纯化而获得 Ｎ Ｆ — Ｃ 比同样培养条 Ｇ Ｒ ＭＳ ｓ 件下贴壁法纯化 Ｂ Ｃ 其扩增倍数高出 ２ 个数量级， ＭＳ ｓ ～３ 并
维普资讯
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＰ ａ ｔ ａ ｔ ｏ ａ ｄ ｃ １ １ ， ． Ａｕ ． ０ ７ ｏ ｒ ａ ｒ ｃ ｉ ｌＯｒ ｈ ｐ ｅ ｉｓ Ｖｏ ． ３ Ｎｏ ８， ｇ ２ ０ ｏ ｃ
文 章 编 号 ：Ｏ８ ５ ７ （０ ７ Ｏ —０ ７ — ０ １Ｏ— ５２２０）８ ４２ ３
扩增速度还是扩增倍数上都明显高于高密度接种， 而极低密
度接种（．～１／ｍ ） Ｏ５ ２ｃ 更有利于细胞的增殖。杨柳等人［在 ３ 实验中也发现种植密度较高时， 严重影响 Ｂ Ｃ 的贴壁生 ＭＳ ｓ 长， 考虑为含有的红细胞、 白细胞比重大于 Ｂ Ｃ 而首先沉 ＭＳ ｓ
积于瓶底， 且细胞代谢废物增多所至。 Ｂ Ｃ 成骨活性随着供体年龄增长呈下降趋势， ＭＳ ｓ 年龄
始贴壁（～２ ） １ 的时间和完全贴壁时间（２ ４ ） ｄ １～１ 均长于传 ｄ
量 ； 流式细胞仪法；） ｃ ） ｄ免疫学方法。 免疫选择法通过骨髓基
质干细胞表面带有或缺乏某些抗原标志， 进行筛选， 可获得
代培养的 Ｂ Ｃ 。 ＭＳ ｓ 传代 Ｂ Ｃ 不形成集落 ， ＭＳ ｓ 形态更加单一，
降作用， 这是较简便且实用的分离方法， 它能有效地将红细
胞、 白细胞和间充质细胞分离开来。 ｉｇｏｉ１ Ｌｓ ｎｌ１ ｉ ［ 研究发现， 密 度梯度离心法能增加 Ｂ Ｃ 分化成为成骨细胞克隆的数 ＭＳ ｓ
降。如果体外进行培养的条件与体内氧分压相似， 则更有利
于细胞功能的保留。
顾祖超等人 在实验中发现 ， Ｂ Ｃ 原代培养， 兔 ＭＳ ｓ 其开
细胞中含有 １ Ｂ Ｃ ）因此要求在体外培养扩增后， 个 ＭＳ ｓ ， 才 能达到组织工程学所要求的细胞数 目。 在抽取骨髓血的过程中血 ｍ 量增加而引起有核细胞数的明显下降。 常用获得Ｂ Ｃ 的方法有．） ＭＳ ｓ ａ贴壁法。 所得细胞成分复 杂，ＭＳ ｓ Ｂ Ｃ 的纯度不足．） ｂ密度梯度离心法。该方法基于沉
是有文献报道， 高度传代（ 大于 ２ 代） ＭＳ ｓ中有一部分 ５ 的Ｂ Ｃ
已经表现出凋亡的特征。Ｂ Ｃ 接种密度的大小直接影响 ＭＳ ｓ Ｂ Ｃ 的增殖能力， ＭＳ ｓ 低密度接种（ ００ｃ Ｂ Ｃ 无论在 ５ ０／ ）ＭＳ ｓ ｍ
胞之一。 本文就骨髓基质干细胞成骨问题进行阐述。
１ 骨髓基质干细胞的来源与获取 骨髓基质干细胞可来源于机体各个部位骨髓。 人通常取 白髂骨， 兔取自股骨髁上。对人而言， 不同部位来源的 Ｂ — Ｍ Ｓｓ Ｃ 功能状态不一。 椎骨来源的Ｂ Ｃ 碱性磷酸酶（ｌ ｌ ｅ ＭＳ ｓ ａ ａｎ ｋｉ ｐ ｏｐａ ｓ， Ｌ ） ｈｓｈｔ ｅＡ Ｐ 活性低于股骨来源的Ｂ Ｃ ， ａ ＭＳ ｓ而骨钙素一 ｍ Ｎ Ｒ Ａ的水平较后者高。Ｂ Ｃ 的数量随着年龄的增长也 ＭＳ ｓ
骨 髓基 质 干 细胞 成 骨 的 研 究 进 展
吴 志 明 ， 东 ， 树 伟 王 粟
（ 山西 医科 大 学 第 二 医院 ， 西 太原 山
中 图分 类号 ： ５ Ｑ２ ４ 文 献 标 识 码 ： Ａ
０００） ３０ １
组织工程技术是目前解决大块骨与软骨组织缺损修复
难题最有前景的手段之一， 种子细胞是组织工程学中的重要 环节。 骨髓基质干细胞（ｏｅ ａｒｗｓ ｏ ａ ｃ ｌ，ＭＳ ｓ ｂｎ ｒ ｒｍ ｌｅｓＢ Ｃ ） ｍ ｏ ｔ ｌ 是一类具有多向分化潜能的组织干细胞， 在体内外适当的诱 导环境下可以分化为骨、 软骨、 脂肪、 肌肉、 神经、 肌腱及韧带 等多种组织细胞。该细胞群来源充足， 取材方便， 增殖能力 强， 可在体外大规模扩增而不丢失多向分化潜能， 并且异体 移植免疫排斥反应小， 前已成为应用较广泛的重要种子细 目
越大， 在培养中形成的群落和具有成骨样细胞特点的细胞越 少， 而且细胞对诱导因子的反应敏感性下降。 低氧张力条件下 Ｂ Ｃ 培养， ＭＳ ｓ 其细胞增殖速度大大提
不断减少， 鼠在 ２ 个月时股骨干骨髓中的细胞要少于 ４ １ 个
月时的骨髓细胞。 ＭＳ ｓ Ｂ Ｃ 在骨髓中含量极少（ ×１ 个单核 １ ０
且其内含有更高比例具有多向分化潜能的细胞， 所以分离骨
髓 Ｎ Ｆ 细胞获得的Ｂ ｃ 作为种子细胞应用于组织工 ＧＲ ＭＳ ｓ
程具有明显优势。 但到 目 前为止，ＭＳ ｓ Ｂ Ｃ 的特异性表面抗原
标志仍没有明确， 并且缺少选择性分离 Ｂ ｃ 的方法。 ＭＳ ｓ
２ 骨髓基质干细胞的体外增殖生物学特性 对 Ｂ Ｃ 细胞周期的研究表明， ＭＳ ｓ 其大约有 ２％处于静 ０ 止期 ， 。 即Ｇ 期细胞， 这说明 Ｂ Ｃ 具有强大的增殖能力， ＭＳ ｓ 但