第三章生物药物的微生物限度检查NO
药品微生物限度检查方法验证步骤及示教
药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。
细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。
特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。
2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。
（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。
（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。
6. 写出验证资料。
示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。
2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。
霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。
2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。
药品微生物检验及方法验证
药品微生物限度检查及方法验证从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。
第一部分：外围工作外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。
器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。
培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。
固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。
煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。
万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。
液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。
万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。
消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。
表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。
可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。
另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。
第二部分：检验过程整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。
首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。
进入之前先进行洗手消毒，在一更换鞋，脱去外衣，进入二更，穿洁净工作服，注意穿戴洁净工作衣帽时必须做到衣服的任何部位不得拖地。
药品微生物限度检测技术PPT课件
检
喷雾剂供
查
试品
1.4.2供试品检查
非
无 菌
① 平皿法
平皿法包括倾注法和涂布法
产
品 微 生 物 限 度 检 查
除另有规定外， 取规定量供试 品，按方法适 用性试验确认 的方法进行供 试液制备和菌 数测定，每稀
培养和计数 ：除另有规定外， 胰酪大豆胨琼脂培养基平板 在30～35℃培养3天，沙氏葡 萄糖琼脂培养基平板在20～ 25℃培养5 天，观察菌落生 长情况，点计平板上生长的 所有菌落数，必要时可适当 延长培养时间至7 天进行菌落
微
生
1.3.3计数方法适用性试验
物
限
度
检
查
非 无
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
菌 1.3.1菌液制备及使用
产 品
菌种
微
试验用菌株的传代次数不得超过5
生
代（从菌种保藏中心获得的干燥菌
物
限
种为第0代），并采用适宜的菌种
度
保藏技术进行保存，以保证试验菌
检 查
株的生物学特性
检
查
非
② 薄膜过滤法
无
除另有规定外，按计数方法适用性试
菌
验确认的方法进行供试液制备。取相
产
当于1g、1ml 或10 cm²供试品的供试 液，若供试品所含的菌数较多时，可
品
取适宜稀释级的供试液，照方法适用
微
性试验确认的方法加至适量稀释液中， 立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜， 培养和计数：培养条件
生
菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基 和计数方法同平皿计数
值报告菌数
非
③ MPN 法
无
微生物限度检查
微生物限度检查1. 简介微生物限度检查是一项重要的检验项目，用于评估食品、药品、化妆品和环境样品中微生物污染的程度，以确保产品的安全性和质量。
微生物污染可能导致食品腐败、药品失效或产生有害物质，对人体健康造成潜在风险。
本文将介绍微生物限度检查的目的、方法以及常见的微生物指标和其相关要求。
2. 目的微生物限度检查的主要目的是确定样品中存在的微生物数量和种类，以评估产品是否符合相关法规和标准的微生物要求。
通过检查微生物限度，可以判断产品是否受到过度污染，同时也可以用于监控生产过程和验证清洁措施的有效性。
3. 方法3.1 样品处理在进行微生物限度检查之前，需要对样品进行适当的处理。
处理的方式包括稀释、均质和过滤等。
样品处理的目的是消除潜在抑制因素，使微生物能够在培养基上生长。
3.2 培养基和培养条件微生物限度检查通常使用一系列特定的培养基，以促进特定微生物的生长和检测。
常用的培养基包括营养琼脂、大肠杆菌选择性琼脂、沙门氏菌选择性琼脂等。
在选择培养基时，需要根据待测微生物的生长特性和养分要求进行合理选择。
培养条件包括温度、pH值和培养时间等，对于不同的微生物有着不同的要求。
在进行微生物限度检查时，应该根据标准操作程序严格控制培养条件，以确保检测结果的准确性和可比性。
3.3 统计学方法微生物限度检查的结果通常以菌落形成单位（CFU/g或CFU/mL）来表示。
为了获得可靠的结果，需要根据统计学方法进行合理的菌落计数。
常用的统计学方法包括扩展计数法、减少平均法和最概然数法等。
4. 常见的微生物指标和要求微生物限度检查通常包括总大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌等指标。
下面是常见的微生物指标和其相关要求：4.1 总大肠菌群总大肠菌群是一类常见的肠道微生物，并不是所有菌群都具有病原性，但它们的检测可以反映样品是否受到了粪便或污水等污染。
常见的检测方法包括最概然数法和膈动法。
食品中总大肠菌群的限度一般为每克或每毫升不得检出。
生物药物分析第三章作业答案
单选题1、家兔对热原的反应与人基本相似，因而本法中将一定剂量的供试品溶液注入家兔体内的方式是A.静脉注射B.动脉注射C.腹腔注射D.灌胃正确答案：A试题解析：家兔对热原的反应与人基本相似，因而本法系将一定剂量的供试品溶液，以静脉注射的方式注入家兔体内，在规定的时间内，对家兔体温升高情况进行观察，通过观察结果判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
所以答案为A。
2、用于热原检查后的家兔，如供试品判定为符合规定，若再想供热原检查用，则至少应休息A.12小时B.24小时C.36小时D.48小时正确答案：D试题解析：用于热原检查后的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息48小时方可再供热原检查用。
所以答案为D。
3、细菌霉内素检查法系通过鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量由（）产生的细菌内毒素，以判断供试品中的细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
A.革兰阳性菌B.革兰阴性菌C.金黄色葡萄球菌D.大肠埃希菌正确答案：B试题解析：本法系通过鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中的细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
所以答案为B。
4、下列有关细菌内毒素检查法的叙述哪一项是错的A.每批鲎试剂的灵敏度须用细菌内毒素工作标准品复核B.凝胶法的原理是鲎试剂与内毒素产生凝集反应C.抗生素类药物因具有抗菌活性，不能用凝胶法检查细菌内毒素D.凝集反应的温度规定为37℃±1℃E.凝集反应的时间规定为60分钟±2分钟正确答案：C试题解析：抗生素类药物可以用凝胶法检查细菌内毒素。
所以答案为C。
5、细菌内毒素检查法又称为A.鲎试验法B.临床检查法C.生物效应法D.家兔热原试验法E.放射性检验法正确答案：A试题解析：细菌内毒素检查法又称为鲎试验法。
本法系通过鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中的细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
微生物限度检查法
2． 开启无菌室紫外杀菌灯和空气净化装置，并使其工作不少 于30分钟。
3． 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换 工作鞋。再用0.1％ 苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉 擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩。
4． 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球） 擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊 或剪将供试品启封。 （三）供试液的制备（1：10供试液） 按供试品的理化特性与生物学特性采取适宜的方法制备供试液。 不得改变污染微生物的数量和种类。
③合剂（系指含蜂蜜或王浆者）与滴眼剂可用供试品作为供试 液。（滴眼剂不得检出霉菌和酵母菌）。 含蜂蜜、王浆的制剂 2．固体、半固体或粘稠供试品 称取供试品10g，置装有0.9％无菌氯化钠100ml的匀浆杯中， 用匀浆仪（3000～5000r ／2－4min ），或其他适宜方法（振荡 器或研钵研磨等方法分散混匀，作为供试液。 在制备过程中， 必要时可加适量聚山梨酯－80，并适当加温，但不应超过45℃。
取规定量的供试液，自然沉降5分钟，吸取上层液于（含1％对氨 基苯甲酸1ml）100ml增菌液中，作增菌培养。本法适用于复方磺 胺制剂，如复方磺胺嘧啶片、复方新诺明片等
以上两法适用于难溶于水的抗菌制剂。如磺胺类药
应用沉降法时，供试品应充分研细，并与稀释剂充分摇匀，使污 染菌分散于液相中；沉降时间不宜超过5分钟，以防菌细胞下沉； 取上清液时，避免吸入药渣。
本法适用于水溶性抑菌成分的中、西药品和滴眼剂等制剂的“灭 活”处理。安放滤膜时，注意滤膜与滤器应密合，防止滤膜破损、 漏液。本法所用滤膜孔径0.45um±0.02um。
④（钝化）中和法： 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品， 可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。 磺胺类药物中和法 取规定量含磺胺类的供试品，于100ml增菌液 中加入含1％对氨基苯甲酸约1～5ml（以前讲加入0.5ml）。 本法用于含磺胺较少的制剂，如：三黄软膏、消炎眼药水、斑马 眼药水等。应用本法可因供试品的不同，对氨基苯甲酸的用量可 适当调整。 含砷、汞等重金属药物中和法，取规定量的供试品，加入硫乙醇 酸盐培养基100ml中，作增菌培养。
药品微生物限度检查方法介绍
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菌液的制备（3 菌液的制备（3）
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马 丁琼脂斜面培养基上， 23～28 ℃培 养5～7天，加3~5ml0.9％无菌氯化钠 溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 取1 ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml， 采用10倍递增稀释法，稀释至104~10-6，使细菌数约为50~100cfu/ml。
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供试液的制备（4 供试液的制备（4）
非水溶液性供试品 软膏剂、乳膏剂、称供试品5g（5ml），加到 含已灭菌溶化并45℃保温的乳化剂的烧杯中，用无菌玻棒搅拌混 匀后，慢慢加入45℃左右的稀释剂85ml，边加边搅拌，使供试品 充分乳化，作供试液（1:20）。 油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯—80 5 –8ml，摇匀，再加 入稀释剂至100ml。
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药品微生物限度检查方法介绍
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2005年版微生物限度标准的应用
• 微生物限度检查法：检查非规定灭菌制剂及其原料、 辅料受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生 物污染程度的重要指标，也是对生产企业的设备器具、 工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学 评价的综合依据之一。 • 药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料 的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药 品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度检查 均以本标准为依据。 • 检查项目：细菌数、霉菌数、酵母菌数及 控制菌的检 查。
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菌种
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104] 生孢梭菌(Clostridium 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64941] 白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F) 98001] 白色念珠菌(Candida 黑曲霉(Aspergillus 黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F) 98003] 大肠埃希菌(Escherichia 大肠埃希菌(Escherichia coli)) [CMCC(B) 44102] 枯草芽孢杆菌(Bacillus 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63501]
微生物限度检查与微生物总数检查
在实验结束后，应对实验室进行清洁消毒，避免对环境造成污染。同 时，对使用过的培养基、试剂等进行无害化处理。
THANKS
感谢观看
的接种和培养。
制备过程中，需根据不同样品类 型选择适当的处理方法，如破碎 、研磨、超声波破碎等，以充分
释放微生物。
同时，需注意避免供试液中微生 物的损伤和死亡，以保证后续实
验的准确性。
微生物接种与培养
微生物接种是将制备好的供试液转移到适当的培养基中，以促进微生物的生长和繁 殖。
接种过程中，需注意无菌操作，避免交叉污染。同时，需根据不同微生物的特性选 择适宜的培养基和培养条件。
微生物总数检查的重要性
食品安全
微生物总数是评估食品卫生质量 的重要指标，可以反映食品在生 产、加工、储存、运输等环节的
卫生状况。
药品安全
在药品生产过程中，微生物总数检 查有助于确保药品不受微生物污染 ，保障患者的用药安全。
环境监测
对环境中的微生物进行计数，可以 评估环境的卫生状况，预防疾病传 播。
03
微生物限度检查的实验步骤
供试液制备
供试液制备是微生物限度检查的第一 步，目的是将样品中的微生物充分释 放出来，以便后续的接种和培养。
制备好的供试液应尽快进行后续的接 种和培养，以免微生物死亡或繁殖。
制备过程中，需根据不同样品的性质 选择适当的处理方法，如震荡、超声 破碎、离心等，以充分释放微生物。
目的
确保产品在生产和处理过程中符合微 生物限量标准，保证产品的安全性和 有效性。
微生物限度检查的重要性
保障产品质量
通过微生物限度检查，可以及时发现 并控制微生物污染，从而保证产品的 质量和稳定性。
保障消费者权益
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微生物限度检查常用检验设备及器材
恒温培养箱
30～35℃ 36±1℃
霉菌培养箱
25～28℃
恒温水浴箱
45±1℃
净化工作台
生物显微镜 1500X
体视显微镜或放大镜
电冰箱
电热干燥箱 250～300℃
高压蒸汽消毒器
电子天平或药物天平 感量0.1g
匀浆仪或研钵
锥形瓶 2020/4/26
100ml，250ml，500ml，1000ml
？
2020/4/26
4．含抑菌成分供试品 凡含防腐剂或抑菌成分且影响检验（供试品按常规检查法，加入 规定量的对照菌，不能检出时）的供试品，可根据供试品的性质， 控制菌的特性及检验条件等按以下方法之一或两种以上方法联合 应用处理后，依法检查。同时做阳性和阴性对照。
①稀释法： 将供试品种入较大量的培养基中，使该供试液稀释 至不具抑菌作用的浓度（使该供试液稀释至阳性对照菌能生长的 浓度）。此法用作控制菌检查和限度检查。 本法适用于抑菌作用不强的中药、化学药品的检验。
乙醇灯
康氏振荡器
离心机 500～4000／min 紫外灯 365nm 玻璃或搪瓷消毒缸 （带盖）
大、小橡皮乳头
乙醇棉球或碘伏棉球
灭菌剪刀、镊子、钢锥
灭菌称样纸
灭菌不锈钢药匙
火柴、记号笔（玻璃铅笔） 白瓷盘、洗手盆
实验记录纸
2020/4/26
• 1、含抑菌药物为什么会染菌？ • 2、如何确定含抑菌成分？ • 3、含抑菌成分供试液的制备方法有那些
本法适用于一些抑菌作用不强的中、西药品，如蜜丸、水丸、片 剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂及液体制剂。
③薄膜过滤法： 取规定量的供试液，置稀释剂100ml中，摇匀， 以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45um±0.02um 的微孔滤膜过滤器中，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每 次50～100ml，取出滤膜备检。冲洗时每次最好不少于100ml ， 可以将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养基中，可以用 加入滤器中供试品的量来控制检验量，也可以把滤膜取出来剪成 2～4片，使每片相当于供试品1g或1ml，放入增菌培养基中，作 控制菌检验。
– 保证药品质量 – 检测药物生产工艺的科学性,合理性和管理水平
2020/4/26
第二节 微生物限度检查法
微生物限度检查法系检查非规定灭 菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程 度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌 数、酵菌数及控制菌(致病菌)检查。
2020/4/26
灭菌制剂：系指采用某一物理、化学方
法杀灭或除去所有活的微生物繁殖体和 芽孢的一类药物制剂。
无菌检查
2020/4/26
①注射用制剂 ②眼用制剂 ③植入型制剂 ④创面用制剂 ⑤手术用制剂
操作环境 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的
单向流空气区域内进行。检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止再 污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室 （区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行 洁净验证。 培养温度和时间
本法用于含磺胺较少的制剂，如：三黄软膏、消炎眼药水、斑马 眼药水等。应用本法可因供试品的不同，对氨基苯甲酸的用量可 适当调整。
含砷、汞等重金属药物中和法，取规定量的供试品，加入硫乙醇 酸盐培养基100ml中，作增菌培养。
2020/4/26
2020/4/26
2020/4/26
第一节 生物药物被微生物污染后引起的质量变化
• 药物质量变化原因
– 内因----沉淀,水解,氧化等 – 外因----被微生物污染
• 污染源：制药原料,厂房设备,空气,操作人员,包装 材料等生产环节
2020/4/26
• 一、 生物药物染菌的范围与原因 1.范围 涉及全部剂型，各种药物 2.原因
本检查法中细菌培养温度为30~35ºC；时间为48小时。霉菌、酵母 菌培养温度为23~28 ºC；时间为72小时。控制菌培养温度为35~37 ºC ；时间为48小时。 眼用制剂微生物限度检查用薄膜过滤法，培养时间为7天。
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三 微生物限度检查步骤 1.供试品的制备 2.限度检查方法
①、常规法 ②、稀释法 ③、离心沉淀集菌法 ④、薄膜过滤法 ⑤、中和法 ⑥、离心和培养基稀释法 ⑦、离心和薄膜过滤法
微生物的特征 个体小，种类多，繁殖快
生产过程和设备 “死角”
制药原料和药物本身的性质
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• 二 生物药物被微生物污染后引起的质量变化
– 药品理化性质改变
• 表现为外观、气味、染色、稠度、PH、产生气体等
– 药品含微生物毒性代谢物
• 黄曲霉
– 药效的变化
• 药物失活
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• 三 意义
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本法适用于水溶性抑菌成分的中、西药品和滴眼剂等制剂的“灭 活”处理。安放滤膜时，注意滤膜与滤器应密合，防止滤膜破损、 漏液。本法所用滤膜孔径0.45um±0.02um。
④（钝化）中和法： 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品， 可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。
磺胺类药物中和法 取规定量含磺胺类的供试品，于100ml增菌液 中加入含1％对氨基苯甲酸约1～5ml（以前讲加入0.5ml）。
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②离心沉淀集菌法： 取规定量的供试液于无菌刻度离心管中， 离心（每分钟3000转）30分钟，弃去上清液，留底部集菌液约 2ml ， 再 稀 释 成 原 规 定 的 供 试 液 。 如 有 不 溶 性 药 渣 ， 可 先 离 心 （每分钟500转）5分钟，取全部上层液，再行集菌处理。
直形吸管
1ml，10ml
量杯
10ml
试管
18x180mm，13x200mm，30x200mm
试管筒
培养皿 9cm
培养皿筒
陶瓦盖 12cm
量筒
100ml，500ml，1000ml
滤器及微孔滤膜
孔径0.45±0.02um
注射器
1ml，5ml，10ml，30ml
载玻片及盖玻片
接种针及接种环
试管架
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