碱性磷酸酶-基因实验
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。
正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。
2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg •pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。
骨型碱性磷酸酶
骨型碱性磷酸酶的检测方法和临床应用文章来源：医学网发表时间：2007-07-04 09:51:00关键字：磷酸酶碱性磷酸酶(ALP，EC3. 1.3.1)是在碱性条件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组酶，包括由不同结构基因编码的小肠、胎盘、生殖细胞和非特异型4种同工酶。
前三者基因定位于染色体重2q34-37的相邻位点，后者基因定位于染色体的1q36-34之间，其中非特异性型碱性磷酸酶在基因表达后经过不同的修饰形成肝、肾、骨等次级同工酶。
对这些同工酶的理化性质、分子生物等特性、作用机制的深入研究以及准确的定量测定将有助于其在临床上的应用。
本文拟就年来国际上常用的骨型碱性磷酸酶(BAP)研究方法及其在临床上的应用研究进展作一综述。
1骨型碱性磷酸酶的特性骨型碱性磷酸酶是成骨细胞的一种细胞外酶，为糖蛋白，分子量约为12000道尔顿。
该酶在细胞内合成时新生的酶蛋白先在内质网糖基化，再通过高尔基体转运到细胞膜表面，通过多糖链与磷酯酰肌醇相连嵌合到细胞膜的外浆膜。
在多糖-肌醇磷酸特异水解酶的作用下，骨型碱性磷酸酶能被释放到血循环中。
骨型碱性磷酸酶在机体的生理功用主要是在成骨过程中水解磷酸酯，为羟磷灰石的沉积提供必须的磷酸；同时，水解焦磷酸盐，解除其对骨盐形成的抑制作用，有利于成骨过程。
骨型碱性磷酸酶在体内的其他生化功用有待进一步的阐明。
2骨型碱性磷酸酶的检测人血清中含有的碱性磷酸酶同工酶分别来自骨骼、肝脏、小肠和胎盘组织(在妊娠时)。
胎盘型和小肠型碱性磷酸酶同工酶的活性能相对容易被区分，而区别骨型和肝型这两种同工酶活性就相当困难，因为这两种同工酶来源于同一基因，其动力学性质、电泳迁移率和其他理化性质均十分相似，且相互间有交叉免疫反应，目前鉴别和定量测定骨型碱性磷酸酶的方法可以分为两大类：电泳法和非电泳法。
电泳法主要利不同的同工酶之间物理性状、分子大小及荷电量的不同而进行。
根据所用的支持特和操作的方法可分为：醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和亲和电泳等。
血清碱性磷酸酶ALP测定
血清碱性磷酸酶ALP测定1.实验原理ALP对硝基酚磷酸盐+ H2O —————→磷酸+ 对硝基酚Mg2+在镁离子存在下, 对-硝基酚磷酸盐被ALP分解成磷酸和对-硝基酚,在405nm 的波长下, 对-硝基酚的吸光度增加与ALP的活性成正比。
2. 标本：2.1 病人准备：新鲜血清，采血后应及时分离，避免溶血。
2.2 类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。
3. 标本存放：15～25℃保存可稳定2天；2～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。
4. 标本运输：冰冻条件下保存运输。
5. 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血等存运输的标本。
6. 实验材料6.1 试剂：中生碱性磷酸酶试剂盒（试剂1＋试剂2）6.1.1 试剂组成6.1.3 试剂稳定性与贮存试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂有效期为12个月。
试剂必需避光保存。
试剂不可冰冻。
6.1.4 变质指示：当试剂空白吸光率A405nm(1.0cm)>1.0，或有混浊和可见颗粒时，请不要再使用。
6.1.5 注意事项：试剂请勿直接接触皮肤、眼睛，如有接触，请用大量清水清洗。
请勿吞服。
6.2 校准品：使用OLYMPUS提供的多项校准品对自动分析仪进行校准，参见生化检验校准品和质控品.SOP文件6.3 质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件7. 仪器：奥林巴斯AU640生化分析仪8. 操作步骤8.1 项目基本参数：参见生化检验奥林巴斯AU640生化分析仪项目测定参数.SOP文件。
8.2仪器操作步骤：参见生化检验奥林巴斯AU640生化分析仪操作规程.SOP 文件。
9. 检验结果的判断与分析10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
质控规则参见生化室室内质控操作规程.SOP文件。
11. 计算方法：以OLYMPUS校准品校准仪器后，在病人结果可报告范围内，仪器直接报告可靠的检测结果无需手工计算，以U/L报告。
基因工程考试题目整理
1.如何区分重组DNA和空载体自连：（一）检测方法（1）双抗性筛选：具有四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记，一种抗性标记用来正选择转化子，另一种通过插入失活而可以鉴定重组子。
Ori位于Amp+和tet+这两个基因之间，在四环素平板上出现的菌落一定是获得了质粒的转化子，在此基础上，如果四环素抗性转化子对氨苄青霉素敏感，则说明在载体中有外源片段的插入而使氨苄青霉素抗性失活，即重组子；若对氨苄青霉素有抗性，则此转化子的质粒是空载体。
（2)抗生素插入失活法：如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，但仍能表达氨苄抗性基因，对四环素是敏感的。
筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。
（3）限制性内切酶法：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以通过这些限制性酶酶切重组质粒，电泳分析插入片段长度是否正确。
（抗生素+酶切检测+测序）（4）蓝白斑筛选：多克隆位点存在于编码β-半乳糖苷酶的N端的DNA序列中，与pUC载体一起使用的宿主菌携带编码β-半乳糖苷酶的C端序列的基因片段。
通过α互补机制，两个片段在体内相互弥补，产生一个有活性的β-半乳糖苷酶。
以X-gal作为指示剂。
若通过插入外源DNA到多克隆位点中而打断了β-半乳糖苷酶的部分基因，不能产生有活性的β-半乳糖苷酶，X-gal不会反应，重组子菌落为白色，而自连空载体转化的菌落则是蓝色的。
（5）PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通过PCR的方法进行鉴定（6）菌落原位杂交：把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，然后溶菌，变性并固定DNA，最后用标记的DNA或RNA探针进行杂交来检测这些被转移的菌落或噬菌斑。
（7）测序法：若通过前面这些方法鉴定之后还是有疑虑，不知道是否阳性者确为真阳性而不是空载体自连，可以将其送到生物公司进行测序以最终确定之。
碱性磷酸酶km值测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一：酶促反应动力学实验报告酶促反应动力学实验报告14301050154杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[s]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(michaelis-menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[s]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[s]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[s]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[s]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[s]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取na2hpo4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。
碱性磷酸酶(AKP)的特性分析研究
碱性磷酸酶（AKP）的特性分析研究摘要：碱性磷酸酶（akp）是在碱性条件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组酶，并且在较高温度下仍具有活性。
本实验由含pet21a-akp表达质粒的大肠杆菌制备碱性磷酸酶，通过一系列分离纯化的实验提纯了碱性磷酸酶。
本实验通过对纯化之后的akp进行酶促反应速率曲线的测定、测定激活剂和抑制剂对akp活性的影响、测定抑制剂对酶的动力学参数的影响、测定akp的最适温度和ph以及akp的变性和复性等实验来研究akp的特性。
关键词：碱性磷酸酶（akp）；反应速率曲线；激活剂；抑制剂；变性；复性；酶活力大肠杆菌碱性磷酸酶（ ec. 3. 1. 3. 1），是同二聚体金属酶，能催化非特异性磷酸单酯水解，分子量是56 kda。
它的两个单体结合成具有两个活性中心的对称的活性酶，每个活性中心包含3 个金属原子，即两个锌原子和一个镁原子。
大肠杆菌碱性磷酸酶被phoa 基因编码，和其他分泌蛋白质一样，以在氨基末端带有一个信号肽的前体合成，转录后穿过细胞膜进入细胞质，信号肽被除去，两个成熟的单体二聚化。
碱性磷酸酶即akp来源广泛，可来源于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物及脊椎动物。
akp广泛存在于各种生物体内，参与细胞磷代谢和信号肽转导的一种磷酸酶。
akp能催化除去dna、rna、三磷酸核糖核苷和三磷酸脱氧核糖核苷的5’磷酸基团；去除线状dna两端的5’磷酸可以最大限度地减少质粒dna的自身环化；蛋白质的去磷酸化。
大肠杆菌碱性磷酸酶是一种有用的工具酶，在免疫学研究中常用作酶联试剂，将akp 与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在。
akp作为一种工具酶在表位连锁图谱、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用，在临床上作为同工酶，疾病诊断，研究磷的代谢等。
本实验对碱性磷酸酶的特性研究主要是通过对酶活力的测定来分析的。
酶活性也称为酶活力，按照国际酶学委员会的规定，1个酶活力国际单位是指在最适反应条件（指最适ph、温度25℃等）下，1分钟内能催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。
酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定
米氏常数Km：描述酶与 底物亲和力的常数
底物浓度与反应速率的关 系：底物浓度越高反应速 率越快
酶浓度与反应速率的关系： 酶浓度越高反应速率越快
温度与反应速率的关系： 温度越高反应速率越快
pH值与反应速率的关系： pH值影响酶的活性从而 影响反应速率
Km值的含义与计算方法
Km值：酶促反应中酶的活性与底物浓度的比值表示酶与底物的亲和力 计算方法：通过酶促反应速率与底物浓度的关系曲线利用米氏方程计算得出 Km值的意义：反映酶与底物的亲和力是酶学研究中的重要参数 Km值的应用：在药物设计、酶工程等领域具有重要应用价值
• 实验目的：测定碱性磷酸酶的Km值
• 实验原理：通过酶促反应动力学原理测定酶的活性和底物浓度的关系
• 实验步骤： . 准备实验材料：酶、底物、缓冲液等 b. 设定反应条件：温度、pH值、反应时间等 c. 测定酶活性：通 过酶促反应速率测定酶活性 d. 测定底物浓度：通过酶促反应速率测定底物浓度 e. 计算Km值：通过酶促反应速率和 底物浓度的关系计算Km值
配制反应溶液：按照实 验要求配制反应溶液包 括酶促反应试剂、碱性
磷酸酶、缓冲液等
加入底物：在反应容器 中加入底物并记录底物
浓度
加入酶促反应试剂：在 反应容器中加入酶促反 应试剂并记录酶促反应
试剂浓度
反应开始：在反应容器 中加入碱性磷酸酶并记
录碱性磷酸酶浓度
反应结束：反应进行一 段时间后记录反应时间、
06
实验结论与展望
实验结论总结
实验结果表明碱性 磷酸酶Km值与酶 促反应动力学密切 相关
实验数据表明碱性 磷酸酶Km值在不 同条件下的变化规 律
实验结果对于理解 酶促反应动力学具 有重要意义
碱性磷酸酶
碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织,。
这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。
但它不是单一的酶，而是一组同功酶。
目前已发现有 AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与 AKP6 六种同功酶。
其中第 1 、 2 、 6 种均来自肝脏，第 3 种来自骨细胞，第 4 种产生于胎盘及癌细胞，而第 5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。
血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。
生长期儿童血清内的大多数来自成骨细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。
生物化学特征碱性磷酸酶名字alkaline phosphatase (ALP 或 AKP)碱性磷酸酶属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。
每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。
AKP被phoA 基因编码，与很多分泌蛋白一样，在细胞质内合成氨基末端带有信号肽的单体前体，信号肽引导前体跨内膜运输后被切除，同源二聚体形成。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。
碱性磷酸酶是磷酸酶的一种，磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如ATP，将磷酸基团加到对应底物分子上。
碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，对来源于细菌中的ALP来说，其最适pH是8.0，而对来源于牛的ALP则是8.5。
ALP是一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中（最适Ph为10左右）可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物底物。
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内蒙古大学生命科学学院生物系
基因工程实验室
本科基因工程实验论文开题报告
论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的
构建及在大肠杆菌中的表达
学生姓名：
年级：
专业：
指导教师：
二〇一三年八月十二日
二、实验方案
1．实验内容和实验目标，拟解决的关键问题：
实验内容：包括质粒提取、PCR扩增、转化大肠杆菌、凝胶回收、感受态制备、IPTG 诱导、SDS-PAGE鉴定等。
关键问题：IPTG诱导量及诱导时间的优化；
超声破碎的方案优化。
2. 实验思路、方法、技术路线、实验方案及可行性分析：
实验思路：依据技术路线完成试验。
实验方法：实验室常用技术。
技术路线：
实验方案：详细方案已于讲义给出。
可行性分析：实验室相关技术成熟，实验人员熟悉相关的实验内容以及方法，
实验的可行性很高。
注：本报告务必在实验开始前交实验室教师审查，审查合格后方可开始实验。