实验一---DNA提取
实验一-DNA提取
实验一-DNA提取实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。
2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。
提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。
DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。
以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。
当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。
当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。
为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
植物dna提取实验报告(一)
植物dna提取实验报告(一)植物DNA提取实验报告简介•DNA提取是分子生物学中常用的实验技术之一•本实验的目的是从植物组织中提取纯净的DNA•DNA提取技术的应用广泛，可用于基因测序、基因分型等研究实验步骤1.样品准备–选择新鲜的植物叶片或根部组织作为样品–将样品冷冻在液氮中，研磨成粉末状2.细胞破碎–加入适量的提取缓冲液，研磨样品使细胞破碎–通过高速离心将碎细胞沉淀3.蛋白质去除–加入蛋白酶，去除蛋白质，并通过离心去除残留的碎细胞和蛋白质4.DNA沉淀–加入盐和酒精，使DNA从溶液中沉淀–通过离心收集DNA沉淀物5.DNA纯化–使用乙酸溶解DNA沉淀物–通过离心去除残留的盐和溶液6.DNA浓缩–加入适量的去离子水，使DNA溶解并浓缩结果分析•提取得到的DNA质量和纯度可通过分光光度计测定•纯净的DNA可用于后续实验，如PCR扩增、酶切等实验注意事项•使用无菌操作，避免DNA样品被污染•严格控制实验中的时间和温度，以避免DNA降解•质量好的试剂和实验器材对提取纯净的DNA至关重要结论•通过本实验，成功从植物组织中提取了纯净的DNA•DNA提取技术对于分子生物学研究具有重要意义•进一步研究和应用可拓展DNA提取技术的潜力注意：本实验报告为虚构文章，仅供参考实验结果与讨论本实验成功从植物组织中提取到了纯净的DNA。
经过分光光度计测定，确认提取得到的DNA具有良好的质量和纯度，可以用于后续的实验。
在实验过程中，我们注意到了一些现象和问题，需要进行进一步的讨论。
首先，样品的选择对DNA提取的结果至关重要。
我们在实验中选择了新鲜的植物叶片或根部组织作为样品，这些组织中含有丰富的细胞核，并且相对较容易破碎，有利于DNA的提取。
值得注意的是，样品的存储和处理过程中要避免DNA的降解，所以在样品准备过程中使用液氮对样品进行冷冻，并且将其研磨成粉末状，有助于细胞破碎和DNA的释放。
其次，细胞破碎是DNA提取的关键步骤之一。
实验一 DNA提取
实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。
2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。
提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。
DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。
以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。
当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。
当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。
为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
实验一 基因组DNA的提取
六、操作步骤
1.5ml离心管中加入500μl提取缓冲液 离心管中加入500μl提取缓冲液, 1. 在1.5ml离心管中加入500μl提取缓冲液, 60℃水浴预热 水浴预热。 60℃水浴预热。 植物组织0.1g, 剪碎, 2. 植物组织0.1g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨 成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟 时间长,DNA产量高), 水浴保温30 分钟( ,DNA产量高 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不 时摇动。 时摇动。 加入500μl氯仿/戊醇/乙醇溶液, 500μl氯仿 3. 加入500μl氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混 需带手套, 防止损伤皮肤) 室温下静置5分钟, 匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀) 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
实验一、基因组DNA DNA的提取 实验一、基因组DNA的提取
一、实验目的： 实验目的： 1.了解真核生物基因组DNA提取 的一般原理。 2. 2.掌握DN理，是将分散好 的一般原理， 提取 的一般原理 的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶 和蛋白酶K 的真核生物组织细胞在含 和蛋白酶 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚： 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：异戊 醇抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA 醇抽提的方法去除蛋白质，得到的 经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。 经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。
三、材料
植物组织
四、设备
移液器，冷冻高速离心机， 移液器，冷冻高速离心机，台式高速 离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心 离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心 管。
实验一、血液标本提取DNA(蛋白酶K-酚抽提法)
实验一、血液标本提取DNA（蛋白酶K-酚抽提法）一、实验原理离心分离到外周血的白细胞层；用细胞裂解液溶解细胞膜、核膜，使组蛋白与DNA分离，再用酚、三氯甲烷/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀即可得到基因组DNA片段。
二、实验步骤：1、血液标本处理 1.0ml抗凝全血(ACD、EDTA抗凝均可)2000rpm离心10min（1.5mlEP管）。
轻轻去上清液（血浆），吸出淡黄色悬浮液（白细胞层）置于另一2.0mlEP管中。
（约50μl）2、细胞裂解加入10倍体积组织细胞裂解液，37℃1h，3、加入蛋白酶K消化加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml（约4μl），充分混匀，37℃震荡12-24h或37℃1h后，56℃水浴3h。
保温过程中不时摇动，混匀反应液。
液体逐渐变粘稠，表明已有DNA释放出来，操作应轻柔。
4、酚抽提：将上述溶液冷却至室温，加等体积的Tris饱和酚（pH8.0）溶液，温和缓慢颠倒离心管10min，混匀两相成乳液。
12000rpm 5分钟，两相分层。
用宽口径移液管小心吸出上层粘稠的水相，移至一新的2.0mlEP管中。
（小心一点，不要吸入蛋白层。
如交界处有白色沉淀，需重新抽提有机相，用酚重新抽提两次，合并水相）5、三氯甲烷/异戊醇抽提上清液加等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上层水相0.5ml入另一新的2.0mlEP管；6、DNA沉淀上清液中加0.2倍体积3.0mol/L 醋酸钠，再加2倍体积的4℃冰箱冷却后的无水乙醇，轻柔振摇，充分混匀；应可看到白色絮状物（DNA）。
12000rpm 5分钟，弃上清液；7、纯化：加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 离心5分钟，去上清夜，重复1次；（此过程不得振荡摇动）8、溶解：弃上清液后，自然干燥（挥发痕量乙醇）后，用30μl pH8.0TE完全溶解，保存在-20℃备用。
三、注意事项1、加样准确，操作轻柔；微量加样器绝对不能超过最大量程；2、加酚试剂时，不要接触到皮肤上，有腐蚀性；如不小心弄到，立即用清水冲洗；3、取上清液时，不可吸到下层溶液；4、加TE液后轻摇10min溶解DNA或-4˚C保存待用。
试验一植物基因组DNA提取
实验一植物基因组DNA提取目的：了解植物细胞的特点，掌握植物基因组DNA分离、纯化的原理。
原理：用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品，提取液中的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）能螯合金属离子，以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用，而细胞破碎液中的蛋白酶K在37℃温浴过程中还能降解蛋白质，从而减少了蛋白质对DNA的污染。
然后用CTAB处理，在特定的盐浓度下，CTAB 使基因组DNA处于溶解状态，而蛋白质仍为沉淀。
经细胞破碎液获得的DNA 粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理，其中酚是高效的蛋白变性剂，可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉，然后用氯仿、异戊醇处理，一方面可达到去蛋白的目的，另一方面还可去除残留的酚。
一、材料植物的根、茎、叶。
二、设备移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。
三、试剂1、CTAB或Nacl溶液：4.1克NaCl溶解于80ml水，缓慢加入10克CTAB，加水至100ml。
2、其它试剂：氯仿、异戊醇（24：1），酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），异丙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K（20mg/ml），5mol/LNaCl。
四、操作步骤1、选新鲜无病虫害的叶片用自来水冲洗吸干，用蒸馏水洗两次，然后用超纯水洗一遍，吸干，剪碎称0.5-0.25克。
2、将所取材料放入预冷的研钵（研钵提前要灭菌），研成粉末后置于7ml离心管内（可以换为将样品放置到7ml离心管中800ulＣＴＡＢ后用玻棒捣碎）。
3、加入2.4ml 65℃预热的CTAB，充分混合后65℃水浴90min以上，冷却到室温，加入等体积氯仿异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀4℃离心6000g×10min，取上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇轻轻混匀，-20℃度放置20min，4℃离心5000g×5min，去上清。
4、再沉淀中加入0.6ml的65℃CTAB温育30min，待沉淀充分溶解，加入等体积氯仿异戊醇充分混匀，4℃离心6000g×5min，去上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀-20℃放置20min。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
实验1植物基因组DNA的提取
实验1 转基因植物PCR 检测一、植物DNA 的提取技术(CTAB 法)一、实验目的1.掌握用CTAB 法提取植物总DNA 的方法和基本原理。
2.学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA 抽提方法。
二、原理CTAB 法[十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide ，简称为CTAB)]是一种快速简便的提取植物总DNA 的方法。
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，然后加入CTAB ，CTAB 是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使核酸(DNA 、RNA)得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA 、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA 沉淀，沉淀DNA 溶于TE 溶液中，即得植物总DNA 溶液。
三、实验材料大豆幼苗[材料的采集与保存对提取DNA 的产量和质量有很大影响。
通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料，采集过程中应尽可能保持组织材料所含的水分。
通常的做法是取样时立即用浸湿的纱布包裹采集到的组织材料，放置在带有冷藏功能的采集箱中，这样通常使组织材料在3-5d 内仍然保持新鲜。
野外远距离采集样本时，在可能的条件下应冷冻保存（如放置于液氮中）；当不具备冷冻条件时，最好用盛有无水CaSO4的瓶子分别保存，使其迅速干燥，这种方法可将材料保存数月，返回后应尽快进行DNA 的提取工作。
那些具有大量次生代谢产物（如单宁、酚类、醌类等）的植物材料，应尽可能采集幼嫩组织。
]四、试剂4.1 CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na 2，1.4mol/L NaCl （如表1），2% CTAB ，使用前加入0.1%（V/V ）的β-巯基乙醇。
表1 CTAB 提取缓冲液配制4.2 TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA （ pH8.0）。
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PVP（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离 子化。
2-巯基乙醇作为还原剂可以防止酚类的氧化。适 用于提取新鲜植物以及干品、冷冻品的基因组 DNA。
实验仪器
实验步骤：
1. 取新鲜叶片约3g, 剪碎, 加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中； 2. 在65℃预热的提取液中按3.8g/L加入Na Bisufite, 混匀并调pH至8.0； 3. 在管中加入适量提取液，60℃水浴保温约30min，不时颠倒混匀； 4. 冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，用力摇匀后，放置蛋白(DNP)形式存在于细胞核 中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质 和糖去除，同时除去RNA及无机离子等，从中分离DNA 。
提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法，对它们进行稍 加修改就可以应用于DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂 裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。
入3ml/L NaAc和两倍体积的乙醇， -20 ℃放置1h或过夜； 10.吹干沉淀后，加入适量TE， 65℃溶解， 4℃或-20℃贮存。
1. 植物叶子约3g, 剪碎置预冷研钵中
加入液氮充分研磨， 注意不能干磨
3. 60℃水浴保温30-60min
加入等体积氯仿，用力摇匀
6. 再次10000rpm离心5min； 将上清小心吸入新的离心管中；
DNA提取
SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白 质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏 这种价键。
CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与 脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使 蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。
实验材料和试剂
实验材料：新鲜植物组织。 实验所需试剂：
Email：
课后要求：完成实验报告
注意：实验目的，实验原理， 实验步骤，你的实验材料，结 果，实验中出现的问题以及你 的分析。
再见
核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类 似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸 和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶 于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水， RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈 黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性 或弱碱性溶液中较稳定。
具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨，从而破 碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜， 使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、 氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。
细胞破碎
①机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； ②化学试剂法：用SDS处理细胞； ③酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。
2%
CTAB
0.2% 巯基乙醇
酚/氯仿（1:1） 氯仿：50 ml 无水乙醇
DNA纯化（去杂质）
蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或 氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子 的RNA。 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的 材料。 多糖提取液中加1％PVP。
DNA提取缓冲液
100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)
50mmol/L EDTA
500 mmol/L NaCl
1.5%
SDS
24:1/氯仿:戊醇
其它试剂：液氮、TE缓冲液，无 水乙醇、70%乙醇。
2×CTAB buffer
100mM Tris pH8.0
1.4M NaCl
20 mM EDTA pH8.0
DNA样品在0.9% Agarose胶上电泳（例图）
实验注意事项
1. 微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿等有机 试剂要注意不要将试剂吸入枪中；
2. 提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小 片段，所以为保证DNA的完整性，各步操作均应 较温和，避免剧烈震荡。
3. 尽量取材幼嫩组织，最好在早晨取材，可以避免 过多的糖分污染
15min左右； 5. 室温下10000rpm离心15min，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体
积的冷酒精，-20 ℃放置1h或过夜； 6. 挑出DNA置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入
适量70%酒精，摇动洗涤10min，重复洗涤2-3次； 7. 吹干DNA，加入适量TE在65℃溶解，完全溶解后离心去除杂质； 8. 加入RNase（10mg/mL）, 室温处理0.5-1h, 除去RNA，4℃或-20℃贮存。 9. 如需纯化DNA，再加入适量TE，氯仿/异戊醇多次抽提后吸取上清，加