实验一-DNA提取
实验一---DNA提取
PVP（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离 子化。
2-巯基乙醇作为还原剂可以防止酚类的氧化。适 用于提取新鲜植物以及干品、冷冻品的基因组 DNA。
实验仪器
实验步骤：
1. 取新鲜叶片约3g, 剪碎, 加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中； 2. 在65℃预热的提取液中按3.8g/L加入Na Bisufite, 混匀并调pH至8.0； 3. 在管中加入适量提取液，60℃水浴保温约30min，不时颠倒混匀； 4. 冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，用力摇匀后，放置蛋白(DNP)形式存在于细胞核 中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质 和糖去除，同时除去RNA及无机离子等，从中分离DNA 。
提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法，对它们进行稍 加修改就可以应用于DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂 裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。
入3ml/L NaAc和两倍体积的乙醇， -20 ℃放置1h或过夜； 10.吹干沉淀后，加入适量TE， 65℃溶解， 4℃或-20℃贮存。
1. 植物叶子约3g, 剪碎置预冷研钵中
加入液氮充分研磨， 注意不能干磨
3. 60℃水浴保温30-60min
加入等体积氯仿，用力摇匀
6. 再次10000rpm离心5min； 将上清小心吸入新的离心管中；
DNA提取
SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白 质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏 这种价键。
CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与 脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使 蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。
实验材料和试剂
实验材料：新鲜植物组织。 实验所需试剂：
实验一 DNA提取
实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。
2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。
提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。
DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。
以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。
当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。
当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。
为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
实验一 基因组DNA的提取
六、操作步骤
1.5ml离心管中加入500μl提取缓冲液 离心管中加入500μl提取缓冲液, 1. 在1.5ml离心管中加入500μl提取缓冲液, 60℃水浴预热 水浴预热。 60℃水浴预热。 植物组织0.1g, 剪碎, 2. 植物组织0.1g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨 成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟 时间长,DNA产量高), 水浴保温30 分钟( ,DNA产量高 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不 时摇动。 时摇动。 加入500μl氯仿/戊醇/乙醇溶液, 500μl氯仿 3. 加入500μl氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混 需带手套, 防止损伤皮肤) 室温下静置5分钟, 匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀) 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
实验一、基因组DNA DNA的提取 实验一、基因组DNA的提取
一、实验目的： 实验目的： 1.了解真核生物基因组DNA提取 的一般原理。 2. 2.掌握DN理，是将分散好 的一般原理， 提取 的一般原理 的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶 和蛋白酶K 的真核生物组织细胞在含 和蛋白酶 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚： 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：异戊 醇抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA 醇抽提的方法去除蛋白质，得到的 经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。 经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。
三、材料
植物组织
四、设备
移液器，冷冻高速离心机， 移液器，冷冻高速离心机，台式高速 离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心 离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心 管。
DNA提取方法和步骤
DNA提取方法和步骤DNA提取是生物学实验中常见的操作步骤，用于从细胞或组织中提取纯化DNA。
DNA提取的主要目的是获得纯净的DNA样品，以便进行后续的实验，如PCR、限制酶切、测序等。
下面我们将详细介绍DNA提取的方法和步骤。
1.细胞破碎：将待提取DNA的细胞或组织进行破碎，以释放细胞内的DNA。
细胞破碎的方法有很多种，包括机械破碎、酶解、热破碎等。
其中，常用的方法是机械破碎，如用搅拌器或超声波振荡器将样品强力搅拌或振荡，以破坏细胞膜和细胞壁。
2.蛋白质除去：细胞破碎后，通过蛋白酶的作用，将细胞内的蛋白质降解，并与蛋白质结合的DNA一同除去。
常用的蛋白酶有蛋白酶K、丝氨酸蛋白酶等。
需要注意的是，蛋白酶的适宜浓度和作用时间需要根据实验的要求进行优化。
3.DNA纯化：在蛋白质除去后，将细胞产生的碱基、RNA等杂质与DNA分离。
常用的纯化方法有酚/氯仿方法、盐方法和硅胶柱法等。
其中，酚/氯仿方法是最早被使用的DNA纯化方法，其基本原理是将DNA与蛋白质、RNA等杂质分离，从而得到纯净的DNA。
酚/氯仿方法的步骤如下：a.向破碎细胞溶液中加入等体积的酚/氯仿混合液，轻轻摇晃离心管混匀，使DNA分配在有机相和水相之间。
b.离心管在高速离心机中离心15分钟，使混合液分为有机相、界面层和水相三个层次。
c.使用移液器将上清液（水相）转移到新的离心管中，注意避免吸入有机相。
d. 向上清液中加入1倍体积的冰冷异丙醇（Isopropanol），使DNA沉淀。
使用移液器轻轻颠倒离心管使DNA沉淀。
e.在-20℃冷冻保存30分钟或在室温下沉淀15分钟，以便DNA更好地沉淀。
f.在高速离心机中离心DNA沉淀，沉淀时间约为10分钟，沉淀结束后将上清液倒掉。
g.用70%乙醇洗涤DNA沉淀，然后在室温下晾干。
h.使用适量的缓冲液（如TE缓冲液）重新溶解DNA。
4.DNA沉淀：将纯化后的DNA样品进行沉淀，以去除残留的盐、酚、异丙醇等。
实验一、血液标本提取DNA(蛋白酶K-酚抽提法)
实验一、血液标本提取DNA（蛋白酶K-酚抽提法）一、实验原理离心分离到外周血的白细胞层；用细胞裂解液溶解细胞膜、核膜，使组蛋白与DNA分离，再用酚、三氯甲烷/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀即可得到基因组DNA片段。
二、实验步骤：1、血液标本处理 1.0ml抗凝全血(ACD、EDTA抗凝均可)2000rpm离心10min（1.5mlEP管）。
轻轻去上清液（血浆），吸出淡黄色悬浮液（白细胞层）置于另一2.0mlEP管中。
（约50μl）2、细胞裂解加入10倍体积组织细胞裂解液，37℃1h，3、加入蛋白酶K消化加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml（约4μl），充分混匀，37℃震荡12-24h或37℃1h后，56℃水浴3h。
保温过程中不时摇动，混匀反应液。
液体逐渐变粘稠，表明已有DNA释放出来，操作应轻柔。
4、酚抽提：将上述溶液冷却至室温，加等体积的Tris饱和酚（pH8.0）溶液，温和缓慢颠倒离心管10min，混匀两相成乳液。
12000rpm 5分钟，两相分层。
用宽口径移液管小心吸出上层粘稠的水相，移至一新的2.0mlEP管中。
（小心一点，不要吸入蛋白层。
如交界处有白色沉淀，需重新抽提有机相，用酚重新抽提两次，合并水相）5、三氯甲烷/异戊醇抽提上清液加等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上层水相0.5ml入另一新的2.0mlEP管；6、DNA沉淀上清液中加0.2倍体积3.0mol/L 醋酸钠，再加2倍体积的4℃冰箱冷却后的无水乙醇，轻柔振摇，充分混匀；应可看到白色絮状物（DNA）。
12000rpm 5分钟，弃上清液；7、纯化：加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 离心5分钟，去上清夜，重复1次；（此过程不得振荡摇动）8、溶解：弃上清液后，自然干燥（挥发痕量乙醇）后，用30μl pH8.0TE完全溶解，保存在-20℃备用。
三、注意事项1、加样准确，操作轻柔；微量加样器绝对不能超过最大量程；2、加酚试剂时，不要接触到皮肤上，有腐蚀性；如不小心弄到，立即用清水冲洗；3、取上清液时，不可吸到下层溶液；4、加TE液后轻摇10min溶解DNA或-4˚C保存待用。
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
下面是进行碱裂
解法提取质粒DNA的实验步骤：
1. 培养细胞：选择所需的质粒含有目标基因的细菌，如大肠杆菌等，并在适当的培养基中培养细菌，使其达到对数生长期。
2. 收集细菌：将培养好的细菌菌液转移到离心管中，并进行离心，以沉淀细菌。
3. 溶解细菌：加入一定浓度的碱液（例如0.2N NaOH）使细
菌溶解。
通常使用细菌菌液总量的1/5体积的碱液，并轻轻摇
晃混合。
4. 添加中和液：将等体积的中和液（例如3M乙酸酸化乙酸钠
溶液）加入到溶解好的细菌溶液中，并迅速而轻轻地混合。
5. 离心：将混合液进行离心，以除去沉淀的细菌残渣和碱液。
6. 提取DNA：将上一步离心得到的上清液转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇，并轻轻摇晃，使DNA沉淀。
7. 沉淀DNA：进行高速离心，使DNA沉淀。
8. 弃去上清液：弃去上清液，保留沉淀的DNA。
9. 洗涤DNA：使用70%乙醇洗涤沉淀的DNA，以去除残留的盐类和碱液。
10. 干燥DNA：使用洗涤干净的乙醇或空气干燥DNA沉淀。
11. 溶解DNA：用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解DNA。
12. 储存DNA：将溶解好的DNA储存于适当的温度和条件下，用于后续实验。
dna提取实验报告
dna提取实验报告导言：DNA（脱氧核糖核酸）是人类和其他生物体遗传信息的重要载体。
通过DNA提取实验可以从细胞中分离出DNA，从而进一步研究其结构和功能。
本实验旨在探究DNA提取的原理、步骤和应用，并通过亲自进行实验，加深对DNA提取的理解。
一、DNA提取原理DNA提取的原理基于细胞膜的破裂、细胞核的裂解以及DNA 与其他细胞组分的分离。
这一过程主要包括细胞溶解、DNA纯化和DNA溶解等步骤。
细胞溶解：通过加入试剂体系（如洗涤缓冲液和洗涤液）破坏细胞膜，使细胞内的DNA暴露于溶液中。
DNA纯化：利用盐离子和洗涤液等的特性，将DNA与其他细胞组分分离。
DNA会在高盐浓度下溶于溶液中，而其他细胞组分则难以溶解。
DNA溶解：通过加入合适的缓冲液，使DNA能够在溶液中稳定存在。
二、实验过程1. 实验材料准备本实验所需材料包括：细胞样本、洗涤缓冲液、细胞裂解缓冲液、洗涤液、溶解缓冲液等。
2. 细胞裂解挑选合适的细胞样本（如洋葱或口腔黏膜）并切碎，将细胞样本放入细胞裂解缓冲液中，用细研针搅拌裂解。
3. 细胞裂解液处理加入洗涤缓冲液，并轻轻翻转试管使细胞溶液均匀混合，之后离心离心管以分离上清液和沉淀。
4. DNA纯化将清液转移到新的离心管中，并加入洗涤液。
轻轻翻转试管混合，离心离心管以分离清液和沉淀。
5. DNA溶解将沉淀加入溶解缓冲液中，轻轻翻转试管使其溶解。
三、实验结果与分析通过实验，我们可以观察到DNA溶液呈现出粘稠的透明液体，且能够延展成长丝状。
这表明我们成功从细胞中提取出了DNA。
DNA提取在生物学领域有着广泛的应用。
首先，DNA提取是遗传学研究的基础。
通过DNA提取，可以对生物个体的基因组进行分析，从而了解遗传信息，研究基因突变和遗传疾病等。
其次，DNA提取也常用于法医学和人类学中的个体鉴定。
通过对DNA进行分析，可以确保正确地辨认出身份，并用于破案和家族追溯等方面。
结论：通过本次实验，我们了解了DNA提取的原理和步骤，并成功从细胞中提取出了DNA。
实验一：DNA提取
过柱纯化
得到的DNA样品可作各种分析或在-20℃保存。
DNA提取步骤： 提取步骤： 提取步骤
样品加200µl Extraction buffer，加2粒玻璃珠，漩涡5min，使样品充分悬浮。
细胞裂解
加入200µl SDS buffer (2%SDS)，上下颠倒5min，13000g离心10min 。 将上清液转移到一个新的epp管内。加入400µl 平衡酚， 颠倒epp管混匀样品， 13000g 离心15min。（如果蛋白很多，重复此步骤一次）
DNA的提取是传统分子生物学的常规技术： DNA的提取是传统分子生物学的常规技术： 的提取是传统分子生物学的常规技术
Discard proteins, Lipids and carbohydrates
Isolation of chromosome DNA
环境样品： 环境样品：
种类繁多、组成复杂、物理化学性质多变 纯培养的细胞（inoculated bacteria）通常比环境中的原有的细胞 纯培养的细胞（inoculated bacteria）通常比环境中的原有的细胞 （autochthonous bacteria）更容易裂解(Tsai and Olson 1991a; Tsai, bacteria）更容易裂解(Tsai Marie J. Park et al. 1991b; Jacobsen 1995) 没有一种方法能适用于所有的环境样品，每一种样品根据其特 有的理化和生物学特性，都需要优化出一种特有的提取DNA的 有的理化和生物学特性，都需要优化出一种特有的提取DNA的 方法(Zhou, 方法(Zhou, Bruns et al. 1996)。 1996)。
将上清转移到一个新的epp管内。加入200µl 苯酚和200µl氯仿， 颠倒混匀。13000g 离心15min。 将上清转移到一个新的epp管内。加入400µl氯仿，颠倒混匀。13000g 离心15min。 将上清液转移到一个新的epp管内，加入0.6倍体积异丙醇， 上下颠倒混匀。-20℃放置1h或过夜进行沉淀。 14000g离心样品20min，倒掉上清液。样品放在冷冻干燥机内， 干燥15-30分钟。溶于10µl ddH2O 或TE buffer 中
dna提取实验步骤
dna提取实验步骤DNA提取是分子生物学中的一项重要实验技术，它可以从细胞中提取出DNA，并用于后续的分子生物学研究。
本文将介绍DNA提取的实验步骤。
一、实验前准备1.1 材料准备为了进行DNA提取实验，我们需要准备以下材料：- 细胞样本：可以是动物组织、细菌、植物组织等。
- 细胞裂解缓冲液：含有离子洗涤剂、蛋白酶K等。
- 高盐溶液：用于沉淀DNA。
- 各种浓度的酒精：用于沉淀DNA。
- 离心管、试管等实验器材。
1.2 实验环境准备- 实验室应保持清洁整洁，避免污染DNA样本。
- 使用无菌技术进行操作，避免外源DNA的污染。
二、细胞裂解2.1 细胞破碎将细胞样本放入离心管中，加入适量的细胞裂解缓冲液，用振荡器或超声波进行细胞破碎，使细胞膜破裂，释放出细胞内的DNA。
2.2 蛋白酶处理加入适量的蛋白酶K，使其降解细胞中的蛋白质，释放出DNA。
同时，离子洗涤剂可以使DNA保持在溶液中，避免沉淀。
三、DNA纯化3.1 加入高盐溶液为了沉淀DNA，需要加入高盐溶液。
高盐溶液中的离子浓度较高，可以与DNA中的离子结合，使DNA形成沉淀。
3.2 离心沉淀将样品离心，沉淀下的DNA会在离心管底部形成一个白色沉淀。
去除上层液体后，可以看到这个沉淀。
四、DNA沉淀4.1 加入酒精为了进一步沉淀DNA，可以加入适量的酒精。
酒精会使DNA分子凝聚在一起，形成可见的白色沉淀。
4.2 离心沉淀再次进行离心操作，将上层的液体去除后，可以看到沉淀。
注意，沉淀的DNA非常脆弱，操作时要轻柔避免破坏。
五、洗涤和溶解5.1 洗涤为了去除沉淀中的杂质，可以使用70%的乙醇洗涤DNA沉淀。
将乙醇加入离心管中，轻轻摇晃，使DNA充分溶解。
5.2 溶解将洗涤后的DNA沉淀用适量的缓冲液溶解，使其完全溶解。
六、质量检测为了确保提取到的DNA质量良好，可以使用紫外可见光谱仪或凝胶电泳进行质量检测。
通过测量DNA的吸光度或检测DNA在凝胶上的迁移情况，可以评估提取到的DNA的纯度和完整性。
实验一 真核生物基因组DNA的提取和分析
（八）废弃液体除指定有专门容器收集者外，应倒 入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。 动物尸体应放入指定的容器中。
（九）实验过程中自己不能解决或决定的问题，切 勿盲目处理，应及时向指导教师反映取得帮助。
（十）实验完毕，须将试剂排列整齐，整理好公用 物品，将仪器洗净收起。檫净实验台，请指导教 师检查，允许后方可离开。
1) 破碎细胞 2) 去除蛋白质，糖类等等生物大分子；由于真核细胞 基因组较大，在纯化出的DNA的操作中应注意动作轻 柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学 作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA 3) 沉淀核酸
DNA提取和分析步骤图解
SDS裂解 蛋白酶K消化
酚氯仿抽提
二苯胺法
紫外分光光度法分析
答辩ppt内容： 实验目的，意义，原理，实验方法选择，预计结果及数据表现形式， 实验难点及可能出现问题，可能出现的实验结果偏差及解释
答辩安排： 最后一周答辩，每组时间控制为20分钟演讲，10分钟提问。
设计性实验题
1 免疫球蛋白IgG的分离纯化与鉴定。 2 人血清白蛋白的提取纯化及分子量的测定。 3 蛋清中溶菌酶的分离鉴定。 4 小鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及酶动力学研究。 5 如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？ 6 如何提取真核细胞中的线粒体基因组DNA？ 7 请设计实验从基因及蛋白表达角度讨论老年痴呆症模型小鼠与人类老年痴 呆症的可比较性 （即小鼠模型建立的可靠性） 8 请设计实验从基因及蛋白表达角度追踪老年痴呆模型小鼠发病期典型变化， 及给药治疗后效果评价 9 蛋白质的表达具有一定的组织特异性，请以实验小鼠胰腺和肝脏为材料设 计实验检测羧肽酶A1酶原(procarboxypeptidase A1)和白蛋白(Albumin) 并计算这两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。 10 细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）在肝脏中有三种亚型，即细 胞色素氧化酶1，2和3，请以实验小鼠肝脏为材料设计实验检测这三种酶的 表达并计算它们的表达量。
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实验一-DNA提取实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。
2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。
提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。
DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。
以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。
当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。
当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。
为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
2．SDS 法：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。
因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。
（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。
几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。
为实现（2）需要在DNA 处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管。
提取的DNA 是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（melting temperature, Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。
本实验采用CTAB 法提取DNA 并通过紫外吸收法鉴定。
3材料和试剂：3.1长春花叶片3.2 试剂（1）CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。
表1 CTAB提取缓冲液配制用HCl 调pH 值。
（2）TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（pH8.0）。
（3）氯仿/异戊醇：将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。
4 仪器设备离心机、3离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等。
5 方法与步骤：5.1 在提取过程中用到的吸头，提取缓冲液等先高压灭菌（121℃，20min），取出后待用；5.2 取大约指甲盖大小的植物叶片，放入1.5ml的EP管中, 加入液氮，用钢珠研磨成粉末状，再加入600μL的CTAB提取缓冲液，；5.3 65℃水浴锅中水浴40min，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻混匀，颠倒几次，乳化1min。
4℃，11,000rpm离心10min；5.4 吸上清到新离心管中（约400μl），加入等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃放置20min沉淀DNA；5.5 5000 rpm常温离心15min，倒掉上清液；5.6 用75%乙醇（900μl）洗沉淀，11,000rpm离心2min，倒掉乙醇，再用乙醇同样处理一次；5.7 置于干燥仪干燥10min，将水分蒸干；5.8 加入50μL去离子水，融解DNA，同时加入RNA酶(按每50μL DNA加入1μL RNase)，37℃30min；5.9 利用分光光度计检测OD260,同时进行1％凝胶电泳检测；5.10 琼脂糖电泳检测DNA：制作1%的琼脂糖凝胶，吸取提取的DNA溶液5μL 电泳检测；5.11 -20℃保存DNA备用；5.12 提取的DNA的浓度检测：取少量待测DNA样品，用蒸馏水稀释1,000倍；用蒸馏水做空白，分别在260nm、280nm测DNA样品的吸光值。
【注意事项】1. 叶片磨得越细越好。
2. 注意移液器的正确使用。
3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。
6. 思考题1．制备的DNA 在什么溶液中较稳定?2．为了保证植物DNA 的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？7 实验结果：结果计算式中OD260nm 为260nm 处的光密度；L 为比色杯光径（cm）；0.020 为1μg/mL DNA 钠盐的光密度。
DNA 的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。
上述DNA 溶液适当稀释后，在751 分光光度计上测定其OD260nm、OD230nm 和OD280nm。
如OD260nm/ OD230nm≥2OD260nm/ OD280nm≥1.8，表示RNA 已经除净，蛋白含量不超过0.3％。
8 实验分析：传统DNA提取方法CTAB 法、SDS 法是在裂解细胞的基础上,多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的;加入RNA 酶除去核酸中的RNA; 然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀,除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子,以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应,最后用TE 溶解DNA 备用。
CTAB 是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐( > 0. 7 mol/ L) 浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0. 1～0. 5 mol/ L NaCl) 下CTAB - 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
经离心弃上清后,CTAB - 核酸复合物再用70 %酒精浸泡可洗脱掉CTAB 。
SDS 是一种阴离子去垢剂,在高温(55～65 ℃) 条件下能裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性,同时SDS 与蛋白质和多糖结合成复合物,释放出核酸;提高盐(KAc 或NH4Ac) 浓度并降低温度(冰浴) ,使 SDS - 蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀;上清液中的 DNA 用酚/ 氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
SDS 法操作简单,温和,也可提取到高分子量的DNA ,但所得到的产物含糖类杂质较多。
基因组DNA 经典的提取方法由于无需昂贵仪器和药品,提取的DNA 纯度能够满足一般分子生物学的需要,一直作为DNA 提取的常规方法。
但这种方法操作步骤复杂,耗时长,易交叉污染,残留在DNA 溶液中有机物质对DNA 聚合酶有抑制作用。
另外,酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康。
DNA提取新方法近年来出现了以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础 DNA 提取新方法。
这些方法主要应用于提取病毒、微生物、人和动物细胞、包埋组织样品、古生物标本及土壤环境样品 DNA 。
已有多篇利用纯化柱和玻璃粉纯化植物基因组 DNA 的报道。
马小军等将CTAB 液提取和氯仿抽提两步的上清液直接通过Wizard 纯化系统纯化得到的DNA ,RAPD 扩增效果良好,产率达2 250μg/ g 。
张博等用硅珠(SiO2) 颗粒吸附DNA 纯化方法,从不同树木叶片中均得到了高质量的 DNA 样品。
黄椰林等对常规CTAB 法提取的DNA 用玻璃粉悬浮液纯化,所获DN 的APCR 产物能直接测序,比较适用于富含黏多糖、单宁、多酚和萜类化合物等次生代谢物的植物样品和长期保存的标本材料。
袁长春等也用玻璃粉吸附法从富含酚类的茶类植物中提取纯净的总DNA。
目前国内外开发了多种商品化的DNA 提取纯化试剂盒,其分离原理有的利用核酸的分子量差异,有的利用特异性膜与DNA 结合达到分离、回收的目的,如离子交换柱、磁珠等。
这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法,操作简单、高效, DNA 质量较高,但价格昂贵,提取量少。
著名的国外的试剂盒生产厂家有Sigma2Aldrich、Promega、Invitrogen、 TaKaRa 、Whatman 等,它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液和组织、植物、加工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒。
国内的生物公司发展迅速,如上海生工、北京天为、北京博奥等也开发了系列试剂盒,质量与国外厂家相当,价格较低。
除此之外,由于核酸提取纯化试剂盒制作门槛低,还有大量的生物公司提供试剂盒产品,使用者一定要慎重选择。
DNA 试剂盒经过了几十年的发展,已经不再局限于单纯的提取纯化,有些厂家推出了DNA 提取—扩增 PCR 试剂盒,将DNA 提取和PCR 扩增结合起来,极大的提高了工作效率,如Sigma2Aldrich 公司的Sigma’s Extract2N2Amp Plant PCR kit 等。