实验一植物基因组DNA提取
实验一-DNA提取
实验一-DNA提取实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。
2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。
提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。
DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。
以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。
当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。
当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。
为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
实验一 植物基因组DNA提取
三、材料
玉米叶片
四、设备
移液器，冷冻高速心机，台式高速离
心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5 mL 离心管。
五、试剂
1. 提取缓冲液： 100mmol/L Tris· Cl，20mmol/L
EDTA，500mmol/L NaCl，1.5% SDS。
2. 氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）。
3. TE缓冲液：10mmol/L Tris· Cl（pH8.0），
DNA的紫外分光光度计检测
原理：核酸在260nm处有最大吸收峰 蛋白质在280nm处有最大吸收峰 盐和小分子在230nm处有最大吸收峰
OD260/OD280>1.7 OD260/OD230>2.0 1OD260=50 μ g/mL DNA
思考题: 1. 如何检测和保证DNA的质量？
2. 基因组提取过程中注意事项有哪些？
植物基因组DNA的提取
一、实验目的： 1. 了解真核生物基因组DNA提取的一般 原理。 2. 掌握DNA提取的方法和步骤。
二、一般原理
提取DNA的一般原理，是将分散好
的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶K
的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：氯仿：
异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到的
DNA经乙醇沉淀方法进一步纯化。
1mmol/L EDTA（pH8.0）。 4. 其他试剂：液氮，异丙醇，无水乙醇，70%乙醇， 3mol/L NaAc（pH5.2）。
六、操作步骤
1. 在1.5ml离心管中加入1ml提取缓冲液，60℃水浴预热。
2. 取玉米幼叶0.1g，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入 预热的离心管中，摇动混匀，60℃水浴保温3min，每隔 一分钟摇动一次。 3. 12000rpm 离心1min。 4. 吸取900ul上清液到一个新的1.5ml离心管中，加入600ul 的氯仿：异戊醇：乙醇（80： 4 ：16）溶液，颠倒混匀 室温下静置1 min，使水相和有机相分层。 5. 室温下12000rpm离心5 min。
植物基因组DNA的提取及分析
植物基因组DNA的提取及分析一、植物基因组DNA提取的步骤：1.样本的准备：从植物中选择健康和新鲜的组织样本，如叶片、茎、根等。
样本选择要避免含有大量的绒毛、叶色不正常等因素的部位。
2.细胞破碎：将样本放入液氮中迅速冷冻，然后用研钵和研钉对样本进行研磨，直至样本完全破碎。
3.细胞裂解：将研磨的样本加入裂解缓冲液，边振荡边研磨使样本均匀混合。
4.蛋白质去除：使用酚/氯仿提取法去除蛋白质。
加入等体积的酚/氯仿/异丙醇混合液，轻轻混合，然后离心离心管以分离上清和下层。
5.DNA沉淀：将上清转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇进行DNA沉淀。
静置一段时间后，离心离心管以沉淀DNA。
6.DNA洗涤：将DNA沉淀物用70%乙醇洗涤一至两次，去除残留的盐和其他杂质。
7.DNA溶解：用适量的稳定缓冲液溶解DNA，使其达到一定浓度并避免降解。
二、植物基因组DNA分析的方法：1.PCR扩增：PCR技术可以通过放大DNA片段来研究特定基因或DNA 序列。
首先选择适当的引物，然后将DNA样本与引物、核酸酶、dNTPs等反应液混合，进行多次循环的变温扩增反应。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：将PCR扩增的产物与DNA分子量标记物置于聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行电泳。
电泳结束后，通过紫外线照射或染色剂染色，观察电泳图谱，可以得到DNA片段的大小和数量。
3.酶切电泳：使用限制性内切酶切割DNA片段，然后将切割后的DNA 片段进行电泳分析。
根据DNA片段的大小和相对迁移速度，可以进行DNA 的分析和比较。
4.南方杂交：将DNA样本与标记了放射性同位素或荧光染料的DNA探针进行杂交反应。
通过探针与目标DNA片段的互补配对，可以检测目标DNA的存在和数量。
5.DNA测序：通过测序技术获得DNA序列信息，可以揭示基因组的结构和功能。
通过以上方法，我们可以提取和分析植物基因组DNA，更好地了解植物基因组的组成和功能，为植物的遗传改良和研究提供重要的信息。
实验一 CTAB法提取植物基因组DNA
实验一CTAB法提取植物基因组DNA实验目的:学习从植物组织中(幼叶)提取基因组DNA的基本原理与方法。
实验原理:采用机械研磨的方法破碎植物的组织与细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其就是氧化酶类),其对DNA的抽提产生不利的影响,所以在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),就是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。
该复合物在高盐的溶液中(>0、7mol/L NaCl)就是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀(CTAB能溶于乙醇)即可使核酸分离出来。
CTAB溶液在低于15度时会形成沉淀洗出,因此再将其加入冰冷的植物材料中之前必须预热(65度),且离心温度不要低于15度。
实验步骤:1、取幼嫩的植物叶片(3-5g)剪碎液氮研磨成粉,转入1、5ml离心管内。
加入等体积的65℃预热的DNA提取缓冲液置于65℃的恒温水浴摇床上1-2h(1、5h)。
2、加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),轻轻上下颠倒5分钟,静置5分钟,之后于12000rpm离心10分钟。
3、吸取上层水相,重复步骤2一次。
4、吸取上层水相,加入预冷2/3体积的异丙醇,轻缓颠倒2分钟并置-20℃冰箱内10min,待DNA沉淀后于12000rpm离心收集,收集的DNA于70%乙醇中洗2-3次。
将弃去乙醇风干后的DNA加适量水使其溶解。
5、待DNA完全溶解后加入1-2μl不含RNAaseA(10mg/ml),37℃保温1h以除去DNA中的RNA。
6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿:异戊醇(24:1)轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm离心10分钟。
7、吸取上层水相并先后加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍总体积的预冷的无水乙醇,接着置于-20℃冰箱,10分钟后10000rpm离心10分钟,弃去无水乙醇,加入70％乙醇洗涤2-3次,风干,最后将DNA溶于适量(200-500μl) TE中。
实验一 SDS法提取植物基因组DNA
实验一SDS法提取植物基因组DNA【实验目的】学习和掌握常用基因组DNA提取方法。
【实验要求】1.设计所采用实验方案并独立完成所有实验操作；2..获得高纯度、完整DNA样品。
一、原理利用含高浓度SDS的抽提缓冲液在较高温度（55—65℃）条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后提高盐浓度（KAc）和降低温度（冰上保温）的办法沉淀除去蛋白质和多糖（在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
二、药品试剂及耗材——液氮——提取缓冲液：500 mmol/L NaCl, 100 mmol/L Tris-HCl ph8, 50 mmol/L EDTA ph8，10 mmol/L 2-巯基乙醇（用前加入） ---- 20% SDS ph7.2 ---- 5 mol/L KAc---- 氯仿：异戊醇（24：1）——异丙醇—— 70%乙醇—— TE缓冲液 :10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,PH8.0 耗材：移液枪，15、2.0、1.5ml离心管，篮、黄、白枪头各四套离心管架4个，离心管盒2个，水浴泡沫8个，研钵及小药勺8套棉手套，薄膜手套，透明胶布，剪刀三、操作程序1. 将1 g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2 ml离心管中。
2. 加入 1.2 ml预热至65℃的提取缓冲液(3V)，轻缓振荡混匀，加入120μl 20%SDS(达到终浓度2%)，混匀，置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。
3. 加入0.45 ml 5M的醋酸钾（1/10V），混匀，冰浴20分钟，在10000 rpm离心20 min。
需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，取上清液转入另一离心管中。
4. 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀， 12000 rpm离心15 min。
实验一 植物组织DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳检测
实验一植物组织DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的（1）掌握用氯仿-异戊醇-核糖核酸酶法提取植物组织DNA的基本操作。
（2）掌握植物基因组DNA的提取方法。
（3）了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作。
二、实验原理利用液氮对植物组织冻干脆化进行研磨，从而破碎细胞。
细胞提取液能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来，核裂解液能使细胞核裂解释放DNA。
EDTA 抑制 DNA 酶的活性，氯仿、异戊醇能使蛋白质乳化沉淀去除蛋白，得到的 DNA 溶液经乙醇沉淀。
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。
琼脂糖是一种线性多糖聚合物。
浓度越高，空隙越小，其分辨能力就越强。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。
溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离的目的。
三、材料、器材及药品1．材料玉米或水稻幼嫩的叶片2．药品十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、山梨醇、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸（HCl）、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基肌氨酸钠、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、液氮、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙酸钠、无水乙醇、RNA酶（RNase A）、乙酸、硼酸、溴酚蓝、溴化乙锭等。
3．器材研钵、研杵、玻璃棒、50mL离心管、1.5mL离心管、水浴锅、离心机、—20℃冰箱、高压灭菌锅、超净工作台、微量移液器及吸头、电泳仪、电泳槽及灌胶模具等。
4．试剂配制（1）DNA提取缓冲液：0.35mol/L山梨醇，0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5）（用前需灭菌）。
（2）核裂解缓冲液：0．2mol/L Tris-HCl（pH7.5），0．05mol/L EDTA，2mol/L NaCl，2%CTAB（用前需灭菌）。
（3）5%十二烷基肌氨酸钠（用前需灭菌）。
实验一 DNA提取
实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。
2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。
提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。
DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。
以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。
当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。
当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。
为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
试验一植物基因组DNA提取
实验一植物基因组DNA提取目的：了解植物细胞的特点，掌握植物基因组DNA分离、纯化的原理。
原理：用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品，提取液中的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）能螯合金属离子，以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用，而细胞破碎液中的蛋白酶K在37℃温浴过程中还能降解蛋白质，从而减少了蛋白质对DNA的污染。
然后用CTAB处理，在特定的盐浓度下，CTAB 使基因组DNA处于溶解状态，而蛋白质仍为沉淀。
经细胞破碎液获得的DNA 粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理，其中酚是高效的蛋白变性剂，可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉，然后用氯仿、异戊醇处理，一方面可达到去蛋白的目的，另一方面还可去除残留的酚。
一、材料植物的根、茎、叶。
二、设备移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。
三、试剂1、CTAB或Nacl溶液：4.1克NaCl溶解于80ml水，缓慢加入10克CTAB，加水至100ml。
2、其它试剂：氯仿、异戊醇（24：1），酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），异丙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K（20mg/ml），5mol/LNaCl。
四、操作步骤1、选新鲜无病虫害的叶片用自来水冲洗吸干，用蒸馏水洗两次，然后用超纯水洗一遍，吸干，剪碎称0.5-0.25克。
2、将所取材料放入预冷的研钵（研钵提前要灭菌），研成粉末后置于7ml离心管内（可以换为将样品放置到7ml离心管中800ulＣＴＡＢ后用玻棒捣碎）。
3、加入2.4ml 65℃预热的CTAB，充分混合后65℃水浴90min以上，冷却到室温，加入等体积氯仿异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀4℃离心6000g×10min，取上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇轻轻混匀，-20℃度放置20min，4℃离心5000g×5min，去上清。
4、再沉淀中加入0.6ml的65℃CTAB温育30min，待沉淀充分溶解，加入等体积氯仿异戊醇充分混匀，4℃离心6000g×5min，去上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀-20℃放置20min。
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三、材料
玉米叶片
四、设备
移液器，冷冻高速离心机，台式高速离 心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5 mL 离心管。
五、试剂
1. 提取缓冲液： 100mmol/L Tris·Cl，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5% SDS。
2. 氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）。 3. TE缓冲液：10mmol/L Tris·Cl（pH8.0），
7.室温下12000rpm离心5 min。
8.吸取600ul上清液加入等体积的异丙醇，上下颠倒充 分混匀，观察絮状沉淀，后12000rpm离心5min。
9.倒去上清后用70%的乙醇清洗两次，每次在 12000rpm下离心1min。空气中干燥，后加入30ul 的TE（或ddH2O）缓冲液，充分溶解。
10.DNA用于后续实验研究或放于-20 ℃保存备用。
3. 12000rpm 离心1min。 4. 吸取900ul上清液到一个新的1.5ml离心管中，加入600ul
的氯仿：异戊醇：乙醇（80： 4 ：16）溶液，颠倒混匀 室温下静置1 min，使水相和有机相分层。 5. 室温下12000rpm离心5 min。
6.吸取700ul上清液到一个新的1.5ml离心管中，加 入等体积氯仿溶液，颠倒混匀室温下静置1 min， 使水相和有机相分层。
DNA的紫外分光光度计检测
原理：核酸在260nm处有最大吸收峰 蛋白质在280nm处有最大吸收峰 盐和小分子在230nm处有最大吸收峰
OD260/OD280>1.7 OD260/OD230>2.0 1OD260=50 μg/mL DNA
思考题:
1. 如何检测和保证DNA的质量？ 2. 基因组提取过程中注意事项有哪些？
植物基因组DNA的提取
一、实验目的： 1. 了解真核生物基因组DNA提取的一般 原理。 2. 掌握DNA提取的方法和步骤。
二、一般原理
提取DNA的一般原理，是将分散好 的真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶K 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：氯仿： 异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到的 DNA经乙醇沉淀方法进一步纯化。
1mmol/L EDTA（pH8.0）。 4. 其他试剂：液氮，异丙醇，无水乙醇，7。
六、操作步骤
1. 在1.5ml离心管中加入1ml提取缓冲液，60℃水浴预热。 2. 取玉米幼叶0.1g，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入
预热的离心管中，摇动混匀，60℃水浴保温3min，每隔 一分钟摇动一次。