三种差异表达基因克隆方法的比较
基因的克隆方法ppt课件
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
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优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
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克隆技术简介
克隆技术介绍张勋学号：160820216摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。
人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。
本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。
一、克隆技术实质1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆(Clone)”的术语。
学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。
早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。
1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。
在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。
克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。
克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。
时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。
这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。
简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。
但克隆与无性繁殖是不同的。
克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。
植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。
基因分离的策略
基因分离的策略一、概念基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。
分子克隆是指在体外对不同生物的DNA分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA。
基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。
基因的分离是基因工程研究中最主要的要素，目的基因的成功分离是基因工程操作的关键。
由于每种基因，特别是单拷贝基因占整个生物基因组的很小部分，且DNA的化学结构相似，都是由A、T、C、G四种碱基组成，具有极相似的理化性质，这给分离特定的目的基因带来很大困难。
二、基因克隆的总体策略1、功能克隆法：依赖于基因表达产物及其生物功能进行基因克隆。
①通过分析蛋白质中氨基酸顺序合成寡核苷酸探针从cDNA文库中分离cDNA克隆②通过制备基因产物单抗来进行cDNA片段分离③通过构建cDNA的表达文库，利用基因产物的功能来筛选基因2、定位克隆法：在事先不知道基因的相关功能信息的条件下，通过遗传连锁或细胞学定位技术将基因定位于染色体某一区段，再通过该区域的精细物理图或表达图分析、寻找候选基因并进行突变分析从而确定疾病的相关基因。
CpG岛筛选法、NotI连锁片段筛选法、外显子捕捉法和外显子扩增法、剪切位点筛选法、启动子捕捉法、polyA捕捉法、显微切割微克隆法、候选基因法。
3、消减杂交：将不同来源的基因组DNA或mRNA进行杂交，两者之间相同的核酸片段互补，或通过随机引物进行差别显示PCR扩增不同来源的cDNA，比较其中的mRNA表达差异，从而将两种之间的差异mRNA被筛选出来。
该法有两种思路：①采用杂交的方法：消减文库、代表性差异显示、比较基因组错配筛选② mRNA差别显示，采用PCR扩增，比较其mRNA的表达差异。
4、动物园杂交：利用一些基因在进化中高度保守的特点，在同种或不同种生物的基因组中有许多高度同源的基因，或具有共同的结构，因而可以利用已经有的基因与基因组文库或cDNA文库杂交，来调取高度同源、或结构相似、功能相似的基因。
基因工程操作技术及原理之基因克隆
基因工程操作技术及原理之基因克隆1．克隆已知序列的基因根据已知基因的序列设计引物(primer)，利用PCR方法克隆基因。
即使不同种属之间，基因编码区序列的同源性高于非编码区的序列。
在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建eDNA文库或基因组文库，然后以该基因(或部分序列)为探针来筛选目的基因的克隆。
2．功能克隆根据基因的产物蛋白质克隆基因，利用这种方法分离基因，首先应根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。
利用抗体或核苷酸探针筛选基因组DNA文库或cDNA文库，也可利用寡核苷酸引物对核D NA或cDNA进行PCR扩增。
通过对阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因。
3．作图克隆作图克隆又称图位克隆，是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。
根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。
作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆(BA C库或YAC库)的染色体步移(chromommewalking)到达靶基因。
4．表型差异克隆利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因，对于有些植物的性状，既不了解它们的基因产物也没有对它们进行基因定位，但已知它们的表型存在差异，利用这些差异，用下述方法也可克隆植物基因。
(1)消减杂交法即消减杂交法(subtractive hybridization)是通过鉴定两个mRNA间差异而分离基因的方法。
其基本方法是：提取两种差异细胞或组织的DNA后，反转录合成c DNA，并用限制性内切核酸酶切割成小片段。
将其中一个样品的酶切产物分成两份，分别连接不同的含有特定酶切位点的40bp左右的寡核苷酸接头，作为检测者(tester)。
用另外一个样品过量的酶切产物作为驱动者(driver)与带有不同接头的tester进行第一次杂交。
基因差异表达技术
基因差异表达技术真核生物中，从个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的得化、调亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因的选择性表达。
高等生物大约有30000个不同的基因，但在生物体内任意8细胞中只有10%的基因的以表达，而这些基因的表达按特定的时间和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。
其包括新出现的基因的表达与表达量有差异的基因的表达。
生物体表现出的各种特性，主要是由于基因的差异表达引起的。
由于基因的差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。
研究基因差异表达的主要技术有差别杂交（differential hybridization）、扣除（消减）杂交（subtractive hybridization of cDNA，SHD）、mRNA差异显示（mRNA differential display，DD）、抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、代表性差异分析（represential display analysis，RDA）、交互扣除RNA差别显示技术（reciprocal subtraction differential RNA display）、基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、电子消减（electronic subtraction）和DNA微列阵分析（DNA microarray）等。
一、差别杂交与扣除杂交差别杂交（differential hybridization）又叫差别筛选（differential screening），适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。
为了增加这种方法的有效性，后来又发展出了扣除杂交（subtractive hybridization）或扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning），它是通过构建扣除文库（subtractive library）得以实现的。
基因差异表达的研究方法
基因差异表达的研究方法摘要寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的手段。
寻找差异表达基因的方法有消减杂交法、mRNA 差异显示、代表性差异分析法、基因表达的序列分析、抑制消减杂交、表达序列标签、cDNA微阵列、半定量PCR、定量PCR。
特综述以上各种方法的原理、方法过程、优缺点及其应用，随着科学技术的发展对差异表达基因的研究会更加完善。
关键词基因；差异表达；消减杂交；差异显示；研究方法在真核生物的生命现象中，从个体的发育、生长、衰老、死亡，到组织、细胞的分化、凋亡或肿瘤的恶化以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及基因在时间上或空间上的选择性表达，即基因的差异表达。
基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关，成为生命科学的重要研究课题（潘美辉等，1997）。
比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提（胡昌华，2001）。
寻找差异表达基因成为目前基因研究的一个非常重要的内容。
差异表达的基因通常用稳定状态下mRNA的丰度高低有无来比较。
差异表达基因有2个含义，即表达基因的种类改变和基因表达量的变化。
通过它能找到疾病不同阶段、不同状态下表达不同丰度的基因，从而为进一步研究打下基础。
分离和鉴定差异表达基因是了解各项生命活动和疾病分子调控机制的重要手段（梁自文，2001）。
笔者拟对目前现有的寻找差异基因的方法作一综述。
1消减杂交法（subtractive hybridization）消减杂交在1984年由Palmer和Lamer（Lamar EE et at.，1984）提出，其目的是分离出两类同源分子间差异表达的基因，关键是利用分子杂交原理去除共同序列，保留差异序列，通过PCR多次循环扩增而分离，从而能进一步研究其差异表达基因。
具体做法：首先以oligo-dT为引物，从tester中制备放射性标记的单链cDNA 文库。
基因工程简答题总结
基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。
同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。
同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。
分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。
不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。
）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。
7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。
（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。
这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
3、足够多的载体和插入片段是最重要的。
4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
基因克隆常用的方法
3.2 Differential display PCR(DD-PCR) PCR(DDDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTPCR方法,主要用于2 PCR方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因 表达上的差异分析。其基本原理是: 表达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将 所有的mRNA分子分为12类 见图3)。 所有的mRNA分子分为12类(见图3)。
PCR反应模式图： 反应模式图： 反应模式图
Nested PCR反应模式图 反应模式图
根据蛋白质序列也可或cDNA 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引 物(degen做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。
另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究, 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的 PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶, pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。
图３真核生物12种mRNA的序列特点
根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而, PCR的模板必须是 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异, mRNA不应降解。目前这一方法已广 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
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三种差异表达基因克隆方法的比较[摘要] 为了能快速、有效、准确地克隆出有意义的基因,本文就常用的三种基因克隆方法,即差异显示PCR、抑制性消减杂交、PAP-PCR,从其原理、应用、优越性、主要缺陷等几方面进行了简要概述。
这些方法为中医、针刺治疗各种疾病过程中有关的基因差异表达,以及有关基因分子克隆提供有效的分子生物学工具。
[主题词] 针灸原理;基因表达;克隆,分子;聚合酶链反应高等生物大约有100000个不同的基因,但在生物体内任一细胞中只有15%的基因得以表达。
而这大约15000个基因的表达是按时间和空间顺序有序地进行着,这种表达方式即为基因的差别表达(differentialexpression)[1]。
生物体表现出各种各样的特性,主要是其基因表达的差异引起的。
基因差异表达的变化有两种,即新出现的基因表达与表达量差异的基因表达。
由于基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制,通过比较同一类细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段的基因表达差异,可为分析生命活动过程提供重要信息。
当前,人类基因组研究的重心正在由“结构”向“功能”转移,一个以基因组功能研究为主要内容的所谓“后基因组时代”(post genomics),即功能基因组(func tionalgenomics)时代即将到来,这就决定了寻找差异表达基因成为分子生物学的研究热点之一。
目前已有针灸科研工作者从分子生物学水平探讨针灸治疗各种疾病的可能机理。
有实验[2]报道针刺翳风等穴位面神经组织中NT 3及TrKCmR NA表达增加;针刺后癫痫大鼠海马内nNOSmRNA和iNOSmRNA增加[3];针刺可调节CCK 8mRNA、THmRNA、SOMmRNA、c fos\c junmRNA、CGRPmRNA的增减[4]。
为适应当前医学的发展,为满足针灸科研工作者分子生物学研究的需要,本文对差异显示PCR、抑制性消减杂交及RNA任意引物PCR三种常用的差异基因筛选法,分别从其基本原理、过程、应用范围及优缺点等作一个简介。
1 差异显示PCR(differentialdisplayreverse tran scriptasePCR,DDRT PCR)该方法是自1992年由Liang和Pardee建立起来的[1],后经多年改进,目前已被广泛的使用。
它已较成功地用于胚胎发生[5]、脑发育[6]、生长因子激活与抑制、信号传导[7]、癌症[8]等有关的基因的鉴定与克隆。
其主要原理是:利用mRNAs结尾处的多聚腺苷酸[poly(A)]结构,在其3｀端设计如5｀ T11CA排列样的锚定引物,该引物可与mRNAs总数的十二分之一[即poly(A)前面2个碱基为TG的mRNA]结合,从而使这部分基因得到逆转录;而一套(即T11MN,N代表任意碱基,M为除T外的其他三种碱基,共12条)引物可将全部mRNA得到扩增。
在其5｀端再设计一些任意碱基序列的引物,就可使不同长度的基因得到扩增。
DDRT PCR包括3个基本步骤:①用一套锚定引物反转录样本mRNA为cDNA;②用一套随机图1DDRT-PCR过程引物和锚定引物扩增cDNA;③电泳分离产生PCR片段。
由图1可知,条带2、5分别为不同组织A、B所特有。
将差别表达条带进行回收、鉴定分析,即可获得差异表达的目的基因。
DDRT PCR具有简便、快捷、所需起始材料少;由于PCR技术的应用,使得低丰度mRNA的筛选成为可能;可同时对多个样本进行比较;可检测基因的上游调节和下游调节。
但其缺点是假阳性条带太多,有时甚至高达85%[9],而且重复性差;获得的差异片段较短,因而在Northernblot检测时往往得不到杂交信号。
2 抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehy bridization,SSH)消减杂交最早由Lamar和Palmer于1984年报道[10],后经多年的改进,它已发展为许多基因克隆方法的基础,SSH就是其中之一[11]。
该方法运用杂交动力学原理,即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA,并同时利用链内退火优先于链间退火的特性,从而选择性地抑制了非目的片段的扩增。
其基本过程(见图2)为将tester(样本)mRNA和driver(参照)mRNA分别逆转录为cDNA,用4碱基识别酶(RsaI)酶切两种cDNA产生平端片段;testercDNA分别接上adapter(接头)1及adapter2并与过量的经RsaI酶消化的driver样本杂交。
引物设计在adapter上,这样仅使具有差异表达的片段成为PCR的模板,同时接头上含有启动子序列及限制性内切酶识别位点,为以后连接克隆载体和测序提供方便。
经过重复消减杂交以便减少非特异性片段的扩增,使得差异表达的目的基因片段得到大量富集。
该方法具有高度的灵敏性、假阳性率低、分离的差异条带多。
然而其仅能比较成对RNA群体间差异表达的基因,起始材料要求较多、对小片段缺失的样本无法检出,由于稀有mRNA不适合杂交动力学而使这部分基因漏掉,通过使用driver 序列和tester序列彻底杂交的扣除方法可以避免非差异表达的序列,但副作用是使那些不按“全或无”模式表达的基因之间的明显差异变化变得模糊,并还存在adapter与cDNA片段的连接效率问题等。
但SSH仍不失是目前较有效的克隆目的基因的方法之一[12,13]。
3 RNA任意引物PCR(RNAarbitrarilyprimedPCR,RAP PCR)RAP PCR方法与DDRT PCR同时报道[14],其基本原理也较为一致。
但其具体使用方法与DDRT PCR不同。
首先,用任意引物在RNA模板和其配对最好的位点进行反转录合成第一链cDNA或者在反转录的第一步即加入5｀ 随机引物与3｀ 锚定引物,如果RNA具有6～8个碱基与该5｀ 引物的3｀ 端相匹配,则该随机引物同样能引导cDNA第一链的合成。
这样,通过两种引物的反转录即可以研究所有RNA,包括开放阅读框(openreadingframe,ORF)。
第二链是在任意引物所找到的最佳配对位点起始合成。
在扩增序列引物和模板配对比较差的一端,可以由极好配对的另一端得到补偿。
以上的结果是收集了在3｀和5｀端侧翼有和任意引物相同的序列(互补的序列)的基因片段。
这些片段可作为模板进行高严谨性的PCR扩增,最终得到与基因组DNA指纹(DNAfingerprinting)相似的指纹。
因此该方法也称为RNA指纹技术(RNAfingerprintingtechnique)。
凝胶电泳可以显示全部PCR产物,再从中回收差异表达的基因片段,进行克隆、测序及功能分析。
其基本步骤如图3。
图中条带A、C为组织1或2特有的,B为不同组织表达量差异的条带。
图3RAP-PCR基本过程该技术经过多年的应用和改进,利用此方法有人已成功的寻找到一种新的神经膜蛋白基因[15]、并在某些疾病相关基因[16]、信号传导相关的调节基因等方面得到广泛的应用[17～19]。
有实验表明,RAP PCR在一定的反应条件下,重复性相当好,可达90%。
RNA的浓度、DNA的污染等均对结果无明显影响;组间条带的亮度差异在20%以上即可定为基因的差异表达[20]。
与DDRT PCR、SSH 比较,该方法有其独特的优点:首先,RAP PCR可以同时比较2个以上的RNA样本,并且来自各式各样的调控种类的基因能直接克隆。
因此,对于任何被观察到的差异片段,能分析许多因素的影响。
其次,以PCR为基础的RNA指纹分析方法另一个优点是可以在几天内产生结果,而不像DDRT PCR及SSH那样需要许多步骤,花几周时间。
再次,由于长序列随机引物的应用大大降低了假阳性条带的出现。
另外,RAP PCR灵敏高、起需起始材料少。
尽管RAP PCR具有诸多的优点,但该方法需要较高的变性温度和较低的离子强度;并且随机引物并非选择性扩增的专一目标,有可能正好在某一类基因的保守区或分散的基因重复序列区,这样有可能只扩增这一类基因。
象其他方法一样,RAP PCR电泳产物的回4 参考文献1LiangP,ArthurBP.DifferentialDisplayofEukaryoticMes sengerRNAbyMeansof thePolymeraseChainReaction.Science,1992;257:9672 牙祖蒙,王建华,李忠禹,等.面神经损伤后穴位电针刺激对神经组织中神经营养因子 3及其受体表达的影响.中国中医基础医学杂志,2000;6:593YangR,HuangZN,ChengJS.AnticonvulsionEffectofAcupunctureMightbeRelatedtotheDecreaseofNeuronalandInducibleNitricXxideSynthases.AcupunctElectr otherRes,1999;24(3～4):1614WangYQ,CaoXD,WuGC.RoleofDopamineReceptorsandtheChangesoftheTyrosi neHydroxylasemRNAinAcupunctureAnalgesiainRats.AcupunctElectrotherRes,1999;24:815ZimmermannJW,SchultzR.AnalysisofGeneExpressioninthePreimplantationM ouseEmbryo:UseofmRNADiffer entialDisplay.ProcNatlAcadSci,1994;91:54566JosephR,DouD,TsangW.MolecularCloningofaNovelmRNA(neuonatin)thatisHig hlyExpressedinNeonatalMammalianBrain.BiochemBiophyResComm, 1994;201:12277HarrierLA,WrightF,HookerJE.Isolationofthe3 phos phoglycerateKinaseGen eoftheArbuscularMycorrhizalFungusGlomusMosseae(Nicol.&Gerd.)Gerdemann&Tra ppe.CurrGenet,1998;34:3868NagasakiK,SugimuraT,TeradaM,etal.IdentificationofGenesShowingDifferent ialExpressioninAntisenseK ras transducedPancreaticCancerCellswithSuppres sedTumori genicity.CancerRes,1999;59:55659BauerD.IdentificationofDifferentiallyExpressedmRNASpeciesbyanImprovedDisplayTechnique(DDRT PCR).NucleicAcidsResearch,1993;21:427210LamarEE,PalmerE.Y encoded,Species specificDNAinMice:EvidencethattheYChr omosomeExistsinTwoPolymorphicFormsinInbredStrains.Cell,1984;37:177111DiatchenkoL,LauYFC,CampellAP,etal.SuppressionSubtractiveHyridization:a MethodforGeneratingDiffer entiallyRegulatedorTissue specificcDNAProbesand Li braries.ProcNatlAcakSci,1996;93:602512ZuberJ,TchernitsaOI,HinzmannB,etal.AGenome wideSurveyofRASTransfor mationTargets.NatGenet;2000;24:14413HuftonSE,MoerkerkPT,BrandwijkR,etal.AProfileofDifferentiallyExpressedGenesinPrimaryColorectalCan cerUsingSuppressionSubtractiveHybridizati on.FEBSLett,1999;463:7714WelshJ,ChadaK,DalalSS,etal.ArbitrarilyPrimedPCRFingerprintingofRNA.Nuc lAcidsRes,1994;22:496515SchweitzerB,TaylorV,WelcherAA,etal.NeuralMem braneProtein35(NMP35): aNovelMemberofaGeneFamilyWhichisHighlyExpressedintheAdultNervou sSystem.MolCellNeurosci,1998;11:26016LafontaineDA,MercureS,PerreaultJP,etal.Identifica tionofaCrohn sDiseaseSpecific TranscriptwithPotentialasaDiagnosticMarker.Gut,1998;42:87817HeatonMP,LaegreidWW,BeattieCW,etal.Identifica tionandGeneticMappingo fBovineChemokineGenesEx pressedinEpithelialCells.MammGenome,1999;10:12818LeungGS,ZhangM,XieWJ,etal.IdentificationbyRNAFingerprintingofGenesDif ferentiallyExpressedDuringtheDevelopmentoftheBasidiomyceteLentinulaEdodes.M olGenGenet,2000;262:97719WilsonME,SonstegardTS,SmithTP,etal.DifferentialGeneExpressionduringElon gationinthePreimplantationPigEmbryo.Genesis,2000;26:920TortolaS,CapellaG,MarcuelloE,etal.AnalysisofDiffer entialGeneExpressionin HumanColorectalTumorTissuesbyRNAArbitrarilyPrimed PCR:aTechnicalAssessme bInvest,1998;78:309(收稿日期:2000 09 17,刘炜宏发稿)。