实验三葡聚糖凝胶柱层析

2.2、凝胶层析法的应用：
1、分子量的测定用已知分子量的标准蛋白洗脱制备标准曲线。
2、分离多组分混合物
3、脱盐与分离纯化用于脱盐的凝胶多为大颗粒、高交联度的凝胶。
此时，溶液中大分子（如蛋白质）的kd=0，盐类的kd=1，易于分离脱盐。
如: 用于去除热原物质热源是微生物产生的某些可以使人发热的物质，多
介绍几个体积：
Vt(total volume) Vi(inner volume) Vg(gel volume) Vo(outer volume) Ve(elution volume)
Vt（床体积）=Vo+Vi+Vg , Ve（洗脱体积）=Vo+Kd×Vi。
Kd是分配系数：用于衡量物质在凝胶内外的分配率， 是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质分子 大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长短粗细无 关。 Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi 几个特征Kd值意义： ①Kd=0,则Ve=Vo ，全排阻； ②Kd=1,则Ve=Vo+Vi , 全掺入； ③0＜Kd<1,则Ve=Vo+Kd×Vi ，部分掺入；
pH稳定 性工作
3~12 3~12 3~12 3~12 3~12 3~11 3~11 3~11
耐压 Mpa
0.3 0.3 0.3 0.4 0.7 0.2 0.2 0.2
最 快流 速cm/h
100 100 100 30 30 20~39 20~39 20~39
Superdex凝胶过滤层析介质的技术数据 30 <10000 Superdex 75 3000~70000 Superdex200 10000~600000 Superose 6 5000~5×106 Superose 12 1000~300000 Sephacryl 1000~ 100000 S-100 HR Sephacryl 5000~250000 S-200 HR Sephacryl 10000~1.5×106 S-300 HR Sephacryl 20000~8×106 S-400 HR Sepharose 6 10000~4×106 Fast Flow Sepharose 4 60000~20×106 Fast Flow Sepharose 2B 70000~40×106 Sepharose 4B 60000~20×106 Sepharose 6B 10000~4×106 Sepharose 70000~40×106 CL-2B Sepharose 60000~20×105 CL-4B Sepharose 10000~4×106 CL-6B
3.4、凝胶的防腐、保存：
Sephadex、Sepharose等都是多糖类物质， 易于长菌，因此常在凝胶（不用时）中加入 抑菌剂，使用时再除去。
1. 常用0.02％叠氮钠作防腐剂。 该溶液在1厘米光程时， 254nm处透光率为60％， 280nm处透光率为100％。
2. 现多用20％的乙醇溶液保存各类凝胶
实验三、葡聚糖凝胶柱层析
1、目的与要求：
1.1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 1.2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层 析的操作技术。
2、凝胶层析法的原理：
凝胶层析是一种液相层析，机理是分子筛 效应。当洗脱开始以后，小分子可进入凝 胶颗粒内部，流程长，流动慢；大分子不 能进入凝胶颗粒内部，流程短，流动快。 这样就可使大小不同的分子分开。
溶胀最少 平衡时间h 室温 3 3 6 6 6 6 6 6 6 6 24 24 48 48 72 72 72 72 沸水 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 5 5 5 5
最快 流速 (cm/h) 2~5 2~5 2~5 2~5 2~5 2~5 2~5 2~5 2~5 2~5 72 16 47 11 21 5.6 11 2.8
4000~1.5×105 4000~1×105 5000~3×105 5000~1.5×105 5000~6×105 5000~2.5×105
100~4 000
特别为使用有机溶剂而设计。适合分离脂类、胆固醇、脂肪酸、激素、 维生素及其他小生物分子。此分离范围指以酒精为溶剂的分离
凝胶过滤介 质名称
分离范围
3.5 试剂、器材：
3.1 层析介质 Sephadex G-50； 3.2 混合样品（由三个组分组成）（要过滤或离心）： 蓝葡聚糖2000－10mg/ml， 溶菌酶—40mg/ml, Trp—10mg/ml。 上样量：0.2ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐水（需抽滤） 3.4、层析系统：层析柱、恒流泵、部分收集器、 核酸蛋白检测仪、记录仪。
④Kd>1，则Ve>Vo+Vi ， Sephadex
对它们有吸附作用。如某些芳香族化 合物（Phe,Tyr,Trp等），
2.1、影响凝胶层析分离的因素：
1、样品的体积、粘度； 2、层析柱 ；（高度，内径，材质） 3、洗脱液流速的影响 过慢：扩散 过快：拖尾 4、洗脱液离子强度、PH的影响。
2.1.1、样品的体积、粘度：
颗粒大 小μm
24~44 24~44 24~44 20~40 20~40 25~75 25~75 25~75
特性/应用
肽类、寡糖、小蛋白等 重组蛋白、细胞色素 单抗、大蛋白 蛋白、肽类、多糖、核酸 蛋白、肽类、寡糖、多糖 肽类、小蛋白 蛋白，如清蛋白 蛋白、抗体 多糖、具延伸结构的大分 子如蛋白多糖、脂质体 巨大分子 巨大分子如重组乙型肝炎表 面抗原 蛋白、大分子复合物、病毒、 不对称分子如核酸和多糖 （蛋白多糖） 蛋白、多糖 蛋白、多糖 蛋白、大分子复合物、病毒 、不对称分子如核酸和多糖 （蛋白多糖）
分离 范围 <700 <1500 1000~5000 1000~5 000 1000~5000
颗粒 大小 （μm） 干粉40~120 干粉40~120 干粉100~300 干粉50~150
特性/应用
pH 稳定性 工作 2~13 2~13 2~13 2~13
干凝胶 溶胀体 积mL/g 2~3 2.5~3.5 4~6 4~6
4、实验操作过程：
4.1、凝胶用量的计算； 4.2、凝胶的溶胀； 4.3、装柱； 4.4、上样； 4.5、洗脱和收集。
4.1、凝胶用量的计算：
根据层析柱的容积和所选凝胶溶胀后的柱床 体积计算出所需凝胶干粉的重量。 凝胶的克数＝ Vbed ÷ Vc 。
凝胶过滤介质 名称 SephadexG-10 SephadexG-15 SephadexG-25 Coarse SephadexG-25 Medium SephadexG-25 Fine SephadexG-25 Superfine SephadexG-50 Coarse SephadexG-50 Medium SephadexG-50 Fine SephadexG-50 Superfine SephadexG-75 SephadexG-75 Superfine SephadexG-100 SephadexG-100 Superfine SephadexG-150 SephadexG-150 Superfine SephadexG-200 SephadexG-200 Superfine SephadexLH20 ( 嗜脂性 )
3.1、层析用凝胶必须具备 下列条件：
1、惰性：保证其不与待分离物质发生化学反应； 2、稳定； 3、低电荷：避免离子交换效应的发生； 4、足够的机械强度：在一定的操作压下不形变。
3.2、能用于层析的凝胶主 要有下面几种：
2.2.1、天然凝胶： 马铃薯淀粉凝胶、琼脂及琼脂糖凝胶 。 2.2.2、人工合成凝胶： 聚丙烯酰胺凝胶 、交联葡聚糖凝胶 。
0.012 0.02
26 30
3.3、葡聚糖凝胶Sephadex）的使用原则
2.4.1、型号选择： 组别分离时，Sephadex G－25最为常用。例如 样品中缓冲液的更换，蛋白质的脱盐 ； 分级分离时（如多种蛋白质的分离），应根据 待分离物中各组分的分子量大小和分子量分布范 围来确定型号。 参考商家的产品信息。 2.4.2、粒度的选择 ： 组别分离时，选用较粗的颗粒； 分级分离时，以细颗粒凝胶为主，而且要求颗 粒大小均匀。 同型号的胶，同样的床体积，粒度小的胶对样品的 分离度要优于粒度大的胶，即有较高的分辨率。
为内毒素，是制药中必须去除的物质。内毒素是一个含脂肪A、糖类和蛋白， 是带负电的复合大分子。内毒素经常是多聚体，凝胶过滤层析可有效地将 之去除，特别是在小分子药物。选用的凝胶可以与脱盐类似，只是此时热 源等大分子物质的kd=0，而小分子药物的kd=1
3、凝胶介绍：
凝胶是一种具有立体网状结构的物 质 （ 如 葡 聚 糖 、 琼 脂 糖 、 聚 丙 烯酰胺等）吸收大量液体（水或洗脱液） 溶胀而成。
脱盐及交换缓冲液用 脱盐及交换缓冲液用
同一型号的胶，胶颗粒越细，所形成的 2~13 4~6 干粉20~80 脱盐及交换缓冲液用 柱子理论踏板数越高，分辨率越高，这 1000~5000 2~13 4~6 干粉10~40 脱盐及交换缓冲液用 也就是为什么很小的HPLC预装柱能够 1500~30000 2~10 9~11 干粉100~300 小分子蛋白质分离 有很好的分离效果的原因了。 2~10 9~11 1500~30000 干粉50~150 小分子蛋白质分离
25~75
平均90 平均90 60~200 45~165 45~165 60~200
3~11
2~12 2~12 4~9 4~9 4~9
0.2
0.1 0.1 0.004 0.008 250 10 11.5 14 15
45~165
45~165
蛋白、多糖
蛋白、多糖
3~13 3~13
1500~30000 1500~30000 3000~80000 3000~70000 干粉20~80 干粉10~40 干粉40~120 干粉10~40 干粉40~120 干粉10~40 干粉40~120 干粉10~40 干粉40~120 干粉10~40 干粉25~106 小分子蛋白质分离 小分子蛋白质分离 中等蛋白质分离 中等蛋白质分离 中等蛋白质分离 中等蛋白质分离 稍大蛋白质分离 稍大蛋白质分离 较大蛋白质分离 较大蛋白质分离 2~10 2~10 2~10 2~10 2~10 2~10 2~10 2~10 2~10 2~10 9~11 9~11 12~15 12~15 15~20 15~20 20~30 18~22 30~40 20~25