葡聚糖凝胶层析
葡聚糖层析实验报告
一、实验目的1. 掌握葡聚糖凝胶层析的原理及其在生物大分子分离中的应用。
2. 学习并掌握葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
3. 通过实验，验证葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
二、实验原理凝胶层析，又称分子排阻层析或凝胶过滤，是一种基于被分离物质分子量差异的层析分离技术。
该技术利用凝胶颗粒的多孔网状结构，通过分子量差异使不同组分在层析柱中以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
葡聚糖凝胶是一种由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的高分子化合物。
通过调节葡聚糖和交联剂的比例，可以控制凝胶颗粒的孔径大小。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随溶剂流动快速流出层析柱；而分子量小的物质可进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程慢，后流出层析柱。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 葡聚糖凝胶（Sephadex）- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白、鸡蛋清蛋白等）- 溶剂（如磷酸盐缓冲溶液）- 离心机- 层析柱- 漏斗- 吸管2. 实验仪器：- 电子天平- 移液器- 显微镜四、实验步骤1. 准备层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱中，用溶剂冲洗，直至凝胶床均匀。
2. 加载样品：将标准蛋白质溶液加入层析柱中，使其在凝胶床表面形成一薄层。
3. 洗脱：用溶剂缓慢冲洗层析柱，收集不同时间流出的洗脱液。
4. 分析洗脱液：将收集到的洗脱液进行比色分析或电泳分析，确定各组分的位置。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 洗脱液在比色分析或电泳分析中，可观察到不同分子量的蛋白质分别在凝胶层析柱中的位置。
- 小分子量的蛋白质先流出层析柱，大分子量的蛋白质后流出。
2. 结果分析：- 通过实验，验证了葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。
- 实验结果表明，小分子量的蛋白质在凝胶层析柱中的流动速度较快，大分子量的蛋白质流动速度较慢。
六、实验结论1. 葡聚糖凝胶层析是一种基于分子量差异的层析分离技术，在生物大分子分离中具有广泛的应用。
葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
凝胶层析的实际操作
4、上样 上样体积不大于6%柱床体积，上样浓度控制再35mg / ml~50 mg / ml， 以不大于12cm / h线性流速上样。
5、洗脱 用0.05mol / L NaCl-5mmol / L PB溶液，以不大于12cm / h线性流速洗脱
凝胶层析的操作注意事项
1、盐析过程盐溶液加少，盐析程度不够；盐溶液加多，盐 浓度过高有可能会导致蛋白变性； 2、蛋白的上样浓度不宜过高（70 mg / ml GE公司凝胶手册 数据 ），否则样品粘稠影响分离效果； 3、样品必须是均匀的溶液体系，没有颗粒，否则容易造成 柱子阻塞；
2、前处理 2.1、0.5mol / L NaOH以22cm/h线性流速冲1.5%的柱床体积，再用注射 用水冲中性
3、平衡 3.1先用4L200 mmol / L PB以22cm/h线性流速平衡 3.2再用0.05mol / L NaCl-5mmol / L PB以22cm/h线性流速平衡层析柱， 不时检测出液端穿液电导和pH，如果与平衡液的电导和pH一致，表明 层析柱已经平衡好。
型号：S-100,S-200,S-300,S-400等
Sephacryl的常见规格（分级范围）
预装柱
车间现有规格 1000~100000
凝胶层析的实际操作
1、样品准备 1.1、根据Phenyl下样合格样品的体积，加入3.5 mol / L (NH4)2SO4溶液， 使样品中(NH4)2SO4溶液浓度稀释到1.35~1.83mol / L。置于层析柜中10 min以上。4℃，6500 rpm离心30 min，收集沉淀。用pH 7.2士0.1的 5mol / L PB溶解沉淀，完全溶解后，4℃，6500 rpm离心15分钟，取上 清。
葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为 1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 8吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
凝胶层析_实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理和操作方法。
2. 掌握凝胶层析分离混合物中不同组分的基本技能。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。
该技术利用凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛，分子量不同的物质通过凝胶柱的速度也不同。
在凝胶层析实验中，样品被注入凝胶柱，随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合样品、葡聚糖凝胶、洗脱液（如蒸馏水、乙醇等）。
2. 实验仪器：凝胶层析柱、注射器、恒流泵、收集器、滤纸、烧杯等。
四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱，轻轻敲打柱底，使凝胶均匀分布。
2. 洗脱液平衡：将凝胶层析柱放入盛有洗脱液的烧杯中，使凝胶充分浸泡。
3. 样品制备：将混合样品与洗脱液按一定比例混合，制成样品溶液。
4. 注射样品：将样品溶液注入凝胶层析柱。
5. 收集分离组分：随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱。
将收集器放置在凝胶柱下方，收集分离组分。
6. 分析实验结果：观察收集到的组分，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 分离效果：通过凝胶层析实验，成功分离出混合样品中的不同组分。
2. 分组情况：根据收集到的组分，分析其分子量大小，确定分离效果。
3. 实验原理验证：实验结果表明，凝胶层析能够有效分离混合物中的不同组分，验证了实验原理。
六、实验讨论1. 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理是基于分子筛效应，通过凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
2. 影响分离效果的因素：实验过程中，洗脱液的种类、流速、凝胶的孔径等因素会影响分离效果。
在实验中，应严格控制这些因素，以确保分离效果。
3. 实验结果分析：通过分析实验结果，可以了解不同组分在混合样品中的含量和分子量大小，为后续研究提供数据支持。
葡聚糖凝胶Sephadex G–25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结 构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富 于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网 眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼， 小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼 的物质分子则不能，故称为“分子筛”。 小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并 随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动， 从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒 的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝
胶
柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢； 大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不 能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶 颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、 流速快，比小分子先流出层析柱；小分 子最后流出。分子大小介于完全排阻不 能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质 分子，则居中流出。这样被分离物质即 被按分子的大小分开。
层析法的基本原理
层析法是利用混合物中各组分物理化学性 质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲 和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为 固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为 流动相）体系中的分布程度不同，从而使各组分 以不同的速度移动而达到分离的目的。
如盐析（粗分级分离）向蛋白质 溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4， Na2SO4，Na2SO4]，使蛋白质脱去水化 层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。
可见，不同类型的各种凝胶溶涨所需 的最少时间是不相同的，请参考有关的技 术数据。 在凝胶溶涨的处理过程中，不能进行 剧烈搅拌，禁止使用电磁搅拌器，以为这 样会使凝胶颗粒破裂而产生碎片。
2. 装柱
将层析剂装入柱中进行层析的方法称 柱层析法。 作层析用的柱子称层析柱。 柱子的一 端为进口，另一端为出口，出口端底部有 烧结玻璃砂板 ，能阻止层析剂流出，溶剂 则可流过。 层析柱的长短粗细根据实验的 目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长， 分离效果越好。但柱过长，层析时间长， 样品易稀释造成扩散。
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质课件
实验三葡聚糖凝胶柱 层析纯化蛋白质课件
目录
• 实验原理 • 实验材料与设备 • 实验步骤 • 结果分析与讨论 • 注意事项与安全
01
实验原理
葡聚糖凝胶柱层析的原理
葡聚糖凝胶是一种具有三维网络结构的凝胶，具有良好的机 械强度和化学稳定性。它可以通过改变凝胶孔径的大小来分 离不同大小的分子。
当混合物溶液通过葡聚糖凝胶柱时，分子量较小的物质可以 进入凝胶孔内，而分子量较大的物质则被排阻在外。随着流 动相的流动，分子量小的物质逐渐被冲出凝胶柱，而分子量 大的物质则被滞留在凝胶柱内或缓慢流出。
结果的讨论与优化
结果讨论
根据实验结果，讨论凝胶柱层析纯化蛋白质的效果，分析可能影响分离效果和蛋 白质纯度的因素，如凝胶柱的填装、洗脱液的组成和洗脱速度等。
结果优化
根据结果讨论，提出优化实验条件的建议，如改变凝胶柱的填装方式、调整洗脱 液的组成或改变洗脱速度等，以提高蛋白质的分离效果和纯度。
05
注意事项与安全
分离度的计算
分离度是相邻两个峰之间的距离与峰宽的比值，可以通过测量洗脱液中 蛋白质的浓度变化来计算。
03
回收率的计算
回收率是纯化后蛋白质的质量与纯化前蛋白质的质量的比值，可以通过
称重法或紫外吸收法来测量。
蛋白质纯度的检测
检测方法：蛋白质纯度的检测方法包 括电泳法、质谱法、免疫学检测法和 光谱分析法等。电泳法是最常用的方 法之一，可以通过观察电泳图谱来判 断蛋白质的纯度。
电泳图谱的分析：电泳图谱中，单一 的、清晰的条带表明蛋白质纯度较高 ；而模糊的、多条带则表明蛋白质中 含有杂质。
纯度标准：蛋白质纯度标准通常由国 际蛋白质协会制定，分为一级、二级 和三级纯度标准。一级纯度标准要求 蛋白质中仅含有一种单体蛋白质，不 含有其他杂质；二级纯度标准要求蛋 白质中主要含有一种单体蛋白质，其 他杂质含量不得超过5%；三级纯度标 准要求蛋白质中主要含有一种单体蛋 白质，其他杂质含量不得超过10%。
葡聚糖凝胶层析法
实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法；一、实验目的；1.掌握凝胶层析的基本原理；2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实；二、实验原理；凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大；将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表；式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大；上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶；如果假定蛋白质实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。
2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。
二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
实质上Vt是由V i与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质讲课讲稿
琼脂糖凝胶特点
❖室温下其稳定性胶葡聚糖凝胶和聚丙烯酰 胺凝胶，对样品的吸附性很小。
❖洗脱速度较快
❖排阻极限大，分离范围广，适合分离大分 子物质。
小结
❖ 凝胶层析的原理：分子筛效应 ❖ 凝胶层析有效分配系数（Kav）：被分
离的化合物被凝胶排阻的程度。 ❖ 层析实验操作过程中的注意事项。 ❖ 实验结果：观察到蓝色蛋白洗脱快，黄
溶质在固定相中的浓度（Cs）
K=
溶质在流动相中的浓度（Cm）
☻K值大：被固定相吸附的牢固，随流动相的移 动速度较慢。
☻若混合物中各组分K值相差较大, 则能较易地分 离，反之，K值相差较小，分离效果差。
离子交换层析(ion exchange chromatography)
用离子交换剂（在惰性载体上引入带有电荷的活性 基团）作固定相，与流动相中离子发生可逆性离子 交换反应而进行分离的方法。
重点1
凝胶层析的原理
分子筛效应
❖ 比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部， 完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外 的空间随流动相向下流动，它们经历的 流程短，流动速度快，首先流出。
❖ 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部，然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度慢，后流出。
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 凝胶体积Vg
❖分离原理 在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的
配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发 生可逆的特异性结合而进行分离纯化。
1. Incubate crude
2. Wash away non bound
sample with the
sample components from
葡聚糖凝胶层析
1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。
方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。
在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。
2.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。
纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。
去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。
柱太短，影响分离效果。
柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。
层析柱的内径也要选择适当。
内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。
所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。
对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。
凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。
一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。
通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。
3.加样与洗脱（1）加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。
如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。
例如利用凝胶层析分离蛋白质时，若采用28Onm波长测定吸光度，对一根2cm×6Ocm的柱来说，加样量需5mg左右。
一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。
通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5％～10％。
样品体积过大，分离效果不好。
对高分辨率的分子筛层析，样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定，故高吸水量凝胶如Sephadex G-200，每mL总床体积可加0.3～0.5mg溶质，使用体积约为0.O2倍总体积；而低吸水量凝胶如Sephadex G–75，每mL总床体积加溶质质量为0.2mg，样品体积为0.Ol倍总体积。
葡聚糖凝胶实验报告
一、实验目的1. 掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2. 学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
3. 了解分子量对分离效果的影响。
二、实验原理凝胶层析，又称分子排阻层析或凝胶过滤，是一种以被分离物质的分子量差异为基础的层析分离技术。
该技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。
层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。
可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
在葡聚糖凝胶层析中，待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。
分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程长，后流出层析柱。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 葡聚糖凝胶G15- 待分离样品（蛋白质溶液）- 缓冲液（磷酸盐缓冲液，pH 7.0）- 甲醇- 水浴锅- 凝胶层析柱- 移液器- 离心机- 超滤器2. 实验仪器：- 电子天平- 紫外分光光度计- pH计- 显微镜四、实验步骤1. 准备葡聚糖凝胶：将葡聚糖凝胶G15浸泡于蒸馏水中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，或者用热水浸泡（不建议煮沸）至少1小时直至充分溶胀，凝胶体积不再变化。
2. 准备缓冲液：配制磷酸盐缓冲液（pH 7.0），用超滤器过滤，以去除其中的大分子物质。
3. 装柱：将凝胶层析柱清洗干净，用缓冲液润湿并保持一小段液位，确保底端无气泡。
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凝胶类型:葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼 脂糖凝胶(Sepharose). 葡聚糖凝胶:直链的葡聚糖分子和交联剂 3—氯1,2—环氧丙烷交联而成.
葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体,来分离 蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝.蓝色葡聚 糖—2000分子量接近2×106, 而溴酚蓝分 子量为670,二者分子量相差较大,前者完 全排阻,而后者则可完全进入凝胶颗粒网 孔内,二者通过层析柱的时间不同而分开.
3.加样品:打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出, 直至床面与液面刚好平齐为止,关闭下端出口. 取溴酚蓝及蓝色葡聚糖—2000混合液0.3毫升,小 心地加于凝胶表面上,切勿搅动层析柱床表面. 打开下端出口,使样品溶液进入凝胶内,并开始 收集流出液.当样品溶液恰好流至与凝胶表面平 齐时,关闭下端出口.用少量洗脱液清洗层析柱 加样区,共洗涤三次,每次清洗液应完全进入凝 胶柱内后,再进行下一次洗涤.最后在凝胶表面 上加入洗脱液,保持高度为3—4cm.
葡聚糖凝胶层析
实验目的
【实验目的】 实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理.
2.学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术.
葡聚糖凝胶层析原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析,排阻层析. 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离
凝胶层析: 凝胶层析:
实验材料
1.实验器材:层析柱(1×20cm)附有一小 实验器材: 实验器材 段乳胶管及螺旋夹;洗脱液瓶(带下口的 三角瓶,250m1);试管及试管架;量筒 10m1;721型分光光度计 2.实验试剂 实验试剂
(1)Tris—醋酸缓冲液(pH7.0): (2)溴酚蓝与葡聚糖—2000 混合样品. (3)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)
4.洗脱与收集:连接好凝胶柱层析系统,调 节洗脱液流速为每分钟1毫升,进行洗脱. 仔细观察样品在层析柱内的分离现象,收 集洗脱液,每收集3毫升即换一支收集管(试 管预先编号),收集约20管左右,样品即可 完全被洗脱下来.将各收集管中的洗脱液 分别用721型分光光度计在波长完全洗脱下来 后,继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝 胶后,将柱下口放在小烧杯中,慢慢打开, 再将上口慢慢松开,使凝胶全部回收至小 烧杯中,备用.
实验结果
以洗脱管号为横坐标,以光密度为纵坐标 作图即得洗脱曲线.分析曲线图并讨论实 验结果.
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实验操作
1.实验凝胶的处 理: 用洗脱液把杂质 漂洗干净. 2.装柱: A.将层析柱洗净, 垂直固定在铁支 架上,选择有薄 膜端作为层析柱 下口,将下口接 上乳胶管并用螺 旋夹夹紧.
B.层析柱中加入洗脱液,打开下口 螺旋夹,让溶液流出,排除残留气 泡,最后保留约2厘米高度的洗脱液, 拧紧螺旋夹. C.将凝胶轻轻搅动均匀,用玻璃棒 沿层析柱内壁缓缓注入柱中,待凝 胶沉积到柱床下已超过l厘米时,打 开下口螺旋夹,继续装柱至柱床高 度达到12厘米,关闭出口.再用洗脱 液平衡l至2个柱床体积,凝胶面上 始终保持有一定的洗脱液.平衡后, 拧紧下端螺旋夹.注意事项:装柱 过程中严禁产生气泡,尽可能一次 装完,避免出现分层.