实验二 细菌单染色及革兰氏染色法
实验二细菌单染与复染
革兰氏染色
丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究 细菌细胞壁的结构
G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质， 故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质， 增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和 碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。 G＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽 聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍 保留初染时的紫色。
实验二 细菌简单染色法 革兰氏染色法
一、目的要求
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1．巩固油镜的使用方法； 2．学习微生物涂片、染色基本技术，掌握细 菌的简单染色法； 3．学习、掌握细菌的革兰氏染色法； 4．建立“无菌操作”的概念，学习其技术。
二、实验原理
简单染色法：是利用单一染料对细菌进行 染色的方法，常用碱性染料。只能观察微 生物的大小、形状、和细胞排列状况，但 不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。 复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 鞭毛染色法等。
革兰氏染色结果及细菌分类
细菌细胞结构
革兰氏染 色阴性
Left: 单菌染色结果 (G+或 G-)
Right: 混合菌染色结果 (G+和 G-)
五、实验结果
文字记录所观察到的革兰氏染色 结果的差别，判断是G－/ G＋。 绘图描述各菌形态（可在一个视 野中）。
六、问题与讨论
1革兰氏染色涂片为何不宜太浓厚？ 实验关键步骤？ 2对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样才能确证你的结论正确？
三、实验材料
变形杆菌、表皮葡萄球菌
载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲 苯、擦镜纸、吸水纸等。 革兰氏染色液一套
细菌单染色及革兰氏染色过程观察
BEIJING SOLARBIO SCIENCE &TECHNOLOGY CO.,LTD细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察1.基本原理（1）简单染色法用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
（2）革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染BEIJING SOLARBIO SCIENCE &TECHNOLOGY CO.,LTD 液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。
实验二 细菌单染色及革兰氏染色法
冯 新
实验三
细菌单染色及革兰氏染色法
一、实验目的
• 学习细菌的革兰氏染色原理和方法
• 了解细菌的特殊形态结构： 芽孢、荚膜、鞭毛
二、实验原理
• 单染色法：只能观察微生物的大小、形状、 和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及 它的特殊构造等。 • 复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 鞭毛染色法等。
2）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？ 如果加热温度过高、时间过长，又会怎样？
3）为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观察？ 4）涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？ 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？ 哪一步是关键？Why?
实验四
真菌染色技术
2．染色标本检查：
1）革兰氏染色：
4 操作步骤 水浸片观察 （1） 在载玻片上滴加一滴美兰染液，用接 种环以无菌操作方式挑取少许真菌，在染液 中充分混匀，盖上盖玻片。 （2） 镜检：先低倍镜观察，后换用高倍镜 观察细胞形态。 （3）绘出真菌形态特征图
实验步骤
操作步骤
无菌操作
涂片
干燥
染色
固定
水洗
干燥
镜检
革兰氏染色
• 丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究 • 细菌细胞壁的结构
革兰氏（Gram）染色法
1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸 铵结晶紫染液，染1分钟，倾去 染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：除去残水后，用稀碘液覆 盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒 精进行脱色约30－60秒，后立即 用流水冲洗。 5. 复染：滴加石碳酸复红染色液， 染30秒，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
实验二细菌的单染色及革兰氏染色
掌握染色步骤
选择适当的染料，对细菌进行固定、 染色、脱色、复染等步骤，确保染色 效果良好。
掌握革兰氏染色技术
了解革兰氏染色的原理
革兰氏染色是一种用于区分革兰氏阳 性菌和革兰氏阴性菌的染色技术。
掌握染色步骤
在涂片上涂抹细菌，然后使用结晶紫 、碘液和酒精等染料进行染色和脱色
，最后用番红和石炭酸复染。
识别染色结果
革兰氏染色结果分析
染色反应
革兰氏染色可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类 ，通过染色反应可以初步判断细菌的致病性。
颜色变化
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色，通过颜色变化可以判 断细菌类型。
染色准确性
革兰氏染色准确性较高，对于初步鉴别细菌种类具有重要意义。
实验结果在细菌鉴别中的应用
初步鉴别
通过单染色和革兰氏染色实验结果，可以对细菌进行初步鉴别，确 定可能的致病菌种类。
辅助诊断
在临床诊断中，细菌鉴别对于确定感染源、选择合适的治疗方案具 有重要意义。
科研应用
在科研领域，细菌鉴别可以为研究不同类型细菌的生物学特性、致病 机制等提供基础数据。
06
CATALOGUE
注意事项与实验改进
实验注意事项
实验前需确保实验室环境清洁 ，避免污染。
使用显微镜时，应确保镜头清 洁，以免影响观察效果。
在操作过程中，应避免细菌污 染，尤其是避免交叉污染。
实验结束后，应按照实验室规 定正确处理废弃物。
实验操作技巧与难点解析
01 涂片时，应保证涂片均匀，避免产生气泡 。
02 染色时，应控制染色时间，避免染色过度 或不足。
情况。
02
CATALOGUE
实验原理
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌是微生物中最常见的一类生物，它们广泛存在于自然界的各个角落，包括土壤、水体、空气等。
为了更好地了解细菌的形态和结构，科学家们开展了许多实验，其中包括细菌的简单染色和革兰氏染色。
一、细菌的简单染色实验细菌的简单染色是一种常用的染色方法，通过给细菌染色，可以使其在显微镜下更加清晰可见。
这种染色方法主要使用了一种叫做甲基蓝的染料。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片。
将一根无菌的钢丝棒蘸取一小滴细菌悬液，然后将其均匀地涂抹在玻璃片上。
待涂片干燥后，将其固定在火焰上加热的玻璃柱上，以使细菌附着在玻璃片上。
接下来，将制备好的涂片放入染色盒中，加入适量的甲基蓝染料，浸泡片刻。
然后，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
最后，用纸巾轻轻吸干涂片上的水分，将其放入显微镜下观察。
在显微镜下观察，我们可以清楚地看到细菌的形态和结构。
不同种类的细菌可能会呈现出不同的形状，例如球状、杆状、螺旋状等。
通过简单染色，我们可以更好地观察和研究细菌的特征。
二、革兰氏染色实验革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
这种染色方法主要使用了紫晶染料和碘酒。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片，方法与简单染色相同。
然后，将涂片放入染色盒中，加入适量的紫晶染料，浸泡片刻。
接着，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
接下来，将碘酒滴在涂片上，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
随后，滴入乙醇或酒精醛溶液，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
最后，滴入蓝色染料，浸泡片刻后用蒸馏水冲洗涂片。
在显微镜下观察，我们可以看到细菌的染色效果。
革兰氏阳性菌会呈现紫色或蓝色，而革兰氏阴性菌则呈现红色或粉色。
这是因为革兰氏阳性菌的细胞壁含有较多的胆固醇，可以吸附紫晶染料和碘酒，而革兰氏阴性菌的细胞壁则较薄，无法吸附这些染料。
实验二细菌单染色及革兰氏染色法
该方法通常使用结晶紫、姬姆萨 染料或瑞氏染料等染料进行染色。
染色过程中，染料能够进入细菌 细胞内，与细胞成分结合，使细
菌着色。
革兰氏染色法原理
革兰氏染色法是一种用于区分革 兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的染
色方法。
该方法通过使用结晶紫、碘液和 酒精等染料和试剂，对细菌进行 初染、媒染、脱色和复染等步骤。
将涂片放入复染液中， 使细菌重新染色。
水洗
用流水冲洗涂片，去 除染色液。
干燥
将涂片自然干燥或用 吸水纸吸干。
结果观察与记录
在显微镜下观察染色后的细菌涂片，记录观察到的细菌形态、染色深浅等特征。 根据观察结果，判断细菌的革兰氏染色反应，即阳性或阴性。
记录实验数据和结果，并进行分析和解释。
05
实验结果与分析
细菌单染色结果分析
01
02
03
染色效果
通过细菌单染色，可以清 晰地观察到细菌的形态、 大小和排列情况，为后续 分析提供基础。
染色方法
本实验采用了结晶紫染色 法，该方法操作简便，染 色效果稳定。
注意事项
在染色过程中，需严格控 制染色时间，避免染色过 度或不足，影响观察效果。
革兰氏染色结果分析
染色效果
熟悉染色法的操作流程
细菌单染色法的操作流程
制备细菌涂片→加温固定→加染料染色→水洗→干燥→观察。
革兰氏染色法的操作流程
制备细菌涂片→加结晶紫染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→水洗→沙 黄复染→水洗→干燥→观察。
了解染色结果与细菌特性的关系
细菌单染色法的染色结果
通过观察染色后的细菌，可以初步判断细菌的形态和大小，有助于鉴别细菌种类 。
革兰氏染色法的染色结果
微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色_图文_图文
染色结果
金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果
染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果
染色结果
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果
四、实验结果
显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数
绘图记录观察结果
思考题
1、在制作涂片中，为什么要进行固定这 一步？
2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳 性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁 的结构和组成不同决定的。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂 结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用 乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红 )复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂 蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞 中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染 剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌 。
2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂
面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的
水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 7、镜检：油镜观察并绘图。
二、实验原理---简单染色
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增 加其对染料的亲和力。常用的有加热和化 学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原 有的形。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染 色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
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革兰氏染色
• 丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究 • 细菌细胞壁的结构
实验步骤
操作步骤
无菌操作
涂片
干燥
染色
固定
水洗
干燥
镜检
革兰氏（Gram）染色法
1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸 铵结晶紫染液，染1分钟，倾去 染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：除去残水后，用稀碘液覆 盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒 精进行脱色约30－60秒，后立即 用流水冲洗。 5. 复染：滴加石碳酸复红染色液， 染30秒，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。
Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells.
Figure 2 - Gram stain of Gram –
E. colห้องสมุดไป่ตู้ cells
实验报告
1、细菌简单染色、革兰氏染色的原理、方法和步骤。 2、记录所观察到的染色结果，并绘图 思考题 1）制备细菌染色标本时应注意哪些环节？
实验要求
������ 法 学习并掌握水浸片法制备标本片的方 ������ 按要求绘形态图
微生物学实验
冯 新
实验三
细菌单染色及革兰氏染色法
一、实验目的
• 学习细菌的革兰氏染色原理和方法 • 掌握细菌涂片的制备 • 掌握无菌操作技术
二、实验原理
• 单染色法：只能观察微生物的大小、形状、 和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及 它的特殊构造等。 • 复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 鞭毛染色法等。
2）涂片为何要固定？如果你的涂片未经热固定， 将会出现什么问题？ 如果加热温度过高、时间过 长，又会怎样？要得到正确的革兰氏染色结果必 须注意哪些操作？哪一步是关键？Why?
3）为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观察？
实验四
真菌染色技术
4操作步骤 水浸片观察 （1） 在载玻片上滴加一滴美兰染液，用接 种环或镊子以无菌操作方式挑取少许真菌， 在染液中充分混匀，盖上盖玻片。 （2） 镜检：先低倍镜观察，后换用高倍镜 观察细胞形态。 （3）绘出真菌形态特征图