实验4 细菌革兰氏染色法讲解学习
实验4细菌革兰氏染色法课件讲解材料18页PPT
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
实验4细菌革兰氏染色法课件讲解材料 4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。
实验四细菌革兰氏染色与芽孢染色
实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色一、目的要求1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验材料1.菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。
通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。
革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。
经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。
大肠杆菌是标准的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革兰氏阳性菌。
革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。
经结晶紫初染以后，所有的细菌都被染成蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。
用蕃红复染时染上红色。
四、操作步骤1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。
2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。
4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。
细菌形态结构观察——简单染色革兰氏染色
接物镜转开，滴加一小滴香柏油于涂片处，用油镜进行观察。
注意各种细菌的形态和细菌的排列方式。观察完毕，注意清 洁油镜。
3、革兰氏染色法 （1） 涂片 取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌制成涂片，干燥、 固定。
（1） 为什么必须用培养24 h以内的菌体进行革兰氏 染色？
（2） 要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些 操作？哪一步是关键步骤？为什么？
（3） 当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操 作正确，结果可靠？
） “和而不同”，多元发展。近年来 ，中医 药在防 治非典 、禽流 感和艾 滋病方 面发挥 的独特 作用也 证实了 二者的 有机结 合，具 有肯定 的临床 疗效。 编辑本段东西方医学交融（df高血压958心脏 病983u6糖尿 病87fr）
革兰氏染色有着重要的理论与实践意义，其染色
原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。革 兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖 网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩 小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保 留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色。而革 兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂 含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径 变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞 壁，因而细胞壁被脱色，再经蕃红复染后细胞呈红色。
三、实验器材
1、菌种 培养24h的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
2、染液 （1） 简单染色 草酸铵结晶紫染液。 （2） 革兰氏染液 草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、 95%乙醇、蕃红染液。
3、其他物品 显微镜、载玻片、香柏油、擦镜纸、接种 环、蒸馏水、染色架。
实验四革兰氏染色技术(精)
染液因素
注意试剂的有效期，是否变质，异常时不使用 结晶紫易沉淀 卢戈氏碘液易变质 酒精易挥发
细菌因素
衰老变性的细菌会出现染色性改变
视频：革兰氏染色
（2）斜面培养物涂片： 用细菌斜面（或平板）培养物涂片，需预先将 接种环沾取生理盐水 1~2 环臵于载玻片中央， 然后再按上述无菌操作法从斜面培养物上沾取 葡萄球菌或大肠杆菌菌苔少许，混于生理盐水 中，轻轻研匀，涂成直径 lcm 左右的均匀薄膜。
2．干燥
涂片最好在室温自然干燥，如需加速干燥，也可将
涂面向上，小心地放臵离火焰 20 ㎝处，远 离火焰 上方微加温略烘促使干燥（ 切勿加热过度，以 防 将标本烧枯）。
3．固定
标本干燥后，常用加热固定法。在火焰的最热部分
让玻片有菌膜的面向上，通过酒精灯火焰三次（约 2~3秒钟），固定之目的是使细菌蛋白变性，菌体 牢固黏附于玻片上，还可杀死细菌，改变菌体对染 料的通透性。
5.结果
染色片待干后，于油镜下，调强光视野观察，呈紫
色的为革兰阳性菌，呈红色的为革兰阴性菌。 葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性，以 G+表示；大 肠杆菌染成红色，为革兰阴性，以 G-表示。
菌悬液
涂片
干燥
固定 滴加无 菌水 取菌苔
涂片
四、注意事项
操作因素
脱色：关键步骤 涂片：太厚影响染色，太薄细菌分散不匀 干燥：过热使细菌菌体变形，排列失常
碘 1g；碘化钾 2g ；蒸馏水 300ml
先将碘化钾 2g 溶于 100ml 蒸馏水中，再加碘 1g，用力摇匀待溶解后加蒸馏水至 300ml 即成。供革兰染色媒染用。
实验细菌的简单染色与革兰氏染色
掌握简单染色和革兰氏染色的操作方法
简单染色
将细菌涂片或培养物直接与染料混合 ，然后进行观察。操作简单，适用于 初步观察细菌形态。
革兰氏染色
一种特殊的染色方法，通过结晶紫初 染、碘液媒染、酒精脱色和沙黄复染 等步骤，将细菌分为革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌两类。
出版年份：XXXX年
THANK YOU
简单染色方法简便，操作相对容易，但只能显示细菌的形态 和结构，不能提供细菌的种类信息。
革兰氏染色原理
01
02
03
04
05
革兰氏染色是一种常用 的细菌鉴别染色法，通 过使用结晶紫、碘液和 酒精等染料对细菌进行 染色，能够将细菌分为 革兰氏阳性菌和革兰氏 阴性菌两大类。
革兰氏染色的原理主要 是基于细菌细胞壁的成 分和结构不同，导致对 染料的吸附和着色能力 。
复染
将涂片浸入稀释后的伊 红或沙黄染色液中，染
色一定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除 染色液。
观察
在显微镜下观察染色结 果，判断细菌是革兰氏
阳性还是阴性。
05
实验结果与分析
简单染色结果与分析
染色结果
通过简单染色法，细菌被 染上了不同的颜色，如红 色或紫色。
03
04
涂片制备
将细菌均匀涂在载玻片上，晾 干。
染色
将涂片浸入染色液中，染色一 定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除染色液 。
观察
在显微镜下观察染色结果，判 断细菌类型。
革兰氏染色步骤
01
02
03
涂片制备
实验4-革兰氏染色
实验四细菌的革兰氏染色形态观察，平板及斜面菌落观察一、目的要求学习并初步掌握细菌的革兰氏染色方法；巩固革兰氏染色的原理及G-及G+细菌细胞壁结构的特点；了解革兰氏染色在细菌分类鉴定上的重要性；掌握细菌菌落与菌苔的主要特征。
二、实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫初染；再加媒染剂--碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。
凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
三、实验器材1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器显微镜；3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。
4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液。
四、操作步骤1、涂片在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。
2、固定将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
实验四 革兰氏染色法
实验四革兰氏染色法实验教学课题：实验四革兰氏染色法实验教学目的：1学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的革兰氏染色。
2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
实验教学重点：细菌革兰氏染色原理和步骤。
实验教学难点：酒精洗脱时间。
实验用品：1大肠杆菌24h的斜面培养物。
2 乳酸菌24h的斜面培养物。
3 简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）4 革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红）5 载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。
6 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。
实验教学方法与手段：板书讲解+演示实验＋学生动手实验教学课时：4课时教学过程：一、实验原理1 简单染色的原理大多数微生物细胞质是带负电荷，简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。
染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。
2 革兰氏染色的原理革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。
革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。
二、实验方法和步骤1、简单染色(1) 涂片:取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。
注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。
(2) 干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。
(3) 固定:于火焰上通过2—3次。
(4) 染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色１分钟。
（5）水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。
实验细菌的简单染色和革兰氏染色详解演示文稿
一 目的要求
1 学习制染色片技术，学习简单染色\革兰氏染色原理， 理解着色机理。
2 学习并掌握无菌操作的技术。 3 掌握简单染色\革兰氏染色的方法，并能正确染色 4 巩固显微镜油镜的使用方法。
二 基本原理
（一）细菌的简单染色原理 （二）革兰氏染色基本原理
（一）细菌的简单染色原理
细菌细胞微小，且含水量较多，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察， 所以必须进行染色处理，使细胞着色，便于观察。 简单染色是使用单一染料染色，可用于观察细菌形态、大小、及排列方式. 染色前一般要将细胞固定，其目的是杀死菌体并使之粘附于玻片上，还可 以增强菌体的着色能力。固定有加热法和化学法两种，无论采用何种方法均 应维持细胞原有形态。
❖革兰氏染色原理：
第一步：结晶紫使菌体着上紫色 第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻 留在细胞内。 第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时， 肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内， 细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因 其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细 胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。
◆用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色
实验三 细菌的简单染色和 革兰氏染色
细菌的简单染色和革兰氏染色
一 目的要求 二 基本原理 三 实验材料 四 无菌操作过程 五 操作步骤 六 实验报告 七 思考题
占细胞壁的90%
占细胞壁的10%
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
【方法步骤】
A. 初染 B. 水洗 C. 媒染 D. 水洗 E. 脱色 F. 水洗 G. 复染 H. 水洗 I. 吸干
图4-1 革兰氏染色程序
【方法步骤】
★获得本实验成功的关键： 1）选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染
成红色而造成假阴性。 2）涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 3）脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，
实验4 细菌革兰氏染色法
【基本原理】
1. 油镜提高分辨率
油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间是隔一层油质。
如香柏油的折射率n=1.52，与玻璃相同。
a)光线通过不减低视野的照明度；
b)更主要能增加数值孔径，提高显微镜的放大效能。
c)
分辨率=λ/2NA
λ=光波波
d) （物镜的数值孔径值）NA=n×sinα α=镜口角的半数
【基本原理】
革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低， 肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩 而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。 而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且 脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先 滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为 无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红）。
★可知n（介质折射率）对提高显微镜的分辩力起着关键性的作
用。
【基本原理】
2. 革兰氏染色 革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性 （G-）两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们 细胞壁的成分和结构不同而造成的。 首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝 紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶 紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。 之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果 不同。
脱色过度造成假阴性。
【实验结果】
图4-2 大肠杆菌染色结果 图4-3 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合染色结果
【注意事项】
★涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜 过热（以玻片不烫手为宜）。 ★加热时使用载玻片夹子及试管夹，以免烫伤。 ★使用染料时注意避免沾到衣物上。 ★使用乙醇脱色时勿靠近火焰。 ★实验后洗手。
【方法步骤】
1. 涂片：将大肠杆菌（16h）和金黄色葡萄球菌（16h）分别 涂片、干燥、固定。 2. 染色： 1）初染：加草酸铵结晶紫一滴（以刚好将菌膜覆盖为宜）， 染色1～2min后倾去染液，水洗至流出水无色； 2）媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min， 倾去碘液，水洗至流出水无色。 3）脱色：用滤纸吸去玻片上的残水（从边缘吸，以防擦去菌 体），将玻片倾斜，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫 色为止，约20～30秒，立即用水冲our attention! 学 实 验 教 学 中 心
Central laboratory of Biology
此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢
图4-1 革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁比较
【实验用品】
1. 菌种：大肠杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色 葡萄球菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。
2. 试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏（Lugol） 碘液，95%乙醇，番红复染液等。
3. 仪器和其他用品：酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装 香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，试管架，镊子，载玻 片夹子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。
【实验报告】
1. 结果 1）绘出油镜下观察的混合区菌体图像。 2）填表
表4-1 结果记录表
菌名
菌体颜色
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
细菌形态
结果（G+,G-）
【实验报告】
2. 思考题 1）革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？ 2）现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该 菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性，如何确定你染色结果的正确 性？ 3）为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？ 4）你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略？在何种情况下 可以省略？
【方法步骤】
4）复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色 2min，水洗，吸去残水晾干（图4-1）。 3.镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰 氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 4.混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对比观察。菌 龄和脱色程度对染色结果影响较大。