基于气相色谱―质谱技术的小青龙汤证大鼠血液代谢组学研究
小青龙汤治疗呼吸系统疾病的研究概况
小青龙汤治疗呼吸系统疾病的研究概况张培旭;蒋时红;吴耀松【摘要】了解小青龙汤治疗呼吸系统疾病的临床运用和实验研究现状及发展方向.通过收集、总结和分析近10年的相关文献发现:小青龙汤在临床中多用于治疗哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺炎、急性支气管炎、过敏性鼻炎、肺纤维化、急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征等呼吸系统疾病,并取得了良好的治疗效果;小青龙汤可通过止咳平喘、抗炎、抗过敏、增强机体免疫力等机制发挥其治疗呼吸系统疾病的作用.【期刊名称】《中医研究》【年(卷),期】2017(030)010【总页数】3页(P75-77)【关键词】小青龙汤/治疗应用;呼吸系统;机制;临床应用;实验研究;综述【作者】张培旭;蒋时红;吴耀松【作者单位】河南中医药大学,河南郑州450046;河南中医药大学,河南郑州450046;河南中医药大学,河南郑州450046【正文语种】中文【中图分类】R289.5小青龙汤是汉代张仲景所创的一首经典方剂，由麻黄、芍药、桂枝、五味子、干姜、半夏、细辛和炙甘草组成，具有散寒解表、温肺化饮之效[1]，主治外感风寒、水饮内停，症见恶寒、发热、咳喘气逆、胸闷憋喘、咳痰清稀或泡沫痰、舌苔白腻或白滑、脉弦滑或弦紧等。
《伤寒论》和《金匮要略》中均有小青龙汤的记载。
《伤寒论·辨太阳病脉证并治中第六》曰：“伤寒，表不解，心下有水气，干呕，发热而咳，或渴、或利、或噎，或小便不利，少腹满，或喘者，小青龙汤主之。
”笔者通过历代医家的总结和发展，结合中医学理论和现代研究成果，对目前临床运用小青龙汤治疗呼吸系统疾病的相关机制进行研究，综述如下。
支气管哮喘是呼吸系统常见病，临床以发作性喘息、气急、胸闷、咳嗽为主要症状，中医学称之为“哮证”。
哮喘的发病机制十分复杂，目前在全球近1亿的哮喘患者中，有50%属于难以控制的哮喘[2]。
有研究者[3-6]发现：小青龙汤加减在改善支气管哮喘患者的主要临床症状如喘息、哮鸣音、胸闷、咯痰等方面具有明显优势，特别是在化痰方面疗效显著，能提高患者肺功能，且用药安全。
基于气相色谱-飞行时间质谱技术的佐剂性关节炎大鼠尿液代谢组学的研究
１．１ 仪器与试剂 Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ 气 相 色 谱 仪 （ 美 国 Ａｇｉｌｅｎｔ 公 司） ； ＬＥＣＯ Ｃｈｒｏｍａ ＴＯＦ ＰＥＧＡＳＵＳ ＨＴ 质谱仪（ 美 国 ＬＥＣＯ 公司）； Ｒｘｉ⁃５Ｓｉｌ ＭＳ 毛细管柱（美国 Ｒｅｓｔｅｋ 公司）； ＰＶ⁃２００ 足趾容积测量仪（ 成都泰盟软件有 限公司） ； ＧＬ⁃２０Ａ 全自动冷冻高速离心机（ 湖南仪 器仪表总厂离心机厂） ； Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ 显微镜（ 日本 Ｎｉｋｏｎ 公司） ； ＬＮＧ⁃Ｌ２ × ９６ 冷冻浓缩干燥仪 （ 太仓 市华美生化仪器厂） ； ＭＤＦ⁃Ｕ７１Ｖ 超低温冰箱 （ 日 本三洋公司） 。 ＦＣＡ、脲酶（ 美国 Ｓｉｇｍａ 公司） ； Ｌ⁃２⁃氯苯丙氨 酸（上海恒柏生物科技有限公司）； Ｎ，Ｏ⁃双三甲基 硅基三氟乙酰胺（ ＢＳＴＦＡ，含 １％ （ ｖ ／ ｖ） 三甲基氯硅 烷（ ＴＭＣＳ） ） （ 美 国 ＲＥＧＩＳ 公 司） ； 甲 醇 为 色 谱 纯 （ 国药集团化学试剂有限公司） ；甲醛（ 纯度＞３６％ ） 、 氯仿（ 纯度 ＞ ９９������ ８％ ） （ 中国阿达玛斯公司） ；甲氧胺 盐酸 盐 （ 纯 度 ＞ ９８％ ） 、 吡 啶 （ 纯 度 ＞ ９９������ ５％ ） （ 美 国 Ｓｉｇｍａ⁃Ａｌｄｒｉｃｈ 公司） 。 １．２ ＡＡ 模型的建立 ＳＤ 雄性大鼠 ２０ 只，体重（ ２２０ ± ２０） ｇ，由安徽
Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｒａｔ ｕｒｉｎｅ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｕｓｉｎｇ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ⁃ｔｉｍｅ⁃ｏｆ⁃ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｇ２， ＪＩＡＮＧ Ｈｕｉ１， ＨＡＮ Ｙａｎｑｕａｎ１， ＬＩ Ｙｕｘｉｎ２
第６期
小青龙汤对肺癌大鼠VEGFVEGFR信号通路的影响研究
小青龙汤对大鼠VEGF/VEGFR信号通路的影响研究李慧、，冷静、，赵磊0(1.新疆医科大学第二附属医院，新疆乌鲁木齐830000；.新疆医科大学，新疆乌鲁木齐830000)［摘要］基于VEGF/VEGFR信号通路探讨小青龙汤对肺癌大鼠的作用及机制。
取24只成年雄性SD大鼠，利用尾静脉注射含WalPas-256细胞的腹水细胞悬液法建立肺癌模型，造模完成后随机分为模型组、小青龙汤组、贝伐珠单抗组、小青龙汤联合贝伐珠单抗组各6只，另取6只大鼠不做任何处理作为对照组。
小青龙汤组给予小青龙汤10mL/kg灌胃，贝伐珠单抗组给予贝伐珠单抗2mg/kg腹腔注射，小青龙汤联合贝伐珠单抗组给予小青龙汤10mL/kg灌胃及贝伐珠单抗2mg/kg腹腔注射，模型组及对照组灌胃给予等量生理盐水，均1次/i,连续28i。
实时定量PCR法检测各组大鼠肺组织中pl6、p21、p53 mRNA表达情况，流式细胞术检测肺组织细胞凋亡率，苏木精-伊红染色法观察肺组织病理学变化,Western blc-法检测肺组织中VEGF、VEGFR2表达水平。
与模型组比较，小青龙汤组、贝伐珠单抗组及小青龙汤联合贝伐珠单抗组大鼠肺组织中pl6、p21、p53mRNA相对表达量和VEGF、VEGFR2表达水平均显著降低(P均＜0.05)，肺细胞凋亡率均显著升高(P均＜0.05)，肺组织病理学明显改善，且小青龙汤联合贝伐珠单抗组较其他组变化更明显(P均＜0.05)。
小青龙汤能够促进大鼠肺癌细胞凋'，改善肺组织病理学变化，其机制可能与调节VEGF/VEGFR信号通路有关。
［关键词］小青龙汤；肺癌；VEGF/VEGFR信号通路dci：10.3969/j.issn.1008-8849.2021.06.006［中图分类号］R-332［文献标识码］A［文章编号］108-8849(2021)06-0598-05 Effect of Xiaoqiaglong Deccction on VEGF/VEGFR signal pathway ia—ng ccnccr raieLI Hui1,LENG JUg1,ZHAO Lei4(1.The Seccui Affiliated Hospital oS Xinjiana Medical Universitu,Urumqi830000,Xinjiana,China；2.Xinjiang Medical Utneresnhs，Ueumqn830000，Xntunnte，Chntn)AbstracS:Objective It is to stuUs the effect anC mechanism oS XiaoqinaPua Deccctiou ou Pua canccs in rats based ou the VEGF/VEGFR signal pathway.Methods Tweotu-fous adult male SD rats were selected and given the ascites cell sus-peosiou ceutaining Walkeu256ceUs bs injectiou into the tail vein to estadlisk luna canccs models.After the modelinc was completed,they were raniomp divibed into model group,Xiaouinaloua Deccctiou group,bevacizumad group and XUopipi gloua Deccctiou plus bevacizumad group(combinatiou group),each group had6rats:another6rats without ans treatment as the ceutroi group.Xiaouinaloue Deccctiou group was given Xiaouingloua Deccctiou1mL/kg bs gavaae,bevacizumad group was given bevacizumad2me/kg bs intraderitoueal injectiou,the combiantiou group was given Xiaouinaloua Deccctiou 1mL/kg bs gavaae and bevacizumad2me/kg bs intraneritoueal injectiou,and the model group and the ceutroi group were given the same amount oS normal saline bs gavaae,all the groups were treated ouce a iay for22cousechtUe days.Realtime quuntitative PCR method was used to detect the expressiou oS p1,ph1,and p53mRNA in the luna tissue oS rats in each group,Cow cytometrn was used to detect the apoptosis rate oS tuna tissue,hematoxylin-cosin stainina method was used to oiserve the pathoPaUal changes oS tuna tissue,Western blot method was used to detect the expressiou levels oS VEGF［作者简介］李慧，女，硕士，副主任医师，研究方向为中医内科学。
顶空—固相微萃取—气相色谱—质谱联用技术对灌胃细辛后小鼠脑、
顶空—固相微萃取—气相色谱—质谱联用技术对灌胃细辛后小鼠脑、肝和血液中7个挥发性主要成分的定量分析研究采用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS）对灌胃给药细辛后吸收入小鼠体内的细辛活性成分4-烯丙基苯甲醚、甲基丁香酚、2，3，5-三甲氧基甲苯、3，4，5-三甲氧基甲苯、细辛素、3，5-二甲氧基甲苯和黄樟醚进行了定量研究。
采用VF-WAXms毛细管柱（0.25mm×30m，0.25μm）和SPME 萃取头PDMS/DVB（65μm），建立了7个成分的标准曲线，验证了该方法稳定性（RSD<15%）、重复性（RSD<9.5%）、精密度（RSD<22%）、相对回收率（87.0%～108%）和提取回收率（74.9%～102%），并使用验证后的方法确定了7个主要吸收成分的量，在给药后小鼠肝、脑和血液中检测到的质量分数分别为4-烯丙基苯甲醚0.22，0.14μg·g-1，0.25mg·g-1；甲基丁香酚1.1，0.39μg·g-1，0.69mg·g-1；2，3，5-三甲氧基甲苯0.45，0.13μg·g-1，0.54mg·g-1；3，4，5-三甲氧基甲苯0.51，0.15μg·g-1，0.45mg·g-1；细辛素0.48，0.039μg·g-1，0.69mg·g-1；3，5-二甲氧基甲苯2.2，1.2μg·g-1，1.5mg·g-1；黄樟醚1.3，0.67μg·g-1，1.1mg·g-1。
结果表明HS-SPME-GC-MS分析方法适合于中药中挥发性成分在体内的分析测定，样品用量少，快速简便；含量测定数据为进一步认识细辛药材有效物质和毒性物质提供了科学资料。
标签：细辛；挥发性成分；顶空-固相微萃取-气相色谱质谱联用技术；定量分析；生物样品检测；肝组织；脑组织；血液细辛为常用中药，用于风寒感冒、头痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、风湿痹痛、痰饮喘咳。
基于电子鼻和溶剂辅助风味蒸发-气相色谱-质谱联用技术分析调味小龙虾挥发性风味特征差异
基于电子鼻和溶剂辅助风味蒸发-气相色谱-质谱联用技术分析调味小龙虾挥发性风味特征差异张权;李金林;胡明明;彭斌;钟比真;涂宗财【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2024(50)8【摘要】为探究调味小龙虾风味特征差异,该文以市售常见调味小龙虾为研究对象,采用电子鼻结合溶剂辅助风味蒸发-气相色谱-质谱联用(solvent-assisted flavor evaporation-gas chromatography-mass spectrometry,SAFE-GC-MS)技术对其挥发性风味成分进行分析。
结果表明,电子鼻能够较好地区分不同调味小龙虾,W1W(对无机硫化物灵敏)、W1S(对甲基类灵敏)和W2W(对芳香成分、有机硫化物灵敏)是区分调味小龙虾风味的主要传感器。
8个调味小龙虾样品中共检出127种挥发性风味物质,通过相对气味活度值(relative odor activity value,ROAV)法确定了15种关键风味物质和10种修饰性风味物质,其中麻辣小龙虾主要关键风味物质为芳樟醇、桉叶油醇、丁香酚和D-柠檬烯,十三香小龙虾主要关键风味物质主要为丁香酚、芳樟醇、桉叶油醇、壬醛和β-蒎烯,而蒜蓉小龙虾主要关键风味物质为2,4-二叔丁基苯酚、L-石竹烯、壬醛、苯乙醛、2-甲基-2-丁烯醛和二烯丙基硫醚等。
该研究结果可为调味小龙虾风味统一、产品开发和生产提供理论参考。
【总页数】11页(P242-252)【作者】张权;李金林;胡明明;彭斌;钟比真;涂宗财【作者单位】江西师范大学生命科学院;江西师范大学国家淡水鱼加工技术研发专业中心;南昌大学【正文语种】中文【中图分类】TS2【相关文献】1.溶剂萃取/溶剂辅助风味蒸发-气相色谱/质谱联用分析野韭菜花挥发性成分2.基于固相微萃取-气相色谱-质谱与电子鼻技术分析发酵乳中的挥发性风味物质3.电子鼻结合气相色谱-质谱联用技术分析松茸减压贮藏过程中挥发性风味成分变化4.基于顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法、电子鼻和电子舌技术分析绿茶饮料的风味物质5.溶剂辅助风味蒸发-气相色谱-质谱联用法分析普洱茶干茶与茶汤的挥发性成分因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
液相色谱_串联质谱法鉴定大鼠血浆中的东莨菪碱及其代谢物_陈怀侠
液相色谱-串联质谱法鉴定大鼠血浆中的东莨菪碱及其代谢物陈怀侠1,2 杜鹏1 韩凤梅1 陈勇*11(湖北大学中药生物技术省重点实验室,武汉430062) 2(武汉大学化学与分子科学学院,武汉430072)摘 要 建立了鉴别东莨菪碱及其代谢物的液相色谱-电喷雾离子阱串联质谱(LC -M S n )联用方法。
取单剂量灌胃50m g /kg 东莨菪碱的大鼠血样,甲醇沉淀蛋白,采用LC -M S 及LC -M S n 等方法分析血样。
和空白血样及东莨菪碱相比较,根据血样中代谢物分子量的变化(ΔM )及其多级质谱数据,鉴定并阐述其结构。
结果在服药后的大鼠血样中发现7种代谢物,分别为莨菪品、N -去甲基莨菪品、脱水东莨菪碱,N -去甲基脱水东莨菪碱、N -去甲基东莨菪碱、氧化东莨菪碱以及托品酸等。
该方法灵敏,快速,简便,适合于药物及其代谢物的快速鉴定。
关键词 东莨菪碱,液相色谱-串联质谱法,代谢物 2005-08-16收稿;2005-11-20接受本文系湖北省杰出青年基金(No .2002AC004)和湖北省中药生物技术重点实验室开放基金(No .2004CTM 001)资助项目1 引 言药物代谢研究对于人们认识药物体内作用规律,指导临床合理用药以及新药设计具有重要的意义[1]。
LC -M S n 联用技术是现今对药物代谢研究的最有力的工具[2～4]。
该方法具有灵敏度高,专属性好,样品处理简单,快速等特点,特别是多级质谱能够提供丰富的化合物的结构信息。
因此,该联用技术成为代谢物结构分析的首选方法之一。
东莨菪碱(Scopo la m i n e )是从茄科植物颠茄(A tropa bell a donna L .)、曼佗罗(D atura S tramonium L .)及莨菪(Hyosyam us niger L .)等分离提取的一种托品烷类生物碱,有着广泛的药理活性,如解痉、麻醉、止痛等[5],主要用于治疗暴发性肝炎、流行性乙型脑炎、支气管哮喘、重症新生儿窒息、肺性脑病等[6],随着药理研究的进展,其用途越来越广。
气相色谱-质谱联用法测定小鼠血清非胆固醇甾醇
遵
义 医 学
院 学 报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｚｕ ｎ ｙ ｉ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
ＶＯ １ ． ３ ９ Ｎｏ． ６ Ｄｅ ｃ ．２ ０１ ６
气 相 色谱 一质 谱 联 用 法测 定 小 鼠血 清 非胆 固醇 甾醇
杜红岩 ， 周嘉南 ， 潘 峰 ， 杨 华 ， 闫振成 ， 倪银星 ， 祝之 明 ， 钟 健
（ １ ． 第三军医大学大坪 医 院野 战外科 研 究所 高血压 内分 泌科 ， 全军 高 血压 代谢 病 中心 ， 重庆 市 高血 压 研究 所 ， 重 庆
４ ０ ０ ０ ４ ２ ； ２ ． 第三军医大学科研部 生物医学分析测试中心 ， 重庆 ４ ０ ０ ０ ３ ８ ）
（ ｅ ａ ｍ ｐ ｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｏ １ ） 、 豆甾醇（ ｓ ｔ ｉ ｇ ｍ ａ ｓ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ） 和 Ｂ一谷 甾醇 （ ｐ—ｓ ｉ ｔ ｏ ｓ ｔ ｅ ｒ ｏ １ ） 的含量 依次 为（ ４ ． ５ ２ ４ － ０ ． ９ ４ 、 １ ． ７ １±１ ． ５ ７ 、 ２ ２ ． １ ７± ９ ． ８ ６ 、 ０ ．
结论 Ｇ Ｃ—ＭＳ法具 有检测速度快 、 结果准确 、 精密性 高和重复性好 的优点 ， 可用于实验小鼠血清非胆固醇 甾醇的检测 ， 为深
入研究 实验 动物胆 固醇合成和吸收 的机制提供研究手段 ห้องสมุดไป่ตู้
［ 关键词 ］气相 色谱 ； 质谱 ； 非胆 固醇 甾醇 ［ 中图法分类号］Ｒ ５ ８ ９ ． ２ ［ 文献标志码 ］Ａ ［ 文章 编号］１ ０ ０ ０ － ２ ７ １ ５ （ ２ ０ １ ６ ） ０ ６ － ０ ６ １ ７ ０ － ６
气相色谱质谱联用法检测大鼠尿液中2C-B及其代谢物
气相色谱质谱联用法检测大鼠尿液中2C-B及其代谢物黄克建;潘智文;李宏森;林翠梧;刘晓锋;罗正坚;李璐;陈而廉【期刊名称】《中国法医学杂志》【年(卷),期】2009(024)001【摘要】目的研究4-溴-2,5-二甲氧基苯乙胺(2C-B)在大鼠体内的代谢物以及代谢途径.方法取 Wistar大鼠3只,以2C-B灌胃,收集24h内尿液,用β葡萄糖醛酸酶水解,Oasis HLB柱固相提取,DB-35MS柱分析,气相色谱质谱联用检测.结果从大鼠尿液中检出6种2C-B的代谢产物,分别为:4-溴-2-羟基-5-甲氧基苯乙醇、4-溴-2,5-二甲氧基苯乙醇、4-溴-2-羟基-5-甲氧基苯乙酸、4-溴-2,5-二甲氧基苯乙酸、1-乙酰氨基-2-(4-溴-5-羟基-2-甲氧基苯)乙烷和1-乙酰氨基-2-(4-溴-2-羟基-5-甲氧基苯)乙烷.未检出2C-B原药.结论 2C-B在大鼠尿液中主要以代谢物形式存在,其在大鼠体内至少存在两种代谢途径:第一种是2C-B的2位和5位氧上去甲基后氨基被乙酰化;第二种是2C-B去氨基生成醛,接着被还原或氧化生成醇和羧酸.【总页数】4页(P8-11)【作者】黄克建;潘智文;李宏森;林翠梧;刘晓锋;罗正坚;李璐;陈而廉【作者单位】广西壮族自治区公安厅物证鉴定中心,广西,南宁,530012;广西大学化学化工学院,广西,南宁,530004;广西壮族自治区公安厅物证鉴定中心,广西,南宁,530012;广西大学化学化工学院,广西,南宁,530004;广西壮族自治区公安厅物证鉴定中心,广西,南宁,530012;广西壮族自治区公安厅物证鉴定中心,广西,南宁,530012;广西壮族自治区公安厅物证鉴定中心,广西,南宁,530012;广西壮族自治区公安厅科技处,广西,南宁,530012【正文语种】中文【中图分类】D9【相关文献】1.大鼠尿液中γ辐射损伤特征代谢物 [J], 张慧芳;党旭红;邢利虹;郭月凤2.大鼠尿液与血液中海洛因4种代谢物的检测时限研究 [J], 王璐莹;倪春芳;姜凤丽;徐智儒;汪蓉;张玉荣3.雷公藤配伍甘草减毒大鼠体内尿液中的小分子代谢物以及相应生物代谢通路 [J], 王焕君; 马致洁; 董捷鸣; 吴昊; 于小红; 段晓颖4.长春西汀在大鼠尿液中的代谢物研究 [J], 唐蕾;艾超5.气相色谱-质谱法分析乳腺癌大鼠尿液中的代谢物 [J], 方梦婵;鄢爱平;万益群因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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基于气相色谱―质谱技术的小青龙汤证大鼠血液代谢组学研究摘要：目的采用气相色谱-质谱法（GC-MS）测定小青龙汤证大鼠血液中内源性代谢物，为小青龙汤证本质研究提供依据。
方法将36只雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组10只、模型组13只和小青龙汤组13只，模型组和小青龙汤组制作外寒内饮（小青龙汤证）模型，小青龙汤组灌胃小青龙汤，空白对照组不作任何处理。
15 d后，3组大鼠腹主动脉取血，进行GC-MS检测。
图谱经预处理后采用偏最小二乘法-判别分析进行多元统计分析。
结果发现13种小分子标志物，分别为乳酸、3-羟基丁酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸、葡萄糖、花生四烯酸等代谢物质。
结论乳酸、甘氨酸等标记物集中表现为能量代谢、免疫功能和炎症反应，为小青龙汤证本质研究提供了物质基础。
关键词：气相色谱-质谱；血液；小青龙汤证；大鼠DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.04.023中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）04-0083-04Metabonomics Study on Blood of Rats with Xiaoqinglong Decoction Syndrome Based on GC-MS ZHAO Xiao-hua1，HELi-qing1，GAI Jiang-hua2 （1.Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China；2.Changzhi Chinese Medicine Hospital，Changzhi 046000，China）Abstract：Objective To determine the endogenous metabolites in blood of rats with Xiaoqinglong Decoction Syndrome by using GC-MS；To provide evidence for researches on the essence of Xiaoqinglong Decoction Syndrome. Methods Totally 36 male Wistar rats were randomly divided into blank control group （10 rats），model group （13 rats），and Xiaoqinglong Decoction group （13 rats）. Model group and Xiaoqinglong Decoction group were used to make the models of exogenous cold and internal fluid syndrome （Xiaoqinglong Decoction Syndrome）. Rats in Xiaoqinglong Decoction group received gavage with Xiaoqinglong Decoction，while rats in blank control group received nothing. Blood of rats in the three groups was taken from the abdominal aorta and detected byGC-MS 15 days later，and analyzed by multivariate statistical analysis with PLS-DA. Results 13 kinds of biomarkers were found：lactic acid，3-hydroxy-butyric acid，glycine，serine，lysine，dextrose，arachidonic acid and other metabolites. Conclusion Expressions of biomarkers，such as lactic acid and glycine，are energy metabolism，immune function，andinflammation，which provide material basis for researches on the essence of Xiaoqinglong Decoction Syndrome.Key words：GC-MS；blood；Xiaoqinglong Decoction Syndrome；rats小青龙汤首见于《伤寒论?辨太阳病脉证并治》“伤寒表不解，心下有水气，干呕，发热而咳，或渴，或利，或噎，或小便不利，少腹满，或喘者，小青龙汤主之”。
全方共8味药，是张仲景治疗外寒内饮证的名方。
基金项目：国家自然科学基金（81102538）；山西中医学院临床基础项目（2011JC05）通讯作者：何丽清，E-mail：hlqyx@小青龙汤证为外感风寒表邪、内有水饮之气、内外合邪而表现出的适合服用小青龙汤的症状，其临床表现较多，其中咳嗽、痰多、喘息为小青龙汤证辨证关键。
尽管对小青龙汤已有较多研究，但对其证本质研究仍有不足。
目前，气相色谱-质谱（GC-MS）技术较为成熟地运用于中医证候客观化研究，且在证候动物模型证本质研究中取得一定进展，代谢组学与生理学的联系更加紧密[1-2]。
本研究采用GC-MS 测定大鼠血液中内源性代谢物，为小青龙证证本质研究提供基础。
1 仪器、试药与动物气相色谱-质谱联用仪（Trace GC-PolarisQ Mass，Thermo Finnigan），DZF-1B型真空干燥箱（上海跃进医疗医械厂），TGL-6高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机有限公司），KQ2200型数控超声仪（昆山超声仪器有限公司），ESJ120-4电子天平（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）。
N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺[MSTFA，含1%TMCS （三甲基氯硅烷）]，美国Thermo pierce公司；吡啶、甲氧胺盐酸盐、正庚烷、乙腈均为分析纯，北京化工试剂公司；二十四烷，上海索莱宝生物科技有限公司。
内标液：精密称取1 mg二十四烷，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，即得0.1 mg/mL二十四烷内标工作液。
Wistar大鼠，雄性，体质量（200±10）g，清洁级，中国医学科学院中国协和医科大学动物研究所提供，合格证号SCXK（京）2009-2004。
2 方法2.1 动物分组、造模与取样将36只Wistar大鼠随机分为空白对照组10只、模型组13只和小青龙汤组13只，饲养于普通级动物房。
依据外感风寒表邪、内有水饮之气，内外合邪病机制作外寒内饮（小青龙汤证）模型：将模型组和小青龙汤组大鼠放置于寒冷环境（控制室内温度在10 ℃左右）中喂养，每日在低温环境[（0±4）℃]冷冻1 h，并放入冰水中游泳，水面淹没大鼠鼻尖时将大鼠捞出，持续4周，同时进寒凉饮食（冷冻饲料及冰水）。
空白对照组不做任何处理。
小青龙汤组大鼠给予小青龙汤（麻黄9 g，白芍9 g，细辛3 g，干姜3 g，炙甘草9 g，桂枝9 g，五味子9 g，姜半夏9 g，山西中医学院第二附属医院药房提供）灌胃，连续15 d。
将3组大鼠麻醉后腹主动脉取血，存放在-80 ℃冰箱中[4]。
2.2 生物样品制备从-80 ℃冰箱中取出血液，解冻，摇匀，取上清液100 ?L，加入250 ?L乙腈，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液150 ?L，氮气吹干，加入30 ?L甲氧胺（15 mg/mL）吡啶溶液，70 ℃反应1 h。
加入50 ?L MSTFA，40 ℃反应90 min。
加入500 ?L正庚烷（0.1 mg/mL二十四烷），涡旋1 min，进行GC-MS分析。
2.3 气相色谱-质谱条件进样量：1 ?L；进样口温度：260 ℃；离子源温度：200 ℃；载气：氦气；载气流速：1 mL/min；DB-5MS毛细管柱；不分流进样。
质谱检测条件：电离方式EI，电子能量70 eV，全扫描模式，50～650 m/z。
程序升温：起始温度60 ℃，保持2 min，以7 ℃/min升至140 ℃，以5 ℃/min升至180 ℃，保持6 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持2 min。
2.4 模式识别分析与统计方法运用SIMCA-P+软件进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）和建立模型，采用SPSS17.0统计软件对截荷图远端标记物进行分析。
数据以―x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用方差分析。
P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果3.1 血液样品测定结果3组血液样品GC-MS测定所得色谱图见图1。
各色谱峰分布均匀，峰形较好，且得到很好的分离，模型组和空白对照组直观可见较多差异峰，如15.11、15.80、27.67、33.17、41.25。
说明大鼠造模后体内代谢物发生了明显变化。
3.2 多元统计分析分别对空白对照组与模型组、小青龙组与空白对照组血液样本GC-MS数据进行分析，PLS-DA分析结果见图2。
从散点图可以看出，空白对照、模型组分布在t[1]轴两侧，直观反映了空白对照组与模型组之间有差别，说明造模之后机体的代谢物发生了变化。
小青龙汤组接近空白对照组，反映了模型大鼠在服用小青龙汤之后，代谢物明显接近空白对照组。
结合载荷图、典型的血液图谱及SPSS软件分析结果得到这些生物标志物：乳酸、甘氨酸、丁二酸、丝氨酸、赖氨酸、缬氨酸、吡喃半乳糖苷、山梨醇、葡萄糖、花生四烯酸等。
以上这些代谢物在用药后发生明显变化。
从3组载荷图结合VIP值（variable importance in the projection，变量重要性投影，可以预测各个数据对模型的贡献值，VIP>1的意义在于可能为潜在标志物）寻找导致其分开的差异性成分，即小分子标志物，结果共找到13个标志物，见表1。
采用SPSS17.0统计软件对13个标志物进行t 检验，部分结果见表2。
4 讨论由于GC-MS在具有诸多优点同时，也有不能分析大分子、难挥发性和热不稳定性物质的缺点，所以，在处理血液样本同时需要对样本进行衍生化处理。
三甲基硅烷（TMS）衍生化在样本硅烷化处理的基础上进行GC-MS检测，结合PLS-DA有监督的模式识别方法，能够对样本进行较好的分析，有利于寻找内源性代谢物的小分子标记物。
所以参考文献[5-7]，本试验选择TMS衍生化试剂对血样进行处理。