分子生物学-11-1-第五章基因克隆技术
基因克隆(包括DNA提取技术步骤)
基因克隆DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA 连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。
一 DNA的提取二目的DNA片段的获得（酶切）三体外重组1 LB培养基的配制2大肠杆菌感受态细胞的制备3载体的选择四导入受体细胞五重组子的筛选1插入失活法实验一DNA提取取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液：1 准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织放入离心管，破碎。
（常温操作）2 恒温箱裂解，55℃。
30min。
3 加等体积Tris饱和酚(酚：氯仿：异戊醇25：24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
（注意酚在油层下面）4 取上清（把枪头去掉部分，注意液面。
蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中），加入等体积CI(氯仿：异戊醇24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
5 汇集上清，加2倍无水乙醇(-30度保存)，颠倒混匀可观察到絮状DNA。
在-30度冰箱沉淀30min。
离心4度12000g 10分钟。
6 弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分钟。
7 重复一次上述操作。
7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。
8 溶解于200ulddwater。
9 定量DNA。
裂解液的配制1ml体系200ul 0.5M EDTA（PH=8.0高压灭菌。
作用抑制酶的活性。
）螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。
50ul 10%SDS（蛋白质变性剂）10ul 1MTris-cl（PH=8.0高压灭菌）缓冲溶液5ul PK（消化）735ul 灭菌超纯水EDTA（0.5 M，pH8.0）将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O）加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
分子生物学常用技术(二)
分子生物学常用技术（二）引言概述:本文旨在介绍分子生物学中常用的技术，以帮助读者全面了解分子生物学研究的方法和工具。
本文将重点介绍分子生物学常用技术（二），包括基因克隆、PCR、DNA测序、基因编辑和蛋白质表达等。
正文:一、基因克隆1. 酶切与连接：通过使用特定限制酶对DNA进行切割，然后使用DNA连接酶将不同DNA片段连接起来。
2. DNA片段扩增：利用聚合酶链反应（PCR）扩增目标DNA片段，得到大量复制的目标片段。
3. 质粒构建：将目标基因片段插入质粒中，构建重组质粒，然后将其转化到宿主细菌中。
二、PCR1. 反应体系：PCR反应需要引物、模板DNA、琼脂糖等成分，同时需要在适宜的温度条件下进行。
2. 热循环：PCR反应分为三个步骤：变性、退火和延伸。
通过不断重复这三个步骤，可以扩增目标DNA序列。
3. PCR变异：通过引入突变引物或特殊PCR反应体系，可以实现目标片段的定向变异。
三、DNA测序1. Sanger测序：利用DNA聚合酶反应合成，以dideoxynucleotide三磷酸（ddNTP）作为终止子，从而得到带有不同长度的DNA片段，再通过毛细管电泳分离，并借助荧光标记的ddNTP定序碱基。
2. 下一代测序：利用高通量测序平台，如Illumina、Ion Torrent等，可以同时测序大量DNA片段，从而加快和降低测序成本。
3. 新一代测序技术的应用：新一代测序技术广泛应用于基因组测序、转录组测序、甲基化测序等领域。
四、基因编辑1. CRISPR-Cas9系统：通过引入Cas9核酸酶和相应的单导RNA（sgRNA），可以实现对目标基因的精准编辑和改造。
2. CRISPR-Cas9应用：基因敲除、基因敲入、基因修饰和基因变异等应用广泛，可以用于研究基因功能和疾病治疗等领域。
3. CRISPR-Cas9技术的优缺点：CRISPR-Cas9技术具有高效、快速和精准编辑基因的优点，但也存在不确定的副作用，如非特异性剪切和细胞毒性等。
基因克隆技术的原理与方法
基因克隆技术的原理与方法在人类历史上，基因一直是科学家们探究的热点之一。
随着科技的不断发展，基因克隆技术逐渐被应用于生物医学和生命科学领域，成为这个领域的重要组成部分。
那么，基因克隆技术的原理和具体方法是什么呢？基因克隆技术的原理基因克隆技术是指通过分子生物学技术，将特定的DNA序列复制并扩增，最终得到大量相同的DNA片段的过程。
在这个过程中，使用的主要技术是PCR和DNA重组技术。
PCR（聚合酶链式反应）是一种将小段DNA片段扩增为大量DNA的技术。
它是一种非常高效的DNA复制方法，经过多次扩增可以得到数百万、数千万甚至数十亿倍的DNA。
DNA重组技术是一种将两个不同种类DNA片段组合成一个新的DNA分子的方法。
这个过程通常包括三个步骤：1）通过限制性内切酶切割DNA，得到特定的DNA片段；2）将这些DNA片段与载体DNA序列进行融合；3）通过转化或转染等方法将重组后的DNA引入宿主细胞中，让它开始复制。
利用PCR和DNA重组技术，科学家们可以快速扩增任何一种特定的DNA序列，或者将不同DNA序列进行组合重组，从而高效地制造出人工合成的DNA序列。
同时，这些技术还可实现基因靶向分析、疾病诊断、基因治疗等多种应用。
基因克隆技术的方法通过PCR和DNA重组技术，科学家们可以使用多种不同的方法实现基因克隆。
下面我们就来介绍一些常用的基因克隆方法。
1. 基本的基因克隆方法这种克隆方法包括PCR扩增和限制性内切酶切割，并且可以使用装载体如质粒或病毒来转化宿主细胞。
这种克隆方法常用于基因分析、疾病诊断中。
2. 聚合酶链式反应（PCR）法PCR法是一种基于DNA聚合酶在适当条件下的多次循环扩增DNA片段的技术。
具体步骤如下：将DNA分子用特定的引物扩增引导器识别特定的DNA，然后将扩增反应放到恒温器中进行放大，每循环一次会将扩增的DNA片段分裂成两条链，出现两个新的单链DNA前体，从而实现了DNA聚合。
3. 环状扩增法环状扩增法适用于小片段DNA的克隆，其具体步骤是：用引物识别特定的DNA，然后使用聚合酶以及低成本的环形引物扩增DNA片段。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术分子生物学实验技术是分子生物学研究领域中使用的一系列实验技术的总称，它们主要用于分析和操作生物体内分子水平的结构和功能。
这些技术的发展与进步，在分子生物学研究中具有重要意义，为科学家们提供了更加高效、准确和精细的实验方法和手段。
本文将着重介绍分子生物学实验技术的一些常用方法和原理。
一、聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种通过DNA扩增技术在体外合成目标DNA的方法。
它通过引物与待扩增DNA片段的互补配对，在DNA复制酶（如Taq聚合酶）的催化下，经过一系列的温度循环（包括解链、退火和扩增）反复进行，从而使得目标DNA不断扩增，达到检测和分析的目的。
PCR技术广泛应用于基因检测、疾病诊断、犯罪分析等领域。
二、DNA测序技术DNA测序是指通过测定DNA的碱基序列，以获取基因信息的一种手段。
传统的DNA测序技术包括Sanger测序和Maxam-Gilbert测序。
随着高通量测序技术（NGS）的发展，如Illumina测序、Ion Torrent测序等，使得大规模、快速、低成本的DNA测序成为可能。
DNA测序技术在基因组学和遗传学研究中扮演着关键角色。
三、蛋白质分析技术蛋白质是生物体内功能最为重要的分子之一，研究蛋白质的组成、结构和功能对于理解生物体的生理过程具有重要的意义。
蛋白质分析技术主要包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western Blotting、质谱分析等。
SDS-PAGE凝胶电泳可用于蛋白质的分子量测定和纯化，Western Blotting则可以用来检测特定蛋白质的存在及其相对量，质谱分析则可以用来确定蛋白质的氨基酸序列。
四、基因克隆技术基因克隆是指将DNA片段插入到载体DNA（如质粒）中，并利用细胞的自我复制机制，将其复制并表达出来的技术。
这个技术广泛应用于基因工程、药物研发、植物育种等领域。
基因克隆技术的核心是DNA片段的连接和转化。
连接可通过限制性内切酶切割DNA片段，并使用DNA连接酶进行连接；转化则是将重组质粒转入宿主细胞中，使其进行复制和表达。
生物基因工程核心技术
生物基因工程核心技术生物基因工程是一门利用分子生物学和遗传学知识来改变生物体遗传物质的科学技术。
它可以通过对基因进行修改和调控，实现对生物体特性和功能的精确控制。
生物基因工程的核心技术有许多，下面将逐一介绍。
1. 基因克隆技术基因克隆技术是生物基因工程的关键技术之一。
它允许从一个生物体中精确地分离出一个特定的基因，并在实验室中进行大量复制。
基因克隆技术包括DNA提取、限制性内切酶切割、DNA连接、转化等步骤。
通过基因克隆技术，科学家可以大规模制备目标基因，用于后续的研究和应用。
2. 基因测序技术基因测序技术是生物基因工程的另一个核心技术。
它用于确定DNA序列中碱基的顺序，并获得生物体基因组的完整信息。
目前，常用的基因测序技术包括Sanger测序和高通量测序。
这些技术的发展使科学家能够更深入地研究基因组结构和功能，进一步理解生物体的遗传机制。
3. 基因编辑技术基因编辑技术是指通过改变生物体自身的DNA序列，来实现对基因型和表型的精确控制。
CRISPR-Cas9系统是目前最常用的基因编辑技术之一。
它利用Cas9蛋白和RNA引导序列，可以精确地切割DNA，进而实现基因的修改、插入和删除。
基因编辑技术在农业、医学和生物学研究领域有着广泛的应用前景。
4. 基因转导技术基因转导技术是指将外源基因导入到目标细胞或生物体中的技术。
这些外源基因可以来自同种或不同种的生物。
常用的基因转导技术包括病毒载体介导的基因转导和非病毒载体介导的基因转导。
通过基因转导技术，科学家可以向生物体中引入新的基因，从而赋予其新的功能或特性。
5. 基因表达技术基因表达技术是指将目标基因在宿主细胞中转录和翻译成蛋白质的技术。
常用的基因表达技术包括原核表达系统和真核表达系统。
通过基因表达技术，科学家可以大规模制备目标蛋白质，用于生物学研究、药物研发和工业生产等领域。
综上所述，生物基因工程的核心技术涵盖了基因克隆、基因测序、基因编辑、基因转导和基因表达等方面。
基因克隆与表达及功能鉴定研究
基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。
本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。
一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。
基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。
1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。
限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。
DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。
DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。
2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。
RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。
PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。
原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
生物工程知识：快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆
生物工程知识：快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆随着生物技术的不断发展，分子生物学技术成为现代生命科学研究中的重要工具之一，通过对生物分子的研究，人们可以深入了解生命体的组成和运作方式，为解决人类和社会面临的诸多问题提供依据和解决途径。
其中，DNA序列分析和基因克隆是现代生命科学研究中最为基础和重要的研究方法之一。
而为了加速DNA序列分析和基因克隆，快速克隆技术应运而生。
快速克隆技术是一类利用高效的DNA重组技术将外源DNA序列导入宿主细胞，并产生可重现、高效、无需寻找突变位点的定向克隆方法。
它不仅缩短了基因克隆的时间，而且方便了对DNA序列的修饰。
快速克隆技术的主要优势在于，可以直接对目标DNA序列进行点突变、插入、删减等修饰，从而实现对基因功能的探究，为分子生物学研究提供有力手段。
快速克隆技术主要包括克隆扩增和重组克隆两种方法。
克隆扩增是一种在PCR反应中同时进行克隆扩增和定向作用的技术，通过使用末端限制性核酸内切酶和pCR®4-TOPO®克隆载体，可以实现PCR产物的快速克隆扩增。
重组克隆则利用了DNA重组酶的高效作用，在宿主细胞内完成DNA重组反应，将目标DNA序列在不损失信息的情况下导入到载体中，从而实现快速、准确、方便的基因克隆。
在快速克隆技术的应用中，需要注意一些技术要点。
首先，对于目标DNA序列的选择需要仔细考虑，得到的DNA序列必须保持完整性，并且没有任何突变；其次，在重组克隆中，DNA重组反应必须充分进行，可以通过调节DNA浓度、DNA重组酶的用量和反应时间等因素来达到最佳反应效果；此外，对于载体的选择也非常重要，通常会选择T/A克隆载体，如pCR®4-TOPO®克隆载体，在克隆扩增反应中具有很好的适用性，而在重组克隆中，较常用的载体有pET-28a，pGEX等。
使用快速克隆技术进行基因克隆，需要进行单克隆鉴定。
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当作动词是指运用DNA重组技术将一个特定的基因或DNA序列输入一个载体分子；也指分离出单个分子、基因或细胞后使之增殖成一个群体，当然也包括复制个体的一系列实验操作。
在分子生物学中特指基因克隆（gene cloning）
指的是从基因组中把某个基因分离出来，再把它重组在合适的载体上，使之增殖成许多拷贝的过程。
但是已知的基因与未知基因存在连锁关系的并不多,所以连锁分析对克隆大多数基因存在着一定的困难。
RFLP等分子标记的出现使多态性基因标记存在于整个基因组内,解决了连锁分析中难以克服的困难。
寻找连锁基因就转变成了寻找连锁标记。
2、要有合适的与目的基因紧密连锁的分子标记做筛库的从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。
首要条件：
至少获得mRNA的23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（gene specific primer，GSP）
克隆目标cDNA全长3种情况，3种策略
已知序列的来源
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。
异常功能蛋白质
根据氨基酸序列推导DN的编码基因
产物序列未知基因的功能克隆方法
（适用于功能已知、产物未知的基因）
mRNA差异展示（mRNA differential display,DDRT-PCR）
代表性差示分析（representational difference analysis,RDA）
基因定位克隆步骤（map-based cloning）
(用于分离其编码产物未知的基因，理论上任何一个有突变的基因都可以通过这种方法克隆出来)
（1）根据突变通过家系分析等将基因定位在染色体上，并在目的基因两侧确定一对紧密连锁的分子标记（RFLP等）；
（2）利用这对分子标记作探针，通过染色体步移(chromosome walking)技术或者染色体显微切割技术将位于这两个分子标记之间的含有目的基因的基因组片段克隆并分离出来；
原理1：利用差，
原理3：利用PCR的指数扩增，筛选差异基因
cDNA差示分析法克隆基因-RDA
RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。
这里面含有几层意思：
1、要知道这个基因的序列如何；
2、要搞清楚这个基因位于基因组那条染色体上，位置关系如何；
3、要把这个基因的序列放置在某种载体分子上以便能够获得它的多个拷贝。
5.5 基因克隆（gene cloning）
指的是从基因组中把某个基因分离出来，再把它重组在合适的载体上，使之增殖成许多拷贝的过程。
5.3.3 Gateway大规模克隆技术（了解）
说明：gateway并不是上述克隆基因的技术，而只是一种大规模将目的基因从克隆载体转向表达载体的方法
两步完成：
TOPO反应：PCR产物连入Entry载体
LR反应：PCR产物从Entry载体重组入表达载体
5.5.4基因的图位克隆
（map-based cloning or Positional cloning）
第四个注释应该是“oligo dG”
基因克隆的一般策略
1已知序列基因的克隆
概述：
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。
现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accessionnumber),以便别人参考和查询
抑制性差减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）
差异消减展示（differential subtraction display,DSD）
5.5.1 RACE技术
(rapid-amplification of cDNA ends)
5’ RACE
3’ RACE
5’ RACE(通常用于已知3’求5’)
1利用已知基因片段，设计基因特异的引物GSP1，在反转录酶的作用下，合成cDNA第一链；
2用RNAase H降解杂合链中的mRNA，
3末端转移酶在第一链cDNA3’端增加oligodC，
4针对oligodC设计锚定引物，以第一链cDNA为模板扩增出5‘端
3’RACE(通常中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。
2 表型或功能克隆
1、定义
表型克隆（phenotypic cloning）或者称为功能克隆（functional cloning）、差异基因克隆。
细胞、个体的过程。
名词，通过上述操作获得的遗传上与祖先相
组成完全相同的分子、细胞或个体组成的一个群体。例如，
DNA分子克隆或基因克隆是指核苷酸序列相同的一群DNA分子或基因拷贝；
细胞克隆则是来源于同一祖细胞的、基因型完全相同的一群子细胞；
从功能出发，利用特定组织细胞器官与正常组织细胞器官DNA或RNA水平上的差异，进行相关基因的分离与克隆，这些基因表达变化是与可检测的表型变化直接联系的，故称为表型克隆，这些表型变化又是与某种生理功能紧密相关的，所以又称为功能克隆。
产物已知基因的功能克隆方法
（适用于产物和功能已知的基因）
寻找表型异常
找出导致表型异常的
(3)Swissport和TREMBL,
Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。
目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。
先构建起点RFLP标记克隆的限制图，并把其中最靠近目的基因的限制片段亚克隆出来。此限制片段经放射性同之为一步克隆）。重复进行上述的各个步骤。构建一步克隆的限制图，亚克隆其中最靠近目的基因的限制片段，该片段经放射性之为二步克隆）。如此重复进行多次，每得到一个新的克隆都更接近目的基因一步，直至最后获得了目的基因的克隆。由于这种技术是通过逐一克隆来自染色体基因组DNA的彼此重叠的序列，而慢慢靠近目的基因，因此形象地称之为染色体步移（chromosome walking）。
目前,世界上主要的基因库有:
(1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为/ebi-home.html;
(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为/web/search/index.html;
classic RACE
The SMART RACE: Switching Mechanism At 5' end of RNA Transcript.
The Takala RACE
经典的RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5′和3′端，包括单边PCR和锚定PCR。
第5章：研究方法-基因克隆
导言：克隆技术
克隆的现代含义
基因克隆
基因克隆策略
基因克隆相关技术
Clone翻译过来克隆
“Clone”起源于希腊文“Klone”，原意：用“嫩枝”或“插条”繁殖。
最初意义无性繁殖
现代意义两个词性、三层含义
动词，通过某种操作比如显微操作、分子生
物学操作来获得与某种祖先相同的分子、
基因克隆（gene cloning）是指某种目的基因的分离过程，通常是从基因组或DNA大片段中分离并获得某一特定的基因或DNA片段，再通过DNA序列扩增形成由众多拷贝组成的DNA拷贝群体的过程。
几层意思：
1、要知道这个基因的序列如何；
2、要搞清楚这个基因位于基因组那条染色体上，位置关系如何；
3、把这个基因的序列放置在某种载体分子上以便能够获得它的多个拷贝
（3）确定含有目的基因的染色体片断，也就是再进一步做出更精细的染色体图谱；
（4）最后在这些片段中进一步筛选目的基因，并作突变检测验证和功能分析（一般是通过遗传互补完成）
染色体步移法图示
Chromosome walking
染色体步移的起点是具有一个与待分离的目的基因尽可能靠近的已经鉴定的分子标记。这种标记可以是RFLP，也可以是已知的基因克隆。
因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群（representation），保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应中两者物质的量比就要求达到1：100或更高，经过2-3次重复，T群体非特异性序列几乎没有偶然逃脱的可能性。
根据遗传连锁分析和染色体步移法，将基因定位分析技术
连锁分析即通过基因与基因之间的重组系数来估计这两者之间的距离,若某种性状的基因与另外一个基因在子代不分离,即有连锁在一起的趋势。根据已知基因的染色体位置来判断未知的连锁基因的染色体位置。
1利用已知基因片段3’末端的polyA，设计锚定引物oligodT（引物3‘端增加两个兼并引物），在反转录酶的作用下，合成cDNA第一链；
2用RNAase H降解杂合链中的mRNA，