稳定表达Caveolin-3基因突变型P104L和P47L的C2C12骨骼肌细胞株的构建

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构建稳定表达小鼠RAE1ε的B16F10细胞株

构建稳定表达小鼠RAE1ε的B16F10细胞株

Dis,2016,26(4):553-560.[28]Chang T1,Streja E,Moradi H.Could high-density lipoproteincholesterol predict increased cardiovascular risk?[J]Curr OpinEndocrinol Diabetes Obes,2017,24(2):140-147.[29]Woudberg NJ,Goedecke JH,Blackhurst D,et al.Associationbetween ethnicity and obesity with high—density lipoprotein (HDL)function and subclass distribution[J].Lipids Health Dis, 2016,15:92-103.(收稿日期:2019-01-22)(本文编辑:卜明)构建稳定表达小鼠RAEI e的B16F10细胞株陈敏华宁晓敏李冬馄钱莉【摘要】目的通过转染及流式细胞术筛选获得稳定表达小鼠RAEIe分子的B16F10细胞株。

方法将本研究团队前期构建的含有小鼠RAEIe基因的真核表达载体通过脂质体法转染B16F10细胞,经流式细胞仪(flow cytometry,FCM)筛选后,建立稳定高表达的B16F10细胞株,将该细胞株与NK细胞共培养后,检测IFN-7的分泌情况。

结果建立了稳定表达RAEIe基因的B16F10细胞株,该细胞株上的RAEIe具有刺激NK细胞高分泌IFN-丫的功能「结论获得了稳定表达RAEIe分子的BI6F10细胞株,为后续研究奠定了物质基础。

【关键词】RAEIe;转染;B16F10细胞[中图分类号JR392.2[文献标识码]A DOl:10.3969/j.issn.1002-1256.2019.07.002Construction of stable B16F10cell line expressing mouse RAEIe CHEN Min-hua.Medical school of Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225001,China.[Abstract]Objective To establish a stable B16F10cell line expressing mouse RAEIe by using transfect and flow cytometry.Methods The plasmid pVITR02-mcs/RAE1e containing RAEIe cDNA was constructed in the previous study.Bl6F10cells were transfected with pVITRO2-mcs/RAEle plasmid(RAEIe transfectant). Stable B16F10-RAE1W transfectants were sorted for high expression of RAEIe by flow cytometry.NK cells were co -cultured with B16F10-mock or B16F10-RAE18cells and then the IFN-*y in cell culture supernatants were assayed using ELISA kits.Results Stable transfected B16F10cell line expressing RAEIe gene was established and NK cells stimulated with B16F10-RAEIe cells expressed high levels of IFN-y compared to NK cells stimulated with B16F10—mock cells.Conclusions The establishment of stable transfected B16F10cell line has provided solid experimental foundation for further studies.[Key words]RAEIe;Transfection;B16F10cell line视黄酸早期转录因子(retinoic acid early transcript1e,RAEIe)是RAE1家族的成员之一,RAE1家族为GP1偶联的细胞膜蛋白,由a、B、Y、6和£五个成员组成⑷。

Caveolin-1蛋白的表达纯化及其与肿瘤的关系研究

Caveolin-1蛋白的表达纯化及其与肿瘤的关系研究

Caveolin-1蛋⽩的表达纯化及其与肿瘤的关系研究细胞窖存在于成纤维细胞、内⽪细胞、I型肺泡上⽪等多种终末分化细胞中,是细胞质膜上直径为50~100nm的烧瓶状微内陷结构,其中Caveolin-1蛋⽩是细胞窖的重要的结构蛋⽩。

有研究认为Caveolin-1参与调控了与肿瘤发⽣、发展、侵袭和转移以及⾎管形成相关因⼦的活性。

进⾏Caveolin-1蛋⽩表达纯化,有利于获得较⾼纯度的蛋⽩,为进⼀步研究其⽣物学活性奠定了基础。

1、Caveolin-1蛋⽩表达纯化研究作为⾃然界⽣命活动的重要参与部分的蛋⽩质,⼏乎都是以复杂的混合形式存在于细胞的各个结构中的。

在不破坏蛋⽩质的空间结构及⼀级结构⽽不影响其⽣理功能的情况下,完全把蛋⽩质分离、纯化出来,均有很⼤的难度。

为了增加蛋⽩样品的纯度和保持样品的活性,需要进⾏蛋⽩分离和蛋⽩纯化,采⽤基因⼯程技术可以进⾏蛋⽩表达纯化研究。

美迪西提供蛋⽩纯化服务,其拥有多种蛋⽩表达协同,包括原核蛋⽩表达系统、酵母蛋⽩表达系统、昆⾍细胞蛋⽩表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋⽩表达系统,具备多种融合技术,可以为客户在蛋⽩表达与纯化⽅⾯提供多种选择。

从⽅案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系,以提⾼⽬的蛋⽩表达⽔平。

有研究者运⽤基因⼯程⽅法制备Caveolin-1重组蛋⽩及其抗体,为研究Caveolin-1的功能奠定基础[1]。

⽅法构建原核表达载体pGEX-5X-1-Caveolin-1,酶切鉴定后,转化⼤肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。

表达产物经SDS-PAGE及Western blot⽅法鉴定基因⽚段的正确性及表达蛋⽩的特异性后,进⾏纯化。

纯化的重组蛋⽩免疫Balb/c⼩⿏3次后,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度。

结果克隆得到的⽬的基因⽚段⼤⼩与预期相符。

重组Caveolin-1蛋⽩相对分⼦质量约为48000,以包涵体形式存在Caveolin-1蛋⽩N端融合GST标签便于纯化及鉴定。

人肺鳞癌组织中Caveolin-1的表达及预后意义

人肺鳞癌组织中Caveolin-1的表达及预后意义

人肺鳞癌组织中Caveolin-1的表达及预后意义马华玲;陈洪雷;朱润庆;郑明军;刘毓玲;范克非;杨为贵【摘要】目的:研究Caveolin-1在人肺鳞癌中的表达,探讨Caveolin-1的表达与人肺鳞癌临床病理特征以及预后的关系.方法:运用免疫组织化学法检测人肺鳞癌组织中Caveolin-1、PCNA的表达,并结合患者的临床病理特征和生存情况进行分析.结果:Caveolin-1在人肺鳞癌中阳性率显著低于正常肺组织(P<0.001);Caveolin-1的表达与肺鳞癌的TNM分期(P=0.018)及淋巴结状态(P=0.006)有关.在人肺鳞癌组织中Caveolin-1与PCNA表达呈正相关(r=0.360,P=0.018).生存分析显示肺鳞癌中Caveolin-1阳性组的生存时间显著低于阴性组(P=0.007),在24例淋巴结未转移组中Caveolin-1阳性组的生存时间显著低于阴性组(P=0.002).多因素Cox分析显示Caveolin-1阳性表达、高临床分期、支气管残端有癌残留的肺鳞癌患者术后生存时间较短.结论:Caveolin-1的表达与肺鳞癌的恶性演进呈正相关;其可促进肺癌细胞的增殖.Caveolin-1可作为评估肺鳞癌患者的不良预后指标.%Objective: This study aims to examine caveolin-1 expression in lung squamous cell carcinoma (LSCC), to investigate the relationship of caveolin-1 expression with clinicopathological features, and to estimate the prognostic value of caveolin-1. Methods:Immunohistochemical staining was used to determine caveolin-1 and PCNA expression in LSCC. The correlation among caveolin-1 ex-pression, pathological features, and clinical outcomes were investigated. Results: The positive rate of caveolin-1 protein was significantly lower in LSCC than in normal lung tissues(P<0.001). Caveolin-1 expression was statistically correlated with the TNM stage (P=0.018) and lymph node metastasis (P=0.006). Caveolin-1expression was also positively correlated with PCNA expression in LSCC (r=0.360; P=0.018). The Kaplan–Meier survival curve showed that patients with positive caveolin-1 expression had a significantly shorter survival time compared with the patients with negative expression (P=0.007). The caveolin-1-positive group had a significantly shorter survival time in 24 patients without lymph node metastasis compared with the negative group (P=0.002). Cox multivariate analysis revealed that patients with caveolin-1 positive expression, high TNM stage, and positive surgical margin had a significantly unfavorable prognosis. Conclusion: Caveolin-1 expression is positively correlated with LSSC development as well as progression, and may promote tumor cell proliferation. Caveolin-1 may be used as a poor prognosis marker of LSCC.【期刊名称】《中国肿瘤临床》【年(卷),期】2013(000)002【总页数】4页(P93-96)【关键词】肺鳞癌;Caveolin-1;预后【作者】马华玲;陈洪雷;朱润庆;郑明军;刘毓玲;范克非;杨为贵【作者单位】武钢总医院病理科武汉市430080;武汉大学医学院病理学教研室;武汉大学医学院病理学教研室;武钢总医院病理科武汉市430080;武钢总医院病理科武汉市430080;武钢总医院病理科武汉市430080;武钢总医院心胸外科【正文语种】中文肺鳞癌占原发性肺癌1/3且有较差的预后,寻找与肺鳞癌预后有关的生物学指标成为研究的热点。

人血脑屏障通透性相关基因Caveolin-1的克隆及其蛋白表达、纯化

人血脑屏障通透性相关基因Caveolin-1的克隆及其蛋白表达、纯化

人血脑屏障通透性相关基因Caveolin-1的克隆及其蛋白表达、纯化招树涛;徐永健;陈浩云【摘要】目的克隆与人血脑屏障通透性相关基因Caveolin-1,并在大肠埃希菌中表达,最后进行蛋白纯化、鉴定.方法根据基因库中收录的Caveolin-1基因序列,设计其上下游引物,经过PCR反应合成Caveolin-1双链,然后与pET28a(+)载体重组,筛选阳性克隆并对DNA序列分析鉴定.将已构建好的重组质粒pET28a-Caveolin-1转入化大肠埃希菌BL21 (DE3),异丙基硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达,表达产物经镍离子亲和层析(Ni2+-NTA)纯化,SDS-PAGE检测和Western blot鉴定.结果PCR扩增的Caveolin-1 DNA片段经鉴定确认为人Caveolin-1基因.经异丙基硫代半乳糖苷诱导的含有pET28a-Caveolin-1重组质粒的DE3菌表达出重组人Caveolin-1融合蛋白.重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得了较高纯度的融合蛋白.结论本研究成功克隆了人血脑屏障通透性相关基因Caveolin-1,并对其进行蛋白表达、纯化,获得了较高纯度融合蛋白,为进一步的相关临床研究奠定了基础.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2018(015)032【总页数】4页(P13-15,23)【关键词】血脑屏障;通透性相关基因;Caveolin-1;克隆;表达;纯化【作者】招树涛;徐永健;陈浩云【作者单位】广州中医药大学金沙洲医院重症医学部,广东广州510168;广州中医药大学金沙洲医院重症医学部,广东广州510168;广州中医药大学金沙洲医院重症医学部,广东广州510168【正文语种】中文【中图分类】R543.5脑梗死患者多死于脑水肿及出血性转化,这与脑缺血组织中血脑屏障的受损密切相关[1]。

Caveolins蛋白是小窝的主要结构成份,与小窝的形态构成及相关功能相关,其家族中包括Caveolin-1、Caveolin-2、Caveolin-3,其中Caveolin-1分布最为广泛,且在不同的组织中表达水平不同[2]。

Caveolin

Caveolin

Caveolin—3基因在疾病中的初步研究作者:马静黄娟娟陈睿来源:《维吾尔医药》2013年第04期摘要:caveolin-3是微囊蛋白(Caveolin,cln)是Caveolae的表面标记蛋白之一,越来越多的发现证明其突变可以引起多种疾病的发生。

关键词:caveolin-3;突变;疾病目前人们对Caveolae的研究越来越热门,不断发现其与疾病的发生有重要联系。

质膜微囊(Caveolae,cle),是细胞表面特异性内陷结构(直径约50~100um),它广泛存在于各种类型的细胞中,比如在内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞等细胞中表达丰富[1]。

微囊蛋白(Caveolin,cln)是Caveolae的表面标记蛋白,主要有Caveolin-1,Caveolin-2和Caveolin-3三种类型组成,其中Caveolin-3(CAV3)是在1996年首次被鉴定的,它主要在骨骼肌、心肌以及平滑肌上大量表达,所以又称为肌质膜微囊蛋白(muscular caveolin) [2]。

1.Caveolin-3(CAV3)蛋白及基因的相关介绍CAV3是由l51个氨基酸组成的蛋白质,其跨膜部分位于中央的33个氨基酸构成,其N 端和C端均游离于胞浆面,其N端有41个氨基酸(61~101)构成Caveolin脚手架区(caveolin scaffolding domain,CSD)部分,它能够与多种信号蛋白上存在的共同特异序列结合。

CAV3和Caveolin-1具有极高的同源性,两者的氨基酸序列有85%相同,CAV3上CDS的氨基酸(55~74)与caveolin-1的CDS相似,主要参与调节质膜微囊G蛋白(G protein guanylate diphosphate,Ga–GDP),Src–酪氨酸激和原癌基因中的H-Ras等多种信号分子[3]。

2.目前Caveolin-3(CAV3)基因突变引起疾病近年来发现CAV3基因变异可能与肌营养不良症、骨骼疾病、心血管疾病等有密切的关系,已经发现的包括:肢带型肌营养不良(limb-girdle muscular dystrophy-1c,LGMD-1c),波纹肌肉瘤(Ripping muscule disease,RMD),远端疾病(distal myopathy,DM),特发性和家族性高CK血症(hyperCKemia ,HCK)和肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)。

Caveolin—3对骨骼肌、心肌伤病的调控机制

Caveolin—3对骨骼肌、心肌伤病的调控机制

Caveolin—3对骨骼肌、心肌伤病的调控机制作者:苏艳红袁乾坤来源:《中国学校体育》2014年第08期摘要:通过介绍Caveolin-3的结构组成以及其对骨骼肌、心肌伤病的调控机制,探讨Caveolin-3的变化所引起的相关信号通路的变化,分析讨论Caveolin-3对骨骼肌萎缩、肥大和心肌伤病的作用机制,从而为运动引起的骨骼肌和心肌改变提供Caveolin-3的作用机制。

结果表明:Caveolin-3的缺失会导致Akt蛋白和p38信号网络的同时衰减从而导致骨骼肌萎缩,通过检测其变化,使得临床中使用TβRI激酶抑制剂(Ki26894)来对抗骨骼肌萎缩成为可能;Caveolin-3的适当上调会激活PI3-kinase/AKT/mTOR通路从而导致肌肉的再生与肥大;通过构建Caveolin-3敲除模型,使得采用siRNA介导基因表达的分子治疗方法治疗骨骼肌病变成为可能;通过重建Caveolin-3表达和激活Akt/eNOS/NO信号,可以减轻心脏舒张期障碍。

结论:Caveolin-3的缺失或上调可导致骨骼肌的萎缩或肥大以及心肌的功能障碍,通过siRNA介导基因表达的分子治疗方法可以治疗运动引起的骨骼肌、心肌的伤病;通过检测Caveolin-3的变化,可以为如何防治运动性骨骼肌、心肌伤病提供依据。

关键词:Caveolin-3;骨骼肌;萎缩;肥大;心肌中图分类号:G804.7 文献标志码:A 文章编号:1004-7662(2014 )08-0072-06Abstract:Through introduction of Caveolin-3 structure and its regulation mechanism on skeletal muscle and myocardial injury, this thesis discusses change of related signal pathways caused by change of Caveolin-3, analyses action mechanism of Caveolin-3 on skeletal muscle atrophy,hypertrophy and myocardial injury, so as to provide action mechanism of Caveolin-3 on skeletal muscle and cardiac muscle change caused by movement. Results show: lack of Caveolin-3 leads to Akt protein and p38 lightning signal network attenuation resulting in skeletal muscle atrophy, by detecting its change made clinical u se of TβRI kinase inhibitors (Ki26894) against skeletal muscle atrophy possible. Appropriate increase of Caveolin-3 will activate PI3-kinase/AKT/mTOR pathway,thus leading to muscle regeneration and hypertrophy. Through construction of Caveolin-3 knockout and activation of Akt/eNOS/NO signal, cardiac diastolic dysfunction can be reduced. Conclusion:lack or higher of Caveolin-3 can lead to skeletal muscle atrophy or hypertrophy and myocardial dysfunction, mediated by siRNA gene expression in molecular therapy can treat movement of skeletal muscle and myocardial injury. Detecting change of Caveolin-3 can provide basis for prevention and treatment of exercise-induced skeletal muscle and cardiac muscle injury.Key words: Caveolin-3; skeletal muscle; atrophy; hypertrophy; cardiac muscle细胞膜上存在一些细胞膜微囊(Caveolae),Caveolin-3是构成微囊的主要成分,是细胞膜上信号传导的枢纽,它的变化会直接影响信号的传导以及骨骼肌和心肌的结构功能。

稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定

稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定

基 因 eN D A片段插入到表达载体 pR SE F I E —G P中, 得到重组 质粒 pR SE F —5 , I E —G Pp 3 并通过 P R、 C 酶切 电泳等 方法进 行质 粒鉴 定; 然后用该重组质粒转化大肠杆菌 B21 I 细胞 , 转化菌落经 P R扩增后 , 提取 的质粒 D A用 脂质体介导 的转染方法 导入 C 将 N U2O 细胞 中 , - S 经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨 肉瘤细胞 系。 结果 成功地构建出包含有野生型 p3c N 5 D A片 段 的重组质粒 pR SE F —5 , I E — G Pp 3 通过 P R、 C 酶切 电泳等方法鉴定质粒大小和位点 均符合实验设 计 ; 将该重组 质粒成 功导人 并 人骨 肉瘤细胞株 U 2O - S细胞 中, 经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞 系, 名为 U2p30 。转染后 的骨 肉 命 一一5 s 瘤 细胞 出现散在 的凋 亡现象 。 结论 利用基因转染技 术 , 立 了稳定 表达外 源性 野生型 p3基因 的人 骨 肉瘤 u2 p30 建 5 一一5 s
tp 3 e o u t e t d i h oe o l t p p 3 e i se s ro a s ii e e e h r p y e p5 g nef r frh r su yng t e r l f wid—y e 5 g ne n o t o a c m u cd g n te a y. M eh d Th lcua to s e mo e lr bo o y tc n l g sus d t n e tt e h m a l —y 53 c il g e h o o y wa e oi s r h u nwid pep DNA rg n n ot e e pr si n v e o RES- t fa me tit h x e so e trpI ・ EGFP o bti i h fro a nngt e

Caveolaecaveolin-1与Wntβ-catenin通路-精选文档

Caveolaecaveolin-1与Wntβ-catenin通路-精选文档

Caveolaecaveolin-1与Wntβ-catenin通路Caveolae(小凹)是一种细胞膜表面特异性的凹陷结构,直径约为50-100nm,外观似囊泡或烧瓶状[1]。

caveolin-1(小凹蛋白)是Caveolae的主要功能蛋白,参与了Caveolae的形成,以及细胞增殖、分化和凋亡的调控,与肿瘤的发生发展有着密切关系。

最近的研究指明Wnt通路的核心分子β-catenin可结合于细胞膜上的Caveolin-1分子,两者相互作用参与体内多种生物学过程,现将其综述如下。

1Caveolae/caveolin-11.1Caveolae/caveolin-1的结构特性Caveolae的构成包括胆固醇、鞘磷脂、糖基鞘磷脂和其主要功能蛋白caveolin等。

caveolin家族至少包括三种亚型:caveolin-1,caveolin-2,caveolin-3。

其中caveolin-1、caveolin-2广泛存在于各种类型的细胞中,而caveolin-3仅在肌肉组织中表达。

Caveolae结构中含有大量受体及信号分子如酪氨酸激酶受体、eNOS、TGF/BMP、FGF和最近研究的热点Wnt 信号系统等。

1.2Caveolae/caveolin-1的生理作用Caveolin-1通过其骨架结构域(CSD)可与Caveolae内许多与细胞增殖分化相关的信号分子结合,使其保持非活性状态,从而抑制多种信号途径的下游激活和转导。

故caveolin-1被认为是信号通道的广泛抑制物,从而抑制细胞的增殖、促进细胞的成熟、分化,影响细胞的凋亡等,维持细胞的稳定。

2Wnt/β-catenin通路2.1WntWnt是一类分泌型糖蛋白,通过自分泌或旁分泌发挥作用。

Wnt作为调控细胞生长、分化和凋亡等各方面的分泌蛋白家族,亦是调节如胚胎发生,形态形成等必需的生物学过程的生长因子大家族。

2.2β-cateninβ-catenin是一种多功能的蛋白质,其主要位于细胞膜,而胞浆中游离量较少。

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稳定表达Caveolin-3基因突变型P104L和P47L的C2C12
骨骼肌细胞株的构建
邓玉风;黄亿元;尚丽娜;杨立会;黄勤
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2016(56)31
【摘要】目的构建稳定表达Caveolin-3(CAV3)基因突变型P104L和P47L的
C2C12骨骼肌细胞株.方法将野生型CAV3(CAV3-WT)、CAV3-P104L、CAV3-P47L装在带有GFP标签的质粒中,构建目的基因与GFP基因融合的表达质粒,以只含GFP的载体为对照.将C2C12细胞随机分为A、B、C、D组,分别转染对照空载体(NC)、CAV3-WT、CAV3-P47L及CAV3-P104L.以遗传霉素(G418)进行阳性克隆筛选,荧光显微镜下挑选稳定转染的细胞系,Western blotting法检测各组细胞中的CAV3-GFP融合蛋白,免疫荧光法检测各组细胞中的CAV3蛋白,以荧光强度代表目的蛋白相对表达量.结果经酶切和测序验证,证实4种表达质粒构建成功.B、C、D组细胞中测得CAV3-GFP融合蛋白,A组未测得融合蛋白.A、B、C、D组CAV3蛋白相对表达量分别为23.0 ±2.25、32.3 ±0.35、25.6±0.92、
24.3±1.42,B组CAV3蛋白表达增强,与A组相比,P<0.01;A、C、D组CAV3蛋白表达下调,与B组相比,P均<0.01.结论成功构建了稳定表达CAV3-P47L和CAV3-P104L的C2C12细胞,两种细胞中CAV3蛋白表达下调.
【总页数】4页(P12-15)
【作者】邓玉风;黄亿元;尚丽娜;杨立会;黄勤
【作者单位】右江民族医学院,广西百色533000;右江民族医学院,广西百色533000;广西医科大学;广西医科大学;广西医科大学
【正文语种】中文
【中图分类】R34
【相关文献】
1.野生型与L10P突变型DJ-1蛋白稳定表达单克隆细胞株的基因表达谱分析 [J], 刘振华;唐北沙;严新翔;郭纪锋
2.过表达N-cadherin基因慢病毒表达载体的构建及稳定细胞株的建立 [J], 李想;秦雪柳;丁梅;曲德伟
3.凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的构建及其稳定表达细胞株的建立 [J], 李士泽;张忠芳;张玉静
4.利用Tet-on诱导基因表达系统构建EID3基因真核表达载体及稳定转染细胞株的建立 [J], 王燕;王宇暄;刘亚敏;张桂强;苏文洲;郭奇峰
5.小鼠PKM1基因慢病毒过表达载体的构建和稳定转染C2C12细胞株的筛选及其对糖酵解的影响 [J], 姜声旺; 沈清武
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