叉尾斗鱼肉瘤病的病理学检测和病原鉴定
鱼类病原微生物的检测方法
鱼类病原微生物的检测方法鱼类病原体的检测方法很多，本文介绍了传统的方法：直接培养法、组织切片观察法；免疫学检测方法：单克隆抗体检测、免疫荧光技术、酶联免疫吸附（ELIST）技术；分子生物学检测技术；PCR（聚合酶链反应）技术、核酸杂交技术。
新的检测方法的应用，为水产养殖病原体检测，以及疾病防治等带来了技术革命，并显示出巨大的潜力。
1 传统检测方法1.1 组织切片观察法选择待检测鱼体病灶处作组织切片，在显微镜下观察，以此检测病原。
一般准确性较差，并且较小的病原体检测困难。
1.2 选择性培养法选择性培养基就是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，其功能是使混合菌样中的劣势菌种变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。
这种培养基是在上世纪末由荷兰的M.W.Beijerinck和俄国的S.N.Vinogradsky发明的。
由于选择性培养基制作费用低，使用方便，因此国外常将其作为日常诊断的主要方法。
例如用EIM培养基可识别斑点叉尾鮰的肠杆菌。
在25℃培养48h，EIM培养基能抑制多数鱼类病原菌、真菌和病毒生长，而使Eictaturi菌落呈绿色，半透明，直径0.5—1.0mm，其它菌落则呈褐色、红色、黄绿色、褐绿色，直径大于2mm。
Rimler-shotts培养基则可用来检测腐皮病病原嗜水气单胞杆菌，37℃培养20-24h 可使嗜水气单胞杆菌菌落呈黄色，其它菌落则呈现另外的颜色。
使用选择性培养基时，温度和时间很重要。
同是使用Rider-shotts培养基37℃和37℃以下培养，检测出呈黄色的菌落分别为嗜水气单胞杆菌和杀鲑气单胞杆菌。
这种方法简单、实用，但培养时间还是过长。
另外它只能粗略检测，不能做到精确，要确切鉴别，还要通过免疫学等的检测方法加以确定。
2 免疫学检测方法2.1 单克隆抗体方法单克隆抗体，是一个抗体产生的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而产生杂交瘤细胞，经无性繁殖的细胞群所产生的。
斗鱼疾病诊断与治疗
斑点叉尾鮰病原中温和气单胞菌的分离鉴定及药敏特性分析
度较 高的 菌落再 纯 化 ， 分 离得 到优 势 菌 １株 ， 将 其 与
Ｄ Ｏ Ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ２ ０ ９ ５—１ ８ ３ ３ ． ２ ０ １ ７ ． ０ ４ ． ０ ０ ７
斑 点 叉 尾 鲴 病 原 中温 和 气 单胞 菌 的分 离鉴 定 及 药 敏 特 性 分 析
杨 移斌 ， ， ｖ ， 胥宁 ， 董靖 ＇ ， 杨秋 红 ， ， 刘永涛 ， 艾 晓辉 ，
摘要 ： 对患 出血病斑点叉尾鲴进行病原分离 、 鉴定及药敏实验 ， 以期为斑 点叉尾鲴 出血 病的 防控 提供 参考 。从患病斑 点叉尾鲴 血水 、 腹水及重要组织器官 中分 离纯化 病原 菌 ， 并 进行 分离 株理化 特性 测定 、 ｇ ｙ ｒ Ｂ序 列分析及 回归感 染实 验， 并通过 Ｋ— Ｂ法进行分离菌株药物敏感性分 析。结果 显示 ， 回归感染实 验鱼 出现 与 自然 发病类似症 状 ， 并 经细 菌
鉴定管 均 购 自杭 州 微 生 物试 剂 有 限公 司 ； Ｐ Ｃ Ｒ 所 用
试剂 、 特异 性引 物及 细 菌基 因组 Ｄ Ｎ Ａ 提 取试 剂 盒 均 购 自生工 生物工 程 （ 上海 ） 股份 有限公 司 。
１ ． ２ 方 法
１ ． ２ ． １ 细 菌分离 纯化 取 体 表严重 出血 的 的斑点叉 尾鲴 数尾 ， 在无 菌环
（ Ｉ ｃ ｔ ａ ｌ ｕ ｒ ｉ ｄ ａ ｅ ） …。 自 １ ９ ８ ４年 由湖 北 水 产 科 研 机 构 引
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材 料
１ ． １ ． １ 实验 用鱼
入 中 国养 殖推 广 ＿ ２ ｊ ， 因其 适 应 中国 养殖 环 境 ， 并 具 有 无肌 间刺 、 肉质鲜美 及 营养 价 值 高 等特 点 ， 迅 速在 国 内掀起 养 殖热 潮 。 目前斑 点 叉 尾 鲴 养 殖 区域 遍 布全
斑点叉尾鮰溃烂症的病原鉴定和致病特性
嗜水气单胞菌(A. hydrophila) X-P4O 15t时，杀鮭气单胞菌X-Gl、X-P2和X-P3的世代时间(约14 min)均小于
嗜水气单胞菌X-P4(^J2O min) ； 25t时，杀鮭气单胞菌X-Gl、X-P2和X-P3株的世代时间(约20 min)均大于
嗜水气单胞菌X-P4株(约16 min) o X-G1株可检到弹性蛋白酶、溶血素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等3种毒力
drophila) ;毒力基因；致病性；药敏试验
中图分类号：S941. 42
文献标识码：A
文章编号：1000^907-(2020)01 £068X)8
斑点叉尾 (Ictalunes punctatus )属鲂形目(Siluriformes)鲍科(Ictaluridae),是世界性养殖的温水 性鱼类。1984年被引入我国后，陆续成为多个省 市的重要养殖品种。随着养殖规模扩大和养殖密度 增加，细菌病对我国斑点叉尾鲍产业的影响日益突 出。目前国内报道的斑点叉尾鲍的细菌病主要有鲍 爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)引起的肠败血症 和裂头症1、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) 引起的败血症并发肠套叠症⑵或败血症⑶或肠套 叠症⑷、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia')引起的肠套叠症⑸、维氏气单胞菌 (A.veronil)引起的败血症同、温和气单胞菌 (4. sobria)引起的出血病⑺等。可见，同一种病 原细菌可能引起斑点叉尾鲍的不同症状或多种症
收稿日期：2019-06-10；修订日期：2019-11-19 资助项目：安徽省重点研究与开发计划(1704gQ7020123)；安徽省现代农业产业技术体系(皖农科[2016] 84号)；定远县现代农业推广 中心专项经费 第一作者简介：许晓牧(1992 -)，男，硕士，主要从事水生动物疾病与渔用保健品研发□ E-mail： xuxiaomu92@ 126. com 通讯作者：彭开松o E-mail： kaisongpeng@
新疆斑点叉尾鮰传染性套肠症防治技术
5 天，并随水温升高病程缩短，发病率在 90%以 使用 TIANanp Bacteria DNA Kit 试剂盒进行病原
上，死亡率多为 100%。
菌 DNA 的提取。使用 TAKARA PCR 试剂盒，运用通
二、临床症状
用引物 27F/1492R(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和
地，2018 年疫情在这些地区均有发生，以昌吉市 甚至溶血，呈紫黑色。部分病鱼可见充血和出血。
最为严重，据昌吉市渔业行政管理部门统计，该
三、病原与病因
市六工镇、滨湖镇、佃坝镇发病水面近 1000 亩 ，
1. 病原检测
直接经济损失达 600 余万元。
2018 年 4 月 30 日，采集昌吉市六工镇、滨湖
基金项目：2019 年国家水生动物疫病监测计划。通信作者：张人铭。
2019.11 45
病 害 防 治 栏目编辑 刘柱军
受“厄尔尼诺”现象影响，2019 年盐城地区 的气候较为异常，到 7 月中旬，水温仍在 28℃左 右 ， 长 时 间 处 于 鳃 出 血 高 发 的 水 温 区 间 (20～ 28℃)，这就导致了上半年盐城主养区域鲫鱼鳃出 血发病情况较往年更为严重。从 4 月初开始到 7 月 下旬为止，各主养区域先后暴发鳃出血，发病程 度也各不相同。有的地区因对鳃出血的发病规律 有了较为全面的了解，发病后通过控料、减少应 激操作等方法，发病损鱼量较少，基本控制在放 养数量的 10%以内，但有的地区因养殖观念差，在 发病高危期间塘口频繁进行进水、杀虫、消毒
1. 行为与体表症状
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT)扩增 16S rDNA；运
发病初期病鱼表现为游动缓慢，靠边或离群 用 FW/RW(FW: TCCGGCGGTCTGCACGGCGT 和 RW: TT-
鱼类疾病的检查方法
1、体表粘液
将鱼放在解剖盘里，首先观察其体色等情况，并注意皮肤是否擦伤或腐烂；是否长 了水霉；有无发炎、充血或出血；鳍条是否蛀烂；有没有锚头鳋、虱等寄生虫以及白色 小点状的小 瓜虫囊泡或白色的粘孢子虫孢囊等。在鱼类体表除肉眼可能见到的病症和病原体外，往 往还有许多肉眼看不到的寄生虫，如口丝虫、隐鞭虫、车轮虫、三代虫等，这些病原必 须用镜检才 能观察清楚，检查方法是用解剖刀或弯头镊子刮取体表粘液，置于载玻片上，加上一、 二滴清水，盖上盖玻片，即可进行镜检。
2、鳃
鳃是特别容易被病原体寄生的器官，粘菌、水霉、鳃霉、各类原生动物、单殖类、 复殖类囊蚴、软体动物的幼虫、甲壳类等，在鳃上都可能找到。第一步，肉眼检查。观 察鳃丝色 泽，粘液的多少，有无充血，发白、肥肿；有无污泥、是否腐烂，鳃盖是否完整；有无 肉眼可见的白色孢囊以及大型的寄生虫等。第二步，检查鳃组织。将左右两边的鳃完整 取出，分开 放在培养皿里，用小剪刀取一小片鳃组织，放在载玻片上，加少量清水，盖上盖玻片， 在镜下检查。取鳃丝检查时，最好从每边鳃的第一片鳃片接近两端的位置剪取一小块， 因为这个地方寄生虫较集中。每边鳃至少要检查两次。鲢、鳙还要检查鳃耙。第三步， 检查鳃上的粘液。将鳃上的粘液刮下，用清水稀释，在镜下观察。
鱼类疾病的检查方法
在渔业生产上， 鱼病的防治是一项基本工作， 它的前提就是鱼病的检查和诊断。 本文简单介绍了在鱼病检查工作中的注意事项、技术手段和检查步骤，以期对业者有所 帮助。
一、检查病鱼应注意的事项
1、供作检查诊断用的鱼，要用活鲜的或刚死不久的，否则会因鱼死过久，病原体 离开鱼体或死亡，从而无法鉴别。同时，有许多病状，在活的或刚死的鱼体上是很明显 的，死了过久的鱼，其组织、器官腐烂变质，原来所表现的病状已无法辨别。
鱼病的检查和诊断鱼病的检查和诊断
鱼病的检查和诊断鱼病的检查和诊断一、现场调查(一)了解鱼出现的各种异常现象鱼生病后，不仅在病鱼体表或体内出现各种病状，同时，在水中也会表现出各种异常现象。
如全身发黑、离群独游；在气候、水温等一切正常的情况下，鱼的摄食量突然急剧下降等。
鱼病发生往往有急性型和慢性型。
急性型鱼病，病鱼一般在体色、外观和体质上与正常鱼差别不大，仅病变部位稍有变化，但一经出现死亡，死亡率急剧上升。
而慢性型鱼病，则往往体质消瘦、活动缓慢、体色发黑、离群独游，死亡率一般呈缓慢上升趋势。
鱼类受到寄生虫侵袭时，往往出现焦躁不安。
如鱼鲺侵袭，鱼的体色等变化不大，但鱼出现上跳下窜，阵性狂游。
当鲢碘泡虫侵袭时，鱼的尾部上翘露出水面，在水中狂游乱窜打圈子。
因水体受到污染（重金属污染）造成鱼类中毒时，鱼会出现跳跃和冲撞现象，一般在较短时间内就转入麻痹甚至死亡。
由寄生虫引起的死亡，一般是缓慢的逐渐增加，除集约化养殖发现指环虫、三代虫的侵袭在短期内造成大批死亡外，家庭水族箱养鱼死亡率一般不会太大；可是若遇鱼类中毒，则往往在极短的时间内，出现大批鱼类死亡，而且不分品种，清道夫等都毫不例外地死亡。
因此，及时观察鱼的活动情况对于鱼病的及时诊断和处理具有至关重要的意义。
(二)了解水质和环境情况水温与鱼病的流行有密切的关系，各种病原体都有其繁育生长的最佳温度范围。
很多致病菌和病毒在平均水温25℃左右时，毒力显著增高，水温降到20℃以下时，则毒力减弱，使病情减弱或停止。
斜管虫适宜在水温12～18C时大量繁殖。
小瓜虫生长和繁殖的水温，一般在15～25C，当水温低于10C以下或高于26℃时，则停止发育。
观察水的颜色，对水质情况也可作一大致了解。
水中腐殖质多时，水呈褐色；水中含钙质多时，呈现天蓝色；微囊藻大量繁殖时，水呈铜绿色；城市排出的生活污水，一般呈黑色；当水源被污染时，因污水种类和性质不同而出现不同的颜色，如红、黑、灰白色等，透明度也会随之大大降低。
水中的溶解氧、硫化氢、ph值、氯化物、硫化物等与鱼病流行的关系极为密切。
鱼病的正确检查和诊断办法
鱼病的正确检查和诊断办法作者：李荣丰来源：《渔业致富指南》 2017年第16期鱼病的种类很多，引起鱼病的原因也很复杂，为了有效地防治鱼病，必须对池塘环境进行调查，同时对疾病进行正确地检查和诊断才能对病下药，这是能否收到效果的关键。
调查和诊断鱼病常用步骤如下：一、现场调查水环境的好坏，对饲养鱼类有直接的影响。
除因病原体、敌害等的感染和侵袭，引起发病和死亡外，还有周围环境以及水体物理、化学性质的恶化对鱼类的影响也是很重要的。
1. 了解病鱼在池中出现的各种异常现象。
鱼病发生的过程，有急性和慢性等类型。
急性型鱼病，病鱼一般在体色、外观和体质上与正常鱼差别不大，仅在病变部位稍有变化，但一旦出现死亡，死亡率随即急剧上升，常在短期内出现死亡高峰。
而慢性型的病鱼则往往体色变黑，体质瘦弱，离群独游，活动缓慢，死亡率一般是缓慢地逐渐地上升，在长时间内死亡高峰不明显。
鱼类受到寄生虫侵袭和刺激，往往出现不安状态，如鱼受到鲺侵袭后，虽体色和体质变化不大，但表现为上窜下跳，不时急剧狂游；受鲢碘虫侵袭的白鲢，尾部上翘，鱼在水中狂游乱窜，抽搐着打圈子；受到鲢中华鳋侵袭的鲢鳙鱼的尾鳍上叶往往露出水面，在水体表层打转或狂游。
当鱼类因农药或工业废水中毒时，也会出现兴奋、跳跃和冲撞现象，而后转入麻痹阶段。
由上述寄生虫引起的死亡，一般是缓慢地逐渐增加，总的死亡率一般不会太大，若是鱼类中毒，则往往在较短的时间内出现大批死亡，各种家鱼、野杂鱼都不例外。
因此，到现场详细了解池鱼种种表现和周围环境情况，是正确诊断鱼病的首要环节。
2 . 了解池水的物理和化学状况。
水温的高低和鱼病的流行有密切关系，大多数的菌毒性鱼病和寄生虫病都是在水温较高的情况下发生，如一些致病菌和病毒在平均水温25℃左右时，毒力显著增高，当水温降到18℃以下时，毒力减弱，流行病逐渐停止。
但也有的寄生虫适宜于在较低水温中生活。
如斜管虫适宜在12~19℃时大量繁殖。
纯净的水是透明无色的，但由于对光线有选择性吸收作用，同时水中有溶解的或悬浮的物质，光线透入水中时，有一部分的光线被吸收了，有一部分被反射出来，便呈现出各种颜色，水中腐殖质多时，水呈蓝褐色，水中含钙质多有机物少时，水呈天青色。
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叉尾斗鱼肉瘤病的病理学检测和病原鉴定刘怡南;彭爽;王虹;陈德芳;贺扬;周毅;耿毅【摘要】为确诊叉尾斗鱼肉瘤病,采集自然患病鱼进行病理学观察,基于淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因采用PCR方法对肉瘤状增生物进行检测和进化树分析.结果显示,患病叉尾斗鱼肉瘤状增生物是由大量囊肿细胞聚集在皮肤和鳍条上形成,鳃、肝、肾、脾、肠等内脏组织器官均未观察到囊肿细胞.囊肿细胞大小为正常细胞大小的57.9～1823.8倍,细胞核不规则,细胞质内可见嗜碱性包涵体;透射电镜观察可见囊肿细胞胞质内存在大量直径约171.5 nm的病毒粒子.病理观察结果符合鱼类淋巴囊肿病毒感染的临床特征,PCR方法检测到1272 bp的目的片段,测序结果显示,该基因与GenBank中的淋巴囊肿病毒K J408271.1序列相似性达99％.试验结果表明,叉尾斗鱼肉瘤病为淋巴囊肿病毒感染所致,皮肤和鳍是病毒感染的靶器官.本研究为叉尾斗鱼肉瘤病临床诊断和预防提供了试验参考.【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2018(037)005【总页数】5页(P679-683)【关键词】叉尾斗鱼;肉瘤病;淋巴囊肿病毒;病理;诊断【作者】刘怡南;彭爽;王虹;陈德芳;贺扬;周毅;耿毅【作者单位】四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学动物科技学院水产系,四川成都611130;四川农业大学动物科技学院水产系,四川成都611130;四川农业大学动物科技学院水产系,四川成都611130;四川农业大学动物医学院,四川成都611130;四川农业大学生命科学学院,四川雅安625014;四川农业大学动物医学院,四川成都611130【正文语种】中文【中图分类】S941.1叉尾斗鱼(Macropodus opercularis)属鲈形目、攀鲈亚目、丝足鲈科，为小型淡水观赏鱼类；其色彩艳丽、体形优美，备受各国观赏鱼爱好者追捧，被誉为“天堂鱼”[1]。
叉尾斗鱼肉瘤病是养殖过程中出现的一种慢性皮肤瘤，主要症状为患病鱼的头部、躯干和鳍条聚集出现成串或成团的白色半透明状囊肿物；该病不会导致鱼类大规模死亡，但会严重影响观赏价值。
1975年澳大利亚学者最早描述了叉尾斗鱼体表出现的“覆盆子样”增生物，报道指出其具有典型的淋巴囊肿细胞结构[2]。
虹彩病毒科的淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus)被认为是鱼类淋巴囊肿病的病原，其可感染全球范围内超过125种硬骨鱼类，引起鱼类浅表组织出现慢性增生性囊肿，疾病给水产养殖业造成巨大经济损失[3]。
在我国，养殖鱼类云纹石斑鱼(Epinehelus moara)[4]和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)[5-6]是淋巴囊肿病毒的易感宿主；2014年Xu等[7]研究证实虹彩病毒科淋巴囊肿病毒也是叉尾斗鱼重要的病原。
2015—2016年四川某观赏鱼店先后多批自广东购进的叉尾斗鱼体表均出现肉瘤状增生物，疑似为淋巴囊肿病毒感染。
为确定病原，笔者收集患肉瘤病病鱼，进行了病理学检测和增生物主要衣壳蛋白基因序列分析，为叉尾斗鱼肉瘤病临床诊断和预防提供基础资料。
1 材料与方法1.1 试验材料患病叉尾斗鱼体长5～10 cm，8～12月龄，购自广东惠州某斗鱼养殖场；DNA 提取试剂盒购自QIAGEN公司；D2000 Marker和DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 病理学观察采用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉患病鱼致死，体表病变观察并剖检，记录病理变化并拍照。
1.3 组织病理学观察采集皮肤、鳃、心、肝、脾、肾、脑和肠组织，室温固定于4%多聚甲醛中，常规石蜡包埋、切片、苏木精—伊红染色，光学显微镜观察增生物形态和组织病理变化，并拍照，Image-Pro Plus 6.0用于细胞大小测定。
1.4 组织透射电镜观察取皮肤体表肉瘤状增生物，固定于2.5%戊二醛，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀—枸橼酸铅双染色透射电镜观察病毒形态，并拍照。
1.5 淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因检测以肉瘤样增生组织中的基因组DNA为模板，利用淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因引物MCP-F(5′-ATGACTTCTGTAGCGGGTTCAAGTG-3′)和MCP-R(5′-CTAAAGTACAGGAAATCCCATTGAAC-3′)进行PCR扩增[7]。
反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 2 min。
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段送上海生物工程有限公司测序。
测序结果在美国国立生物技术信息中心进行BLSAT比对分析，采用Mega 4.1构建进化树。
2 结果2.1 病变观察体表肉瘤状增生物呈白色或灰白色，半透明球形小颗粒状，单个成片或堆积成团，集中分布在患病鱼的背鳍、臀鳍、尾鳍及鳍条基部区域(图1a)。
增生物早期主要散布于鳍条上，逐渐增多堆积成团伴有鳍条充血(图1b)，严重时出现蛀鳍，增生物成片扩散蔓延至体表，鱼体体色明显变淡(图1c)。
解剖观察，鳃丝轻微肿胀，内脏未见明显异常。
2.2 组织病理观察体表肉瘤状增生物是由大量直径约48.7～217.8 μm(n=11)的囊肿细胞聚集形成。
皮肤上大小不等的球形囊肿细胞相互挤压堆积出现在真皮层，囊肿细胞间有大量浸润的炎性细胞和增生的上皮细胞，真皮层中黑素细胞聚集减少，而皮下肌肉组织结构清晰、肌细胞排列整齐无明显病变(图2a)。
鳃丝肿胀增厚，鳃小片呼吸上皮浮离，基底黏液细胞增多，炎性细胞浸润(图2b)。
脾脏出血，白髓区域减小(图2c)。
其他组织器官无明显病变。
图1 体表病变a.对照(上)，鳍条感染(中)，体表感染(下)；b：鳍条充血；c：蛀鳍. 图2 组织病理变化a.皮肤；b：鳃丝；c：脾脏. E: 表皮；D: 真皮；M: 肌肉；PL:鳃丝；Epc: 呼吸上皮；Mc: 黏液细胞；Ⅰ:脾脏出血；Ⅱ:白髓减少.囊肿细胞仅出现在皮肤和鳍条上，在鳃、脾、肠、肝、肾等内脏组织中均未观察到囊肿样异常肥大细胞。
正常细胞直径为5.1～6.4 μm，囊肿细胞大小为正常细胞大小的57.9～1823.8倍(按面积计算)。
典型的囊肿细胞核深染位于细胞一侧，染色质成团聚集；细胞质边缘有大量网状嗜碱性包涵体，细胞膜为均质透明细带状(图3a)；膜外单层毛细血管包裹滋养着感染阶段的囊肿细胞(图3b)，衰老的囊肿细胞缩小，细胞膜均质变厚，破裂，胞内物质降解(图3c)。
2.3 透射电镜观察体表肉瘤状增生物在透射电镜下可观察到大量形态一致的病毒粒子分布于囊肿细胞胞质内，直径约(171.5±1.2) nm，具有衣壳，切面呈六边形对称结构(图4)。
图3 囊肿细胞的显微结构a.典型囊肿细胞；b：感染阶段细胞；c:降解阶段细胞. N:细胞核; I: 胞质包涵体; H: 透明被膜; C: 毛细血管; M: 黑素细胞; IE: 炎症上皮样细胞; D: 降解细胞.图4 透射电子显微镜观察a.17 000×; b:40 000×.2.4 病毒检测及发育树分析以肉瘤状增生物组织提取的基因组DNA为模板，采用通用引物对淋巴囊肿病毒基因主要衣壳蛋白基因进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳观察可见在1000～2000 bp 间出现单一条带(图5)，回收产物测序获得1272 bp的碱基序列，将序列在美国国立生物技术信息中心数据库中进行Blastn比对，其与淋巴囊肿病毒(登陆号KJ408271.1)主要衣壳蛋白的序列相似性达99%。
与19株不同种属的虹彩病毒进行系统发育树构建，结果表明，感染病毒株属于虹彩病毒科中淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)，明显区别于肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)和蛙病毒属(Ranavirus)；其与同为观赏鱼来源的序列KJ4408271.1和AB299163.1聚为一簇，与同为叉尾斗鱼来源的毒株亲缘关系最近(图6)。
图5 PCR扩增结果1.DL2000 Marker; 2:阴性对照; 3、4:增生物样品; 5:DL2000 Marker.图6 基于主要衣壳蛋白基因的系统发育树3 讨论叉尾斗鱼肉瘤病是一种体表慢性皮肤瘤，疾病病程长，虽然死亡率不高，但会使患病鱼丧失观赏价值；随着观赏鱼全球贸易的拓展，以观赏鱼为宿主的病毒性疾病传播对各国疾病诊断和检疫工作提出了新的要求。
本研究对采集的叉尾斗鱼肉瘤病病鱼进行检测，结果显示,体表白色或灰白色、半透明球形颗粒瘤状增生物是由异常肥大的囊肿细胞堆积而成，囊肿细胞是由淋巴囊肿病毒感染所致。
这与报道淋巴囊肿病毒感染形成典型的皮肤浅表增生物相一致[7-8]。
虹彩病毒科分为5个属，其中感染脊椎动物的是蛙病毒属、肿大细胞病毒属和淋巴囊肿病毒属。
病毒主要衣壳蛋白基因被认为是虹彩病毒科内病毒鉴定的理想目的基因。
本试验扩增测序得到1272 bp的主要衣壳蛋白基因片段，在线比对与淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因相似性达99%。
叉尾斗鱼属于脊椎动物硬骨鱼类，早期研究显示，其是虹彩病毒科肿大细胞病毒的易感宿主[9]。
试验系统发育树分析结果显示，感染病毒与肿大细胞病毒明显进化差异，其与淋巴囊肿病毒聚为一簇，且与淋巴囊肿病毒同为斗鱼分离株的KJ408271.1亲缘关系最近，表明叉尾斗鱼肉瘤病病原为淋巴囊肿病毒。
淋巴囊肿病毒广泛分布于天然水体中，是危害鱼类健康的重要病毒性病原之一。
淋巴囊肿病毒与靶细胞膜上受体绑定通过内吞或膜融合方式进入胞内[10]；病毒通过抑制靶细胞凋亡和细胞分裂为病毒复制赢得时间，同时刺激细胞聚变促使靶细胞异常肿大[11]。
淋巴囊肿病毒复制在胞质内形成包涵体，病毒DNA和蛋白质在其内装配完成后，脱离包涵体进入胞质，待细胞裂解后释放到组织中。
本试验观察到在异常肥大的囊肿细胞内有大量的嗜碱性包涵体，电镜显示其胞质内含有装配成熟的六边形病毒粒子。
同时，病毒感染可以上调胶原纤维相关基因表达，在感染细胞表面形成透明被膜[11]。
本试验观察到，在囊肿细胞被膜随着病毒的感染增厚，衰老的囊肿细胞虽然细胞缩小，但有的囊膜明显增厚。
此外，在感染阶段典型的囊肿细胞被膜外包裹有单层毛细血管，细胞与细胞间毛细血管丰富，这些血管支持着肿瘤细胞的新陈代谢。
若在疾病治疗中能有效控制囊肿区域局部血液供应，将为肉瘤病的治疗提供新的方法。
淋巴囊肿病毒最主要的靶器官是体表皮肤下的结缔组织，也可感染鳃、脾、体腔膜、肠和头肾等组织器官，褐牙鲆感染可在鱼体表、鳃、肠壁、肝、头肾、脾中观察到囊肿细胞，而花鲈(Lateolabrax japonicus)则仅在鳃上观察到典型囊肿细胞[12]。
本试验仅在皮肤和鳍条观察到典型囊肿细胞，病变细胞局限在真皮层，其他脏器未见典型囊肿细胞或异常肿大细胞，且叉尾斗鱼脏器病变较易感动物褐牙鲆等的病理变化轻微，表明叉尾斗鱼淋巴囊肿病毒感染局限在体表，皮肤和鳍条是其感染的靶器官。