标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量
实验7 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。
涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。
2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。
在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。
高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英杯测定。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg（20mg）溶于50ml （20ml）95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。
该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：称取25mg牛血清白蛋白，加蒸馏水溶解并定容至100ml，将此溶液稀释2.5倍，即为100μg/mL标准液。
4摄氏度保存备用。
3提取液：50mmol/L磷酸盐缓冲液（KPP）pH7.8：称取7.6gK2HPO4和0.89gKH2PO4蒸馏水溶解，定容至1L，调pH至7.8。
50mmol/LKPP（pH7.8）内含1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）四、操作步骤（一）标准曲线的制作3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
(注意应在一小时内完成比色)4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定1、样品的提取：称取植物材料0.2g左右于预冷的研钵中，加入2mL预冷的提取液，研成匀浆，转至10mL离心管中，用提取液冲洗研钵2次（每次1mL），转至离心管中，总体系4mL，此即为蛋白质提取液。
蛋白质标准曲线的制作(马斯亮蓝法)
蛋白质标准曲线的制作（马斯亮蓝法）2010-03-27 14:21:26 来源：易生物实验浏览次数：925 网友评论0 条学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
关键词：马斯亮蓝蛋白质标准曲线蛋白质标准曲线马斯亮蓝法CoomassieBrilliantBlue一、实验目的和内容目的: 学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法内容：制作测定蛋白质浓度的标准曲线。
制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G －250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm吸光度可测定蛋白质的含量。
另外，反应体系中呈现的颜色变化主要是G-250分子间疏水相互作用形成的聚集体聚集程度不同引起的。
单体形式表现为蓝色，单体和聚集体共存时表现为绿色，全为聚集体形式呈现为棕红色。
影响因素主要为溶液体系中磷酸、乙醇、NaCl的含量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/mL时就有0.2 75光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验步骤
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验步骤下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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(完整word版)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。
注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。
当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。
在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。
一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量
考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量实验目的：学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。
实验原理：考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
材料、主要仪器和试剂1．实验材料新鲜绿豆芽2．主要仪器（1）分析天平、台式天平（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计3．试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
（3）乙醇（4）磷酸（85％）四、操作步骤1．标准曲线制作（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。
盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)一、目的考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue) G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，由Bradford于1976年建立，具有简便快捷，灵敏度高，稳定性好等特点，是一种较好的蛋白质定量测定常用方法。
通过本实验学习应用该法测定蛋白质含量的原理，复习分光光度计的使用及标准曲线的绘制等基本实验技能。
二、原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离态呈红色，与蛋白质结合后转变为青色。
在0~1000μg 范围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与蛋白质含量正相关，可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1．仪器设备：(具塞刻度)试管吸管分光光度计2．试剂(1) 标准蛋白质溶液称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 1 mg/ml溶液。
(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入85% (m/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000 ml (此溶液在常温下可放置一个月)。
(3) 样品蛋白液(10~100 μg/ml)四、操作步骤1标准蛋白质含量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定取2支(具塞)试管，分别准确加入0.l ml样品蛋白液，再各加5 ml考马斯亮蓝G-50试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线0号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
五、结果处理根据所测样品提取液的平均吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg/ml)六、思考题1．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？2．如何正确使用分光光度计？。
实验三-考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
思考题
（1）试比较该法与其他几种常用蛋白质定量测定 方法的有缺点。
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实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
一.目的:掌握考马斯亮蓝G－250染色法测定蛋 理和操作.
二.原理 三.仪器与用具 四.实验试剂 五.实验操作 六 实验报告
白质的原
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二.原理:
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含 量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色， 最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色 素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量 成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
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五.实验操作
1
(蛋白质含量为0～100μg／ mL)的绘制
牛血清蛋白溶液:浓度为100 μ g／ mL,按照表格配制
混合数次，放置5Min后，用1CM光径比色杯在595nM下比色。以蛋
白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
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2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
吸取样品提取液1.0 ml( why?) ，放入 试管中 ，加入
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三.仪器与用具
721分光光度计；10 mL量筒1个；研钵；烧杯；量 瓶；移液管：1 mL 3支，0 1 mL 3支；10 mL具塞 刻度试管14支。
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四.实验试剂
标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质 50溶液：称取100μg考马斯亮蓝G250，溶于50 mL 90％乙醇中，加入85％的磷酸 100 mL ，最后用蒸馏水定容到1000 mL ，贮放在 棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。
考马斯亮蓝法(Bradford法)
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质浓度一、实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
bradford法的突出优点是：1. 灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。
2. 测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。
3. 干扰物质少。
如干扰lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法此法的缺点是：1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和0.1n的naoh。
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标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量
一、标准曲线
一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法
1、凯氏定氮法
2、双缩脲法
3、Folin-酚试剂法
4、紫外吸收法
5、考马斯亮蓝法
三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
（一）、试剂：
1、考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：
1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作：
1、
2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、
40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6
一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：
1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。
药品的配制（磷酸缓冲液的配制）
一、药品的配制步骤
（一）、实验准备：
1、准备所需的药品和玻璃仪器。
2、洗涤。
（怎样洗涤算干净？）
（二）、计算：
1、百分比浓度计算：
1)、G/V比
例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。
2）、V/V比：
例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X, X=75ml。
取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。
乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。
3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。
2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。
1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。
M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G（g）/摩尔质量2）、0.1mMNaCl配100ml
mM=毫摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g
毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量
3）、0.1uNaCl配100ml
mM=微摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg
微摩尔数=G（ug）/摩尔质量称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug
3、混合溶液配制的计算：
如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。
注意：1、分别标定体积计算
2、分别配制再混合，但总体积不能为100ml
（三）、标量：
1、根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器，如量筒或移液
管。
2、电子分析天平的使用。
（四）、溶解：
1、根据药品配置要求选择溶剂。
蒸馏水，双蒸水，无离子水等。
2、只能用烧杯溶解。
注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤
烧杯三次左右，直到洗涤干净。
小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）。
如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解，但pH应在被要求的范围内。
3、加热促进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好。
如:
配0.1%的淀粉，水裕加热（温度在80-90。
C），过量会糊化。
（五）、定容：
1、用容量瓶定容；
2、用玻璃棒引流或用小漏斗；
3、用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。
要求刻度与液体凹面相切
为止（眼睛可视）；
4、上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可。
(注意不再定容了，防止溶液漏掉。
) （六）、装入试剂瓶，贴上标签。
标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等。
（七）、清理实验场所。
二、磷酸缓冲液的配制。
（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液。
用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液。
选用药品：Na2HPO4·12H2O（碱）和NaH2PO4·12H2O（酸）配缓冲液100ml。
书中说明。
（二）、计算：
1、注：书中有注明配置的量。
2、计算：Na2HPO4·12H2O称取71.64×0.1=7.164g
NaH2PO4·12H2O称取31.21×0.1=3.121g
3、含有不同结晶水的换算。
书中配1/15mol/L的缓冲液配1L，书中用Na2HPO4·2H2O需要11.87g/L但用Na2HPO4·12H2O需多少g？
11.87=（178/358）×X，X=23.87g。
（三）、分别配制缓冲液各100ml（根据需要确定配制的量）。
即：0.2M Na2HPO4·2H2O和NaH2PO4·2H2O100ml。
（四）、按书中的量配制取量再混合。
如：pH=6.8，分别去缓冲对49ml和51ml。
（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值，检测配置是否准确。
（六）如配50mM pH =6.8的缓冲液100ml ，以你配制的母液稀释即可。
计算：50×0.1=0.2×1000×X （L）；X =0.025L；
取0.2M pH=7.2的缓冲液25ml，用蒸馏水定容至100ml即可。