病毒纯化浓缩方法
病毒纯化
现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于化学研究或制备抗体。
在这里我们简明地描述一下脊髓灰质炎病毒（Polio virus）的纯化步骤。
它是一种已被广泛研究的危害人体健康的病毒。
在开展人体病毒实验工作以前，让实验工作人员获得抵抗这种病毒的免疫力是非常必要的。
脊髓灰质炎病毒疫苗很容易获得，大多数工作人员可能已经获得免疫，但重新免疫是必要的预防措施。
病毒的纯化步骤主要是：1.在大规模的装置中培养病毒；2.去除富含病毒培养液；3.通过沉淀将病毒浓缩；4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
现在我们讲解每个步骤的一些细节。
1.在大型装置中培养细菌。
为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。
每种病毒的培养都有不同的步骤。
脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以培养在一大瓶中沿壁生长的单层细胞上，也可以在一个轻轻搅拌的细胞悬液中。
在有利病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000的感染单位的病毒，即每毫升一个感染单位的滴度（或称效价）。
2.富含病毒培养液的去除。
病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。
在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。
为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—融化的循环过程使细胞进一步破碎。
然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心试管中。
低速离心除去大分子的细胞残骸。
3.通过沉淀将病毒物质浓缩。
由于病毒是蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。
脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。
这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。
由于病毒蛋白沉降，溶液将变得浑浊。
将沉淀物通过低速离心（2000g，1-2hr）。
然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。
这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99％以上的病毒粒子可沉淀回收。
4.通过密度梯度离心最终纯化病毒。
脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CSCl的密度梯度离心纯化。
病毒的超速离心纯化
病毒的超速离心纯化实验目的超速离心法纯化A型禽流感病毒。
实验原理不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
此法的优点是：（1）分离效果好，可一次获得较纯颗粒；（2）适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；（3）颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
实验设备和材料专用的超离管、蔗糖配置管，长注射器（以上器材用酒精浸泡过夜，烘干待用）操作步骤蔗糖密度梯度的配制：用已高压的去离子水配制不同浓度的蔗糖，并用22 um滤器过滤。
蔗糖梯度柱长度一般为12 cm，每个梯度蔗糖层长约3 cm即蔗糖溶液体积为3 mL左右，病毒粒子停留的蔗糖密度层应该适当的增大，每个梯度蔗糖所配总体积为20 mL，不需要100 mL。
30%蔗糖溶液配制：去离子水中加入30 g蔗糖，定容到100 mL即可。
1. 病毒的增殖使用SPF鸡胚接毒，共收集150 mL左右病毒尿囊液。
具体如下：取37 ℃培养的9～11日龄SPF鸡胚15个左右。
向各尿囊腔中接种0.2mL储存的AIV（接种病毒液是否需要稀释，应根据病毒毒力的强弱以及实验需求而定。
此法是为增殖病毒，假若接种强毒，则需要根据毒力稀释相应倍数，以便能增殖更多病毒，于37 ℃下继续孵育，每隔12 h照胚一次，弃掉24 h内死亡鸡胚。
24 h后的死胚放4℃过夜，HA 效价7孔，收集尿囊液，直到96 h后收获剩下鸡胚尿囊液，不同时段收集的尿囊液可混合在一起，暂时存放可放-20℃，长时间存放则放于-40℃或-80℃。
2. 取反复冻融后的病毒液10 mL，在10000 r/min、4℃下离心30min，留上清，并测上清HA。
3. 超离：把已经离心处理好的病毒尿囊液装入超离管（实验室超离管体积为30 mL），超离管内不能有气泡，以免超离过程爆破。
离心转速根据病毒粒子直径而定，新城疫病毒尿囊液以40000 r/min 4℃下离心5 h。
病毒纯化密度梯度离心法
病毒纯化，即应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。
病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质－DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。
病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定依据。
物理均一性：测定病毒样品的物理均一性，是证明其纯度的常用方法，包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。
病毒滴度与蛋白含量的比例：测定病毒材料的感染力或其血清学反应、滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。
病毒滴度对蛋白含量的比例越高，说明病毒的纯度越高。
免疫学反应：免疫反应单一而无非特意反应，则说明病毒材料比较纯净。
结晶形成：病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。
病毒纯化方法:1 超速离心法，其中的平衡梯度密度离心是常用的方法，在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。
因为病毒颗粒跟其他生物分子大小不一样，所以病毒在梯度离心过程中形成独特的条带，从而达到分离纯化的效果。
但此法对仪器的要求很高，转速至少30000rpm/min，在这个转速下要求离心时间7-8小时。
2 现在开发出各种亲和树脂，能有效地吸附病毒粒子，从而达到病毒纯化的目的。
Biomiga公司所开发的病毒纯化系列试剂盒，采用新型材料，能有效吸附腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等，加入适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收，最后对病毒进行脱盐处理，所得病毒纯度高，整个操作简便，极大地缩短了纯化时间，针对需要纯化大量病毒的客户提供大量提取试剂盒，满足客户不同需要。
密度梯度离心法英文名称： density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。
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本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==peg8000浓缩病毒原理篇一：慢病毒浓缩方法一超速离心沉淀法1. 取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。
2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。
3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。
5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。
6. 4℃，25，000 rpm. (82，700g) 离心2小时。
7. 小心将管子从转头中取出。
倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。
吸掉剩余的液滴。
在管底应当有可见的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。
9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
10. 在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
11. 4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。
13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。
方法二 PEG-8000浓缩法1. 5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMANOPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000X g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm最大离心力为89000X g；超速离心管(Beckman 344058), Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤(1)转染后44-48 小时，收集上清液到50ml 离心管内，并加入20ml Production培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4C, 4000g 离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45卩m滤膜过滤到40ml超速离心管中。
(2)取6个Beckman超速离心管，70聽醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
(3)每个Ultra-clear SW28I加入30ml预先处理过滤过的病毒上清。
(4)取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%勺蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3 管进行同样处理。
(5)务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
(6)4C离心，25000rpm (82700g) 2 h。
(7)离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip 头吸去管壁上多余的液体。
(8)每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
(9)将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
(10)在4C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
(11)4C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
(12)用200卩l移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
慢病毒纯化
慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。
这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。
2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。
3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。
然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。
4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。
可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。
5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。
这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。
6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。
使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。
7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。
在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。
每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。
病毒纯化浓缩方法
病毒纯化浓缩方法方法一超速离心沉淀法1 仪器超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管2 方法步骤（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
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病毒纯化浓缩方法
方法一超速离心沉淀法
1 仪器
超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP) 50000~80000rpm相对离心力最大可达510000×g；高速冷冻离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm 最大离心力为89000×g；超速离心管 (Beckman 344058)，Ultra-clear SW28离心管
2 方法步骤
（1）转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production 培养基以便第二轮病毒的收集。
将收集的上清液4℃，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤到40ml超速离心管中。
（2）取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。
（3）每个Ultra-clear SW28管加入30ml 预先处理过滤过的病毒上清。
（4）取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液(PBS配制)。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml，形成一个蔗糖垫。
同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。
（5）务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。
（6）4℃离心，25000rpm （82700g）2 h。
（7）离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。
管底可见少量的半透明或白色沉淀。
将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。
（8）每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。
（9）将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。
（10）在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
（11）4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
（12）用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保存于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃冻存。
方法二 PEG-8000浓缩法
(1)5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q 纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。
(2)使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；
(3)每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000+NaCl母液7.5 ml；
(4)每20～30min混合一次，共进行3-5次；
(5)4度放置过夜；
(6)4度，4000 g，离心 20min；
(7)吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
(8)加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
(9)集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃
方法三慢病毒纯化浓缩试剂盒
1.每10ml过滤后的病毒初始液，加入Concen Solution 3ml，每20-30min混合一次，共进行3-5次。
2.2. 4℃放置过夜。
3. 4℃，3000 g，离心45min。
4. 去掉上清，静置管子1-2min，吸走残余液体。
5. 加入无血清DEME充分溶解慢病毒沉淀。
6. 病毒悬液分装成200μl每份,保存在离心管中，速冻后储存在-80 ℃。
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